Charles H. Hood Vakfı Genç Araştırmacı Çocuk Sağlığı Araştırma Ödülü (Boston, MA) - Bu çalışma, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (R21 HD059015 NICHD) Üreme Şubesi tarafından kısmen finanse edildi.

1. Site-directed mutagenesis yüksek GC-zengin KISS1R gen sekansı <ol><li> Şablon: N-terminus&#39;a erimiş bir Myc etiketi ile insan KISS1R tam cDNA dizisi. Bu dizi daha sonra transfections için kullanılan memeli hücre hatları ile uyumlu pCS2 + ifade vektörü, klonlanmış. Bu ifade, vektör pCS2 + Myc KISS1R gibi burada denir. </li><li> Primer tasarımı: primerler Quikchange Site Yönetmen Mutagenez kiti (Stratagene) talimatlarına göre, istenen mutasyonlar taşımak için tasarlanmıştır. Özet olarak: <ul><li> Her ikisi de (ileri ve geri) primerler istenilen mutasyon içerir ve plazmid ters ipliklerini aynı sıra tavlama gerekir (örneğin, ileri ve ters primerler birbirini tamamlayıcı) <img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="Adım 1" /></li><li> Astarlar, bir ya da daha fazla C veya G üsleri 25 ila 45 üsleri uzun ve bitiş olmalıdır <img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="Adım 2" /> <img src="files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="Adım 3" /></li><li> Tanıtılan mutasyon (lar) astar ortasında olması ve her iki tarafta ~ 10-15 üsleri doğru sırası ile çevrili </li><li> Astar Erime sıcaklığı (Tm) eşit veya 78 ° C daha fazla olmalıdır Tm tahmin etmek için aşağıdaki formülleri kullanın: <ul><li> Mutasyonlar tanıtarak zaman: Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N -% uyumsuzluğu (N üsleri astar uzunluğunu) </li><li> Eklemeleri veya silmeleri tanıtan zaman: Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N (N eklenen veya silinmiş üsler dahil değildir) </li><li> Desalted primerler (başka saflaştırılması gerekli) kullanın. <img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="Adım 4" /></li></ul></li></ul></li><li> Iyi amplifikasyon koşullarına ek PCRx Enhancer çözümü (Invitrogen) ve DMSO içerir. % 4 ve% 8 olarak DMSO en az 2 konsantrasyonları, test edilmelidir. PCR koşulları ve pCS2 + MycKISS1R bir temsilcisi PCR sonuçları Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi; I ve Şekil 1&#39;de Tablo gösterilmiştir. </li><li> 37 1s 30dk DpnI metillenmiş DNA sindirimi ebeveyn DNA amplifikasyon ürünleri ortadan kaldırılması ° C: PCR ürünü bir santrifüj tüpüne 17.5μl 10x NEBuffer 2μl 4 ve DpnI, 0.5μl (10U, New England Biolabs) ile karıştırın. </li><li> XL10-Altın Ultracompetent E. 45μl DpnI ile tedavi edilen DNA karışımı 2μl Dönüşümü PCR ürünü DpnI tedavi 15 ml hücre kültürü tüp önceden soğutulmuş coli (Stratagene). Β-mercaptoethanol 2μl ekle ve Stratagene yönergeleri izleyin. Tabak 37 100μg/ml ampisilin ve inkübe içeren LB-agar plaklarına dönüştürülmüş bakteri 100-400μl ° C </li><li> Miniprep 2 ila 4 ayrı koloniler plazmid DNA izole etmek. Istenilen mutasyonlar, izole edilmiş DNA diziliminin belirlenmesi ve analizi ile başarılı bir giriş onaylayın. </li></ol> 2. HEK-293 hücre içine MycKISS1R geçici transfeksiyon <ol><li> Aşağıdaki deneyler 37 CO 2 inkübatör (% 5 CO 2) kültüre insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-293) yapılmaktadır ° C DMEM% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş. </li><li> Tohum HEK-293 6-kuyucuğu 2.5x10 5 hücre / ml hücreleri ve onları 37 gecede büyümesine izin ° C transfeksiyon önce. NOT: (i) her deneysel durum için üç nüsha kuyuları, (ii) transfeksiyon zaman ideal hücre izdiham 30% -50%. </li><li> Transfect HEK-293 üreticinin talimatlarına göre GenePorter Transfeksiyon Reaktif (Genlantis) kullanarak hücrelerin, serum serbest DMEM Mix yarım 0.5μg pCS2 + MycKISS1R artı 0.5μg kontrolü (boş) DNA / iyi 1μg toplamını vektör. Transfekte DNA mikrogram ortalama 10μl transfeksiyon reaktifi ile diğer yarısını karıştırın. NOT: İdeal plazmid DNA konsantrasyonu değişebilir. </li></ol> 3. Hücre tedavisi ve lizis <ol><li> Transfeksiyon 24 saat sonra, 1 ml DMEM% 2.5 FBS (hücre metabolizmasını azaltmak için) içeren hücre orta yerine. NOT: Bu azalma serum kolaylaştırmak ve / veya sonuçlarını algılama yükseltmek olabilir. </li><li> Doğrudan bir bütün 6 plaka her kuyuya lizozom inhibitörü (100μg / iyi Leupeptin) ekleyin. ° C 6 veya 16 saat boyunca (veya diğer istenen kez) 37 inkübe </li><li> Doğrudan iki bütün 6 kuyucuğu tüm kuyulara taze hazırlanan proteazom inhibitörü (10μM / iyi MG132 ile) ekleyin. 37 ° C 2, 4, 6 veya 16 saat (veya istenilen kez) inkübe edin. Dördüncü 6-plaka (0 zaman noktası) tüm kuyulara araç ve 37 inkübe ° C 16h için </li><li> Inkübasyon bittiğinde, buz plakaları hareket ve protein parçalanmasını önlemek için buz üzerinde tüm bu parçalama yordamı gerçekleştirmek: <ul><li> Protein verimi artırmak için, tek bir centr 6-kuyucuğu triplicates birleştirmekifuge tüp </li><li> 1ml buz fosfat ile bir kez orta ve yıkama hücreleri aspire tamponlu salin (PBS) </li><li> Proteaz inhibitörleri içeren (100 mM AEBSF-HCI, 80μM aprotinin, 5mM bestatin, 1x kokteyl içeren buz lizis tamponu (20mm Hepes, pH 7.4,% 1 NP-40, 150 NaCl, 1mm EDTA,% 0,25 sodyum deoksikolatın) 100μl ekle iyi 1.5mm E-64, 0,5 M EDTA, 2mm leupeptin ve 1mm pepstatin A, artı 2mm PMSF) </li><li> Bir hücre kazıyıcı ve transfer hücre çıkarın hücreleri tüpler santrifüj lizatları </li><li> 20-gauge iğne ile hücre ~ 10 defa geçirin. NOT: membran proteinlerinin western blot tespiti için tasarlanmış örnekler sonikasyon etmeyin. Sonikasyon agregasyon membran proteinlerinin elektroforez sırasında doğru göç olmaz yol açar </li><li> Sallanan bir platform üzerinde, 4 ° C&#39;de 1s hücre lizatları inkübe </li><li> Santrifüj hücre lizatları 4 ° C de 10 dakika 10.000 x rpm ve yeni tüpler transfer süpernatantlar. NOT: Bu adım sırasında pelet Rahatsız etmeyin </li><li> BCA yöntemi kullanılarak süpernatantlar 10μl protein konsantrasyonu (Pierce) belirleyin </li><li> Proteaz inhibitörleri içeren lizis tamponu ile 1mg/ml lizatları seyreltilir. </li></ul></li></ol> 4. MycKISS1R, Immunoprecipitation ve Western Blot algılama <ol><li> Buz üzerinde aşağıdaki immunoprecipitation (ya da 4 ° C) adımları uygulayın: <ul><li> Agaroz-konjuge anti-myc antikor (2.5μg / numune) uygun miktarda buz PBS ile iki kez yıkayın ve lizat protein 400μg için ekleyin. </li><li> Lizatları üzerinde MycKISS1R Immunoprecipitate geceleme 4 ° C yavaşça sallanarak sallanan platform. </li><li> 4 darbe santrifüj agaroz boncuk Spin ° C (x rpm 10.000 &#39;e kadar) </li><li> Süpernatantlar (pelet rahatsız olmadan) ve atın aspire </li><li> Boncuklar, buz gibi soğuk lizis tamponu ve buz gibi iki kez PBS ile bir kez yıkayın. Iplik önce hafifçe tüpler haricindekileri </li><li> 2x örnek yükleme tamponu% 10 β-mercaptoethanol içeren antikor bağlı MycKISS1R içeren Ressuspend boncuk. </li></ul></li><li> Western Blot MycKISS1R immün: <ul><li> 30 dakika 37 ° ° C NOT Isı örnekleri: membran proteinlerinin western blot algılama yönelik örnekleri kaynatın. Sonication gibi, kaynama, ayrıca bu proteinlerin birleşimi yol açar </li><li> 5 dakika buz içine hemen tüpler Taşı </li><li> Ayrı proteinleri SDS-PAGE ile% 4-15 gradient jel. </li><li> Bio-Rad Yarı-Kuru Transfer Transfer tamponunda 30 dakika (48mm Tris tabanı, 39mm glisin, 1.2mm SDS,% 20 metanol, pH 9.2) için 25V Immobilon-FL PVDF membran (kızıl ötesi tespiti için) transfer cihaz </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika membranlar yıkayın Tris-Tamponlu Salin (TBS) ve sallanan platform (alternatif olarak, TBS% 5 süt non-spesifik bağlama engellemek için kullanılabilir) engelleme Licor Odyssey ile oda sıcaklığında için blok 1s. </li><li> 4 gece boyunca inkübe membranlar ° C% 0.1 Tween-20 içeren engelleme çözümü tavşan anti-myc antikor (1:500) </li><li> Primer antikor çıkarın ve her TBS ile% 0.1 Tween-20 (TBST) içeren 5 dakika membranlar 3 kere yıkayın </li><li> 1s için membranlar% 0.1 Tween-20 ve% 0,01 SDS içeren tampon engelleme keçi Infra-RedDye ® 800CW etiketli anti-tavşan IgG (1:10,000) oda sıcaklığında inkübe </li><li> Sekonder antikoru çıkarın, (Tween-20 Kalan kaldırmak için), sadece TBS ile TBST ve son bir kez her 5 dk membranlar 3 kere yıkayın </li></ul></li><li> Görüntüleme ve LI-COR Odyssey Infra-Red Imager kullanarak MycKISS1R ölçümü: <ul><li> Membranlar MycKISS1R LI-COR Odyssey Infra-Red Imager kullanarak görüntülü olacaktır. Başlamak için, ızgara ile hizalayarak, Odyssey tarayıcının sol alt köşesinde membran yerleştirmek. Kauçuk paspas ile kaplayın, rulo ile baloncuklar pürüzsüz ve kapağını kapatın </li><li> Bilgisayarda yeni bir proje dosyası oluşturun. Dosya adı, &quot;done&quot; tıklatın ve sonra &quot;tarama&quot; tarayıcı giriş girin. Boyutu tarayıcı konsol membran sığdırmak için kutusuna ve sonra 169μm çözünürlük ve orta görüntü kalitesini seçin </li><li> Yoğunluğu, her bir sinyalin beklenen gücüne göre 700 (kırmızı) ve 800 (yeşil) kanallar için ayarları seçin. Bu sadece sinyal görselleştirme amaçlı ve miktar etkisi olmaz. &quot;Taramayı başlatmak&quot; </li><li> Ad tarama ve kaydetmek, daha sonra ölçümü için yeni bir pencere açmak için &quot;Tamam&quot; a tıklayın. MycKISS1R monomerlerin yaklaşık 43kD görünür olmalı </li><li> &quot;Kutu&quot; aracı (sol kenar çubuğundan) kullanarak, ilk grubu çevresinde bir kutu çizin. Tüm bantlar üzerinde &quot;kopya&quot; ve &quot;yapıştır&quot; kutusunu, sonra tüm bantları uyum emin olmak için etrafında kutusuna sürükleyin </li><li> Kullanan tüm kutuları seçin &quot;Ctrl + A&quot; ve sonra medyan arka plan çıkarmak için seçeneği seçin. Üst menü çubuğunda &quot;raporu&quot; ve miktarının değerleri olan bir tablo belirecektir tıklayın. Burada gösterilen Temsilcisi sonuçları huk.(zaman sıfır) tedavi edilmeyen hücreleri üzerinde kat artırmak gibi nted </li></ul></li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <ol><li> GC-zengin KISS1R gen sekansı Site-directed mutagenesis: Tablo 1. KISS1R amplifikasyon verimliliğini artırmak için reaktifler kombinasyonu gösterir. Bu kombinasyon KISS1R cDNA dizisi farklı bölgelerinde yöneltilen birkaç mutasyonların yanı sıra bu son derece GC-zengin gen amplifikasyonu için başarıyla tanıtmak amacıyla kullanılmıştır. Şekil 1 KISS1R mutagenez için bisiklet ve amplifikasyon koşulları gösterir. Bu koşullar QuikChange Site Yönetmen Mutagenez kiti (Stratagene) değiştirilmiştir. Şekil 2, bu optimize protokolünü kullanarak temsili bir sonuç göstermektedir . Ayrıca% 4 veya% 8 PCRx Enhancer ile birlikte DMSO, GC-zengin KISS1R cDNA içeren plazmid amplifikasyon verimi önemli ölçüde artırır. Bu temsili bir deneyde,% 4 DMSO 8% DMSO göre biraz daha iyi amplifikasyon şartları sağladı. Ultracompetent E. DpnI ile tedavi edilen amplifikasyon ürünleri Dönüşüm coli tipik olarak 1.000 &#39;den fazla koloni 100 verimleri ve DNA dizi belirlenen istenilen mutasyonlar başarılı bir giriş oranı% 80-90. </li><li> Reseptör fizyolojisi MycKISS1R yapıları incelemek için kullanın: Bu temsili bir deneyde, vahşi tip pCS2 + MycKISS1R optimize protokol burada açıklanan geçici MycKISS1R ifade ilgili bir hücre hattı in vivo KISS1 reseptör bozulması (HEK-293) çalışma için kullanılır göre amplifiye. Yöntemleri açıklanan protokole göre lizozom (leupeptin) veya proteazom (MG132) inhibitörleri ile transfekte HEK-293 hücre tedavisinde sonra, hücreler parçalanmış ve western blot için işlenmiş. Şekil 3 üst panelde alt panel, üst panelde gösterilen bantları miktarının gösterir iken MycKISS1R monomerlerin tarama gösterir. Bantların Niceleme leupeptin tedavi 6h ne 16h ne MycKISS1R protein düzeyleri etkilediğini gösterir. Tersine, tedavisi MG132, MG132 ile inkübasyon 16h sonra reseptör 45 kat birikimi ile doruğa bu hücreler, zamana bağımlı bir MycKISS1R protein artış, sonuçlandı. Bu gözlemler, en fazla G-protein reseptörler aksine, KISS1R proteazom (lizozoma yerine) tarafından bozulmuş, göstermektedir. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td> DMSO </td><td></td></tr><tr><td> Reaktifler </td><td> 0 </td><td> % 4 </td><td> % 8 </td></tr><tr><td> Su </td><td> 35 </td><td> 33 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> 10x Pfu Ultra Taq tampon </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10mM) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer anlamda (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer antisens (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Çözüm </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Pfu Ultra Taq polimeraz (2.5U/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> plazmid DNA (20ng/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 1 GC-zengin KISS1R, başarılı bir şekilde mutasyona ve yükseltmek için kullanılan reaktifler kombinasyonu <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. GC-zengin KISS1R başarılı mutagenez ve amplifikasyon Bisiklete binme koşulları: 2min sıcak başlangıç ​​95 18 30 sn erime döngüleri izledi ° C; 1 dakika 55 68 ° C ve 6 dakika uzatma tavlama ° C 68 ek bir 10 dakika uzatma ° C son döngüsünün sonuna eklenir. Bu ayarlar QuikChange II XL-Site-Yönlendirilmiş Mutagenez kiti (Stratagene) orijinal mutagenez protokol ayarlandı. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. GC-zengin pCS2 DMSO varlığı ya da yokluğu da güçlendiğini + Myc KISS1R Görselleştirme: 0 varlığı amplifiye pCS2 Beş ul alikotları + Myc KISS1R,% 4 veya 8 DMSO ethidium ile boyanmış bu temsili% 1 agaroz jel yüklenen bromür ve görüntülenmiştir kullanarak UV ışık. 6KB plazmid bantları PCR% 4 varlığı amplifiye ürünler ve% 8 DMSO yüklü iki şerit üzerinde görünür, ama ilk şeritli değil, bir PCR ile yüklenenDMSO yokluğunda abartılıyor. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Myc KISS1R HEK-293 hücrelerinde protein düzeyleri leupeptin veya MG132 Etkisi: Myc KISS1R ifade HEK-293 hücre 37 100μg/ml leupeptin veya 10μM MG132 ile tedavi edildi ° C kez. Hücre lizat 400μg Myc KISS1R agaroz-konjuge anti-myc antikor 2.5μg ile immunoprecipitated ve western blot ile analiz edildi. (A) (B) Myc KISS1R bantları Kantitasyonu gösterilmiştir; IRDye 800CW etiketli anti-tavşan ile inkübasyon tavşan anti-Myc etiketi antikor Myc KISS1R immunoblots, inkübasyon sonra (A) LI-COR Odyssey algılama LI-COR Odyssey kantifikasyon yazılım. Tedavi edilmezse hücreleri (zaman 0) üzerinde kat artış Sonuçlar temsil edilmektedir.

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+Directly+Stimulates+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Release+via+G+Protein-Coupled+Receptor+54.">Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).</li><li>Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty.">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li><li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54.">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li><li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence.">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li><li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction.">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li><li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).</li><li>Hall, R. A., George, S. R., O'Dowd, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).</li><li>Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Involvement+in+Agonist-Induced+Down-Regulation+of+Mu+and+Delta+Opioid+Receptors.">Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors.</a> J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).</li><li>Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Site-directed mutagenesis üzerinden üç yıl için hedef genlerin kodlama sırası nükleotid değişiklik protein fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Orijinal teknik, İngiliz, Kanadalı Kimyager ve Nobel ödülü sahibi Michael Smith 10 tarafından 1978 yılında tarif edilmiştir. Michael Smith Kary Mullis, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 11 icat eden Amerikalı biyokimyacı, 1993 Nobel Kimya Ödülü paylaştı. Yıllar boyunca Michael Smith tarafından açıklanan orijinal yö...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Çözüm </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra high-fidelity DNA Polimeraz Alternatif Deterjan </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Altın Ultracompetent E. coli hücrelerinde </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Transfeksiyon Reaktif </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF </td><td> Santa Cruz Biyoteknoloji </td><td> SC-24.948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Testi Kiti </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc tag (klon 4A6) agaroz konjuge </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x yükleme tamponu </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Kriter Tris-HCl prekast jel,% 4-15 oranında degrade </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL PVDF membran </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Odyssey Engelleme Tampon </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Tavşan anti-myc antikor </td><td> Hücre sinyal </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Keçi anti-tavşan IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Odyssey Görüntüleme Kızılötesi Sistemi </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Halt Proteaz İnhibitör Kokteyl (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

Kisspeptin reseptör (KISS1R), ergenlik tetik ve yetişkinlik 1,2,3 üreme yetki düzenleyicisi olarak tanınan bir G-protein kenetli reseptör . Hastalarda tespit KISS1R iodiopathic hipogonadotropik hipogonadizm (İHH) 1,2 ve erken ergenlik 4 inaktivasyon mutasyonları ile ilişkili bulunmuştur. Bu mutant Fonksiyonel çalışmalar yanı sıra, bu reseptörün üreme yönetmelik altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir hastalığın sonuçlarının şekillenmesinde bu anormal KISS1R sinyalizasyon ve işlevi sonucudur . Ancak, yüksek GC-zengin KISS1R gen dizisi oldukça zor mutasyonlar tanıtmak veya PCR ile bu reseptör kodlayan gen yükseltmek için yapar. Burada, bu son derece GC-zengin sıra laboratuvarda bir düzine KISS1R mutantlar oluşturmak için başarıyla kullanılmaktadır ilgi mutasyonlar tanıtmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz değiştirmelerin, silme veya KISS1R sırayla eklemeler KISS1R mutant bir dizi amplifikasyon kolaylaştırmak için PCR koşulları optimize etmiş. Ayrıca, PCR arttırıcı çözüm yanı DMSO küçük bir yüzdesi olarak amplifikasyon geliştirmek için özellikle yararlıdır. Bu optimize yordam yanı sıra diğer GC-zengin şablonları için yararlı olabilir. KISS1R kodlama ifade vektör mutasyonlar KISS1R işlevini değiştirmek ve ilişkili üreme fenotipleri yol nasıl anlamak için bu reseptör sinyalizasyonu ve fonksiyon karakterize etmek için kullanılmaktadır. Buna göre, site directed mutagenesis tarafından oluşturulan KISS1R mutantlar potansiyel uygulamaları, birçok çalışmada 1,4,5,6,7,8 gösterilmiştir . Örnek olarak, erken ergenlik ile ilgili KISS1R (Arg386Pro), kazanç fonksiyon-mutasyon KISS1R 9 bozulması oranı değiştirmek için reseptör ligand stimülasyon 4 gibi yanıt uzatmak gösterilmiştir . İlginçtir ki, çalışmalar en fazla G-protein reseptörler 9 açıklanan klasik lizozomal bozulması karşı KISS1R proteazom tarafından bozulmuş olduğunu göstermektedir. Burada sunulan örnekte, KISS1R bozulması, geçici Myc etiketli KISS1R (MycKISS1R) ifade İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri (HEK-293) incelenmiştir ve proteazom veya lizozom inhibitörleri ile tedavi. Hücre lizatları western blot analizi ile bir agaroz-konjuge anti-myc antikor kullanarak immunoprecipitated. Algılama ve leke üzerinde MycKISS1R ölçümü LI-COR Odyssey Kızılötesi Sistemi kullanılarak yapılır. Bu yaklaşım, çalışmanın yanı sıra diğer ilgi proteinlerin bozulması yararlı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders at JoVE.com

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Kisspeptin reseptör (KISS1R) Mutasyonlar hastalarda üreme bozuklukları ile ilişkilidir. Burada ilgi KISS1R GC-zengin dizisi de immunoprecipitation ve western blot reseptör bozulması yolu karakterize KISS1R yapıları kullanımı gibi mutasyonlar nasıl tanıtmak için açıklar.

Üreme Bozuklukları ile İnsanlardaki Belirlenen GC-zengin KISS1 Reseptör sırası genetik mutasyonlar Mutagenez ve Analiz

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

mutagenesis-analysis-genetic-mutations-gc-rich-kiss1-receptor

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Görüntüleme.  University of Miami Miller School of Medicine. Kisspeptin reseptör (KISS1R) Mutasyonlar hastalarda üreme bozuklukları ile ilişkilidir. Burada ilgi KISS1R GC-zengin dizisi de immunoprecipitation ve western blot reseptör bozulması yolu karakterize KISS1R yapıları kullanımı gibi mutasyonlar nasıl tanıtmak için açıklar.

Video: Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...