This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.

Alle Protokolle mit Tierhaltung, Wartung und Handhabung wurden von Health Canada die Tierpflegekommission genehmigt. 1. Tier Exposures <ol><li> Zufällig verteilen transgenen männlichen Mäusen (8-12 Wochen alt) zu Gruppen und Behandlungsgruppen (min = 5 pro Gruppe) .Treat Mäuse mit Testverbindung und entsprechende Kontroll durch eine entsprechende Expositionspfad für das ausgewählte Administrationszeit steuern. Wählen Sie die entsprechende Probenahmezeit entsprechend der Spermatogenese Zelltyp von Interesse (Abbildung 3). </li><li> Nach der Stichprobenzeit, einschläfern Mäuse durch Genickbruch unter Isofluran Anästhesie (oder andere geeignete Methode). Die Hoden vorsichtig ziehen von einem Einschnitt in den Bauch oder Hodensack und der Verbrauch der Cauda Nebenhoden. (Abbildung 4, zu sehen eine detaillierte Video von Nebenhoden Sammlung zu sehen Duselis et al. 24). Alternativ sammeln die Hoden, wenn die Analyse SamenkanälchenS-Zellen. Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C für die spätere Verwendung. </li></ol> 2. Isolierung und Verdauung von Cauda Sperma <ol><li> Auftauen Cauda Nebenhoden auf Eis. Die aufgetauten Cauda in eine Petrischale und gründlich mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge Blatt vor den Mund. </li><li> Hinzufügen 700 ul Raumtemperatur D-PBS in die Petrischale. Mit einem Weit Bohrung 1000 ul Pipettenspitze, Freigabe Spermien aus der Cauda durch Ziehen und Loslassen der Aussetzung, bis die D-PBS wird trüb mit Sperma (ca. 10 mal). HINWEIS: Um weiter Bohrung Pipettenspitze vorzubereiten geschnitten 2-3 mm vom Ende eines Kunststoffpipettenspitze. </li><li> Filter Suspension durch ein Edelstahl-Sieb-Filter in ein frisches 1,5-ml-Tube. Waschen Sie die Petrischale mit einem zusätzlichen 700 ul D-PBS und Transfer zum gleichen 1,5-ml-Röhrchen durch die Mesh-Filter. Entfernen Mesh, das Röhrchen auf Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3 für restlichen Proben. </li><li> Spin samplesat 11.000 g für 3 min. Dekantieren Sie vorsichtig Stand. Vermeiden Sie das Pellet aufzurühren. </li><li> 1,0 ml kaltem 1x Kochsalzlösung (SSC). Vortex, bis Pellet wird komplett neu aufgehängt. Dies wird manchmal mehrere Runden von Vortex. </li><li> Werden 15 ul 10% SDS. Invert / kräftig schütteln für 30 Sekunden, um nicht-Samenzellen stören. Auch leichtes Schütteln wird in unzureichend Störungen führen und das Pellet nicht richtig im folgenden Schritt zu bilden. </li><li> Spin bei 11.000 g für 2 min. Eine lockere, &quot;fluffy&quot; Pellet ist ein Hinweis auf unvollständige Störung der Körperzellen durch unzureichende Schütteln in Schritt 2.7. Wenn dies der Fall ist, einfach schütteln Sie die Probe wieder und Respin, bis ein fest Pellet gebildet. Dekantieren Sie vorsichtig Stand. Vermeiden Sie das Pellet aufzurühren. Noch einmal kurz drehen und entfernen verbleibende Überstand mit 200 ul Pipette. </li><li> Fügen Sie 940 ul 0,2 x SSC und kalten Wirbels bis Pellet wird resuspendiert. Das Pellet kann sehr schwierig sein, erneut zu suspendieren und kann mehrere Runden von Vortex zu nehmen. Manchmal Klumpen von sDauerwelle sind unvermeidlich. </li><li> Zugabe von 120 ul β-Mercaptoethanol, 100 ul 10% SDS, 20 ul 0,5 M EDTA, pH 8, und 20 ul Proteinase K (60 mg / ml, frisch hergestellt). Gut mischen und zu verdauen Nacht mit Rotation bei 37 ° C aufweist. Fahren Sie mit Phenol / Chloroform-Extraktion. </li></ol> 3. Phenol / Chloroform-Extraktion von DNA aus Cauda Sperma HINWEIS: Da der Kern-DNA in der späten Phase Spermatiden und reife Spermien mit Protaminen komplexiert und ist im Vergleich zu der DNA von Körperzellen stark kondensiert, herkömmliche Nukleinsäureisolierung Methoden nicht erzeugen DNA mit ausreichender Ausbeute und Reinheit für die Mutation Assay zur Arbeit effizient. Mehrere Phenol-Chloroform-Extraktionen nach einer aggressiven Verdauung erforderlich sind, freizugeben und zu reinigen Sperma-DNA (basierend auf Methoden aus 15). <ol><li> Übertragungs Spermium verdauen in ein 15 ml Polypropylenröhrchen. </li><li> 2 ml Phenol: Chloroform Gemisches (1: 1). Drehen Rohr bei 22 Umdrehungen pro Minutefür 3 min. </li><li> Zentrifuge bei 1.600 g für 10 min und übertragen wässrige obere Schicht zusammen mit der Fuzzy-Grenzschicht zu einem frischen 15 ml Tube. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 und 3.1.3 3x, aber die Änderung der Rotationszeiten bis 3 min, 4 min, 6 min, auf. Auf der letzten Wiederholung, vermeiden Sie die Übertragung einer der &quot;Fuzzy&quot;-Schnittstellenschicht. </li><li> Nach der 4. Extraktion, fügen 70 ul 3 M NaAc, pH 5,2 1 ml wässriger Extrakt und 2 ml Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1). Drehen Rohr bei 22 Umdrehungen pro Minute für 12 min. </li><li> Zentrifuge bei 1.600 g für 10 min und übertragen wässrige obere Schicht in ein frisches 15-ml-Tube. </li><li> Fällen DNA durch Zugabe von 2 Volumina absolutem Ethanol und sanft Drehen der Röhre auf seiner Seite mit sanfte Schaukeln. </li><li> Sammeln von DNA-Spooling auf der Spitze eines wärmeversiegelt Weide Pipette. Spülen DNA durch Schwenken der Pipettenspitze in 70% Ethanol und Luft für 5 min. </li><li> Nach der Extraktion lösen DNA-Niederschlag in 40 bis 100 ul Tris-EDTA-Puffer, pH 8. Lagerung bei 4 ° C. Damit der DNA bei 4 ° C für mindestens zwei Tage vor dem Fortschreiten zu lacZ Mutationstest lösen. Wenn Löslichkeit Probleme werden angetroffen, DNA kann weiter bei 65 ° C für 15 min vor der Verwendung aufgelöst werden. Bestimmung der Konzentration der DNA mit einem spectrophotometre bei A 260 und sicherzustellen, dass die Konzentration der gelösten DNA zwischen 200-2.000 ng / ul. </li></ol> 4. Isolierung und Verdauung von Keimzellen von Tubuli seminiferi <ol><li> Wenn gefroren, auftauen Hoden auf Eis (ca. 1 Stunde). Transfer Hoden auf eine Mattscheibe. </li><li> Halten Sie ein Ende des Hodens mit einer Pinzette. Am anderen Ende des Hodens, Punktion eine Öffnung in der epithelialen Kapsel mit einer anderen Zange oder ein Paar Dissektion Schere (5A). Drücken Sie die Samenkanälchen durch die Punktion und entsorgen Sie die epithelialen Kapsel (5B). </li><li> Eindd 500 ul Raumtemperatur D-PBS zu den decapsulated Samenkanälchen. </li><li> Winkel eine Geweberolle, so daß ein Ende in Kontakt mit der Platte bei einem Winkel von ungefähr 5-10 ° (5C) (Silikongummi fest über eine frei drehende 5 mm Durchmesser-Edelstahlrohr oder einer ähnlichen Vorrichtung montiert). Ohne Druck auszuüben, sanft bewegen die Walze hin und her über den Tubuli, bis sie abgeflacht sind und die D-PBS wird trüb mit freigesetzten Zellen (etwa 5-10x). </li><li> Einen weiteren hinzufügen 500 ul D-PBS in den Tubuli und sanft über den Tubuli rollen ein paar weitere Male. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an freistehende Röhrchen übertragen (Figur 5D). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,6 mehr Zellen bei Bedarf zu sammeln. </li><li> Dauert ca. 1 - 2 Minuten für alle versehentlich gesammelt Tubuli, auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. Übertragen Sie die D-PBS auf eine fresh 1,5-ml-Röhrchen und hinterließ den abgesetzten Tubuli (ca. 100 ul von D-PBS). Ein kleines Aliquot dieser Suspension kann unter einem Mikroskop (Phasenkontrast) überprüft werden, um die Zusammensetzung der Zellpopulation zu bewerten. </li><li> Spin-Down der Zellen bei 11.000 g für 30 sek. Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Das Zellpellet kann bei -80 ° C an dieser Stelle bei Bedarf eingefroren werden. </li><li> Auftauen Zellen, falls erforderlich. Transfer in ein 15 ml Polypropylenröhrchen und Zellen in 5 ml Lysepuffer (10 mM Tris pH 7,6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mg / ml Proteinase K, 1% SDS). Verdau über Nacht im Brutschrank mit Rotation bei 37 ° C aufweist. </li><li> Fahren Sie mit Phenol / Chloroform-Extraktion. </li></ol> 5. Phenol / Chloroform-Extraktion von DNA aus Samenkanälchen Keimzellen HINWEIS: Eine weniger aggressive Extraktion wird verwendet, um Samenkanälchen Keimzellen-DNA zu isolieren, da diese Zelltypen noch nicht fortgeschritten sind durch nuclear Kondensation. <ol><li> 5 ml Phenol: Chloroform Gemisches (1: 1) über Nacht Samenkanälchen Zellaufschluss. Drehen Rohr bei 22 Upm für 20 min. </li><li> Zentrifuge bei 1.600 g für 10 min und übertragen wässrige obere Schicht, während die Vermeidung der &quot;Fuzzy&quot;-Schnittstellenschicht, in ein frisches 15-ml-Tube. </li><li> 100 ul 5 M NaCl pro 5 ml wässriger Extrakt (normalerweise 5 ml zurückgewonnen wird) </li><li> 5 ml Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1). Drehen Rohr bei 22 Umdrehungen pro Minute für 12 min. </li><li> Zentrifuge bei 1.600 g für 10 min und übertragen wässrige obere Schicht in ein frisches 15-ml-Tube. </li><li> Fällen DNA durch Zugabe von 2 Volumina absolutem Ethanol und sanft rotierenden und Umkehren Röhren. </li><li> Sammeln von DNA-Spooling auf der Spitze eines abgedichteten Weide Pipette. Spülen DNA durch Schwenken der Pipettenspitze in 70% Ethanol und Luft für 5 min. </li><li> Auflösen DNA in 40-100 ul Tris-EDTA-Puffer, pH 8. Lagerung bei 4 ° C. Erlauben DNA bei 4 ° C für ein Minimum von zwei zu lösenTage, bevor Sie mit lacZ Mutationstest (siehe Schritt 3.9). Wenn Löslichkeit Probleme werden angetroffen, DNA kann weiter bei 65 ° C für 15 min vor der Verwendung aufgelöst werden. Bestimmung der Konzentration der DNA mit einem spectrophotometre bei A 260 und sicherzustellen, dass die Konzentration zwischen 200 und 2000 ng / ul. </li></ol> 6. LacZ Mutation Assay Bakterielle oder Pilzkontamination kann mit Verpackungseffizienz sowie Plaquewachstum und Scoring stören. Es ist daher wichtig, den lacZ-Assay unter Verwendung der geeigneten aseptischen Maßnahmen zur Kontamination des Verpackungsreaktion, Wirtskultur und Wachstumsmedium zu verhindern, durchzuführen. <ol><li> Tag vor dem Test: Bereiten Bottom-Agar und-Nacht-Kultur <ol><li> Acht Platten (4 Platten, um Mutanten punkten, 4 Platten-Titer zählen) mit 8 ml Boden Agar jeweils pro Probe erforderlich ist (dh., 64 ml pro Probe). Der Boden-Agar ist für beidedie mutierten und Titer Count-Platten. Bereiten Sie ausreichend Boden-Agar für die Anzahl der Proben verarbeitet werden. Aseptisch gießen in 90 mm Petrischalen (8 ml pro Schale) und lassen Agar verfestigt. HINWEIS: Bottom-Agar-Platten bis zu 1 Woche im Voraus vorbereitet werden. </li><li> In einem 50-ml-Röhrchen 10 ml LB-Medium wurden 100 ul 20% Maltose-Lösung, 25 ul Ampicillin (20 mg / ml) und 20 ul Kanamycin (5 mg / ml). Impfen mit E. coli (lacZ - / galE- -) 25 und über Nacht wachsen bei 37 ° C mit 240 rpm schütteln. </li></ol></li><li> Tag 1: Sub-Kulturzellen <ol><li> Teilkulturzellen durch Herstellung einer 1: 100 Verdünnung der Übernachtkultur in frischem LB (keine Antibiotika). Pro Probe ein Volumen von 8 ml Subkultur benötigt wird. Bei 37 ° C unter Schütteln bei 240 rpm für etwa 3,5 Stunden, bis die OD 600 = 1 ist. </li><li> Bei OD 600 = 1, Division Zellsuspension gleichmäßig in 50-ml-Röhrchen und Zentrifugieren bei 1.300 × g bei 15 ° C für 10Minute Überstand entfernen und erneut zu suspendieren Zellen in die Hälfte des ursprünglichen Volumens (dh., 4 ml pro Probe) von LB, enthaltend 10 mM MgSO 4. Setzen Zellen beiseite, bis sie benötigt [Schritt 6.2.4.3]. </li></ol></li><li> Tag 1: Verpackungs DNA in Lambda Phagenpartikel <ol><li> Aufwärmen im Wasserbad auf 30 ° C. </li><li> Mit einem Weit Bohrung 10 ul Pipettenspitze, Transfer 4 ul DNA in ein 1,5-ml-Tube. HINWEIS: Dieser Schritt kann einen Tag oder mehr im Voraus durchgeführt werden, um die Vorbereitungszeit zu verringern. </li><li> Wärm dich das erste Rohr (rot) aus einer Phagen-Verpackungsextrakt-Kit (1 Tube für je 2 Proben). Kurz drehen, um Extrakt auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Übertragen 4,8 ul Packungsextrakt aus dem ersten Rohr zu der DNA-Probe und durch vorsichtiges Rühren mit der Pipettenspitze. Kurz Spin-Down-Proben in den Röhrchen. Inkubation für 1,5 Stunden in 30 ° C Wasserbad. </li><li> Wärmen Sie den zweiten (blau) Verpackungsextrakt Rohr (1 Rohr für ~ 15 Proben). Kurz drehen, um Extrakt unten sammelnRohr. </li><li> Übertragen 4,8 ul von Verpackungs Auszug aus der zweiten Röhre auf die DNA-Probe und mischen durch leichtes Rühren. Kurz Spin-Down-Proben in den Röhrchen. Inkubation für weitere 1,5 Stunden bei 30 ° C Wasserbad. </li><li> Resuspendieren verpackten Phagen-Partikel in 500 ul SM-Puffer und Mischen durch Rotation für 30 min bei 20 Upm. </li><li> Nach dem Drehen, kurz Wirbel Proben und Zentrifuge bei 11.000 g für 30 Sekunden, um Proben auf dem Boden des Röhrchen zu sammeln. Phagenpartikel sind bereit für eine Infektion [Schritt 6.2.4]. </li></ol></li><li> Tag 1: Vorbereiten Top-Agar <ol><li> Bereiten separaten Top-Agar für die Mikrotiterplatten und mutierten Selektionsplatten. Jede Probe erfordert 4 Mikrotiterplatten und 4-Platten-Mutante. Jede Platte benötigt 8 ml Top-Agar. Hinzufügen des selektiven Agens Phenyl-β-D-galactopyranosid (Gal-P) an die Mutantenselektion Top-Agar allein. Bereiten Sie beide oben Nährböden im Voraus (Tag der Assay) und halten bei 50 ° C, bevor MgSO 4 auf beide oben Nährböden, und PGal, um die Auswahl Agar-Mutante. </li></ol></li><li> Tag 1: Infektion von Zellen mit verpackten Phagen und Oberflächen <ol><li> Beschriften Sie zwei 50-ml-Röhrchen je Probe: 1 &quot;Mutante&quot; Röhren pro Probe und 1 &quot;Titer&quot; tube pro Probe </li><li> Label 8-Agar-Platten pro Probe: 4 &quot;mutierten&quot; Platten pro Probe und 4 &quot;Titer&quot; Platten pro Probe </li><li> Aliquots von 2 ml resuspendiert Zellen [aus Schritt 6.2.1.2] in jedes Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul von verpackten Phagenpartikel [aus Schritt 6.2.2.8], um &quot;mutierten&quot; 50-ml-Tube (mit Zellen). Vorsichtig mischen und Phagenpartikel, um Zellen für 30 min bei Raumtemperatur infiziert. </li><li> Nach 30 min Vortexen infizierten Zellen und übertragen 15 ul der infizierten Zellen, um die entsprechende 50-ml-&quot;Titer&quot; Röhre (enthaltend Zellen). </li><li> Um Platte Titer Probe, 30 ml warmem (50 ° C) &quot;Titer&quot; Top-Agar (NICHT enthalten P-Gal), um &quot;Titer&quot; 50 ml Tube. Sofort distribute Agar / Zellgemisch unter den 4 &quot;Titer&quot;-Platten (~ 8 ml pro Platte). Arbeiten schnell, so dass der Top-Agar nicht in den Pipetten zu kühlen, und versuchen Sie nicht, um Luftblasen einzuführen. </li><li> Plate Die &quot;Mutanten&quot; Proben nächsten. Stellen Sie sicher, P-Gal auf &quot;Mutantenselektion&quot; Top-Agar gegeben. 30 ml warm &quot;Mutantenauswahl&quot; Agar (mit P-Gal) auf &quot;mutierten&quot; 50 ml Tube. Sofort verteilen Agar / Zellgemisch unter den 4 &quot;Mutant&quot; Platten (~ 8 ml pro Platte). </li><li> Platten erlauben, sich zu verfestigen (~ 15 min) dann invertieren und bei 37 ° C über Nacht. </li></ol></li><li> Tag 2: Zählung der Plaques <ol><li> Nach Inkubation über Nacht, zählen die Anzahl der Plaques auf den mutierten und Mikrotiterplatten. Für eine große Anzahl von Plaques, zählen nur einen Teil der Platte, um die Gesamtzahl zu schätzen (zB., Oft ¼ der Titer Platte wird zwischen 100-200 Plaques). Ein Minimum von 100 Plaques pro Platte sollte, wenn cou gezählt werdennting einen Abschnitt der Platte. </li><li> Berechnen Sie die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro ul der Zellen. Dies wird durch Teilen der Anzahl von Plaques auf den &quot;Titer&quot; Platten durch das Volumen der Zellen ausplattiert (15 ul) durchgeführt. </li><li> Verwenden Sie die Anzahl der PFUs / ul, um die Gesamtzahl der in der PFUs Gesamtvolumen von infizierten Zellen auf den &quot;Mutanten&quot;-Platten (PFU / ul * vernickelt schätzen [2 ml Zellen + 0,5 ml Phagenpartikel verpackt - 15 ul für Mikrotiterplatten] ). </li><li> Schätzen Sie die MF, indem die Gesamtzahl der mutierten Plaques auf den 4 &quot;mutierten&quot; Platten durch die geschätzte Gesamtzahl der PFUs im Gesamtvolumen von infizierten Zellen aus den &quot;Titer&quot; Platten bestimmt gezählt. </li></ol></li><li> Wenn die spontane lacZ MF ist in der Größenordnung von 3 x 10 -5 in der Kontrollgruppe, wie es für MutaMouse Keimzellen, empfiehlt die OECD-Richtlinie ein Minimum von 125.000 bis 300.000 nicht-mutierten PFUs pro Tier sein Bildschirmed für die Mutation, um einen zuverlässigen Ausgangssignal zu erhalten. Andere transgene Modelle können niedrigere spontane MF, wobei in diesem Fall eine größere Anzahl von PFU erforderlich wäre. Eine statistische Power-Test kann, um die Mindestanzahl von PFU und Tiere erforderlich ist, um die gewünschte Auflösung zu erzielen bestimmen durchgeführt werden. Daten aus mehreren Wiederholungen können gepoolt werden, um diese Anforderung zu erfüllen Mindest PFU, sofern sie nicht signifikant unterschiedlich mutierten Frequenzen zu erzeugen. </li></ol> 7. Statistik Das Versuchsgerät für die Analyse ist die Maus. Mit diesem Test erzeugten Daten werden in der Regel nicht normal verteilt sind. Als solche wählen statistische Methode zur Analyse auf der Basis der Verteilungscharakteristik der Daten. HINWEIS: Standard metrische Analysen (. ZB ANOVA) verwendet, wenn entsprechende Datentransformation angewandt wird, um die Varianz der Reaktion in dem Bereich von Beobachtungen auszugleichention. Poisson oder binomische Regressionsanalysen sind oft besser geeignet. Nichtparametrische Analyse kann auch verwendet werden. Wir routinemäßig einzusetzen Poisson-Regression mit der verallgemeinerten linearen Modells Verfahren (dh., Proc GENMOD) in SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC), wie von Lemieux et al 26 beschrieben.

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Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).</li><li>Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testes+weight+reflect+ethylnitrosourea+induced+histopathology+in+mice.">Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice.</a> Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).</li><li>Russell, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+male+germ-cell+stage+on+the+frequency,+nature,+and+spectrum+of+induced+specific-locus+mutations+in+the+mouse.">Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse.</a> Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+sperm+and+artificial+insemination+of+mice.">Harvesting sperm and artificial insemination of mice.</a> J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).</li><li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids.">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).</li><li>Lemieux, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+benzo[a]pyrene-induced+pig-a+and+lacZ+mutations,+micronuclei+and+DNA+adducts+in+muta+mouse.">Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse.</a> Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).</li><li>Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+molecular+characteristics+of+mutations+induced+by+ethylnitrosourea+in+germ+cells+isolated+from+seminiferous+tubules+and+in+spermatozoa+of+lacZ+transgenic+mice.">Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).</li><li>Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose--response+curve+for+ethylnitrosourea-induced+specific-locus+mutations+in+mouse+spermatogonia.">Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).</li><li>Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cII+locus+in+the+MutaMouse+system.">The cII locus in the MutaMouse system.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).</li><li>Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+induced+male+germline+mutation:+Correlations+and+comparisons+between+traditional+germline+mutation+assays,+transgenic+rodent+assays+and+expanded+simple+tandem+repeat+instability+assays.">Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bietet die TGR Keimzellmutationstest eine schnellere, wirtschaftlichere und empfindlicher Mittel zur Quantifizierung Keimzellen in vivo Mutationen induziert. Durch die Bewertung Transgen MF direkt im Sperma, im Gegensatz zu Nachkommen, die Anzahl der Tiere, die Zeit und erforderlich, um die Keimbahn Mutagenität von jeder einzelnen Verbindung beurteilen Ressourcen deutlich reduziert. In Bezug auf die Empfindlichkeit, konnten wir eine signifikante 2,6 fache Erhöhung der Spermatogonien Stammzellen MF nach Exposition mit 25 mg / kg ENU mit nur 5 Tiere pro Dosisgruppe zu erkennen. Im Gegensatz dazu die spezifischen Locus-Test konnte keine signifikante Veränderung der MF an dieser gleiche Dosis mit&gt; 3.000 Mäuse in der exponierten Gruppe und&gt; 500.000 Kontrollmäusen 28 zu erkennen. Zusätzlich zu seiner Eignung für beide mechanistischen und behördlichen Untersuchungen, bietet diese Methode eine Chance für vergleichende Studien zwischen somatischen und Keimbahn Mutatiauf Raten. Aktuelle Hinweise darauf, dass für einige Agenten Keimzellmutationen können bei niedrigerer Konzentration als für somatische Mutation erforderlich induziert werden. Zum Beispiel längerer N-Hydroxymethylacrylamid, ein Metabolit von der Lebensmittel Karzinogen Acrylamid 12, erhöht sich die Frequenz der dominanten tödliche Keimzellmutationen bei Mäusen ohne die Mikrokernfrequenz in den roten Blutkörperchen, ein traditionelles Maß für somatische Zell zytogenetische Schäden 13. Zusätzlich Exposition von Mäusen zu beiden Mainstream-und Nebenstromtabakrauch Ursachen erhöhte Mutationshäufigkeiten bei Tandem-Repeat-DNA-Loci im Sperma bei Dosen, die nicht Blutmikrokernfrequenz 14 erhöhen müssen. Diese Ergebnisse stellen die Annahme, dass somatische Genotoxizität ist immer Schutz der Keimbahn, und verstärken die Nachfrage nach einer effizienteren und kostengünstiges Mittel, um Keimzellmutationsfrequenz zu quantifizieren. Allerdings ist der Nachweis für die bevorzugte Keimzellmutagene noch schwach, Vor allem wegen des Mangels an verfügbaren Daten für den Vergleich von Mutationsraten in der somatischen und Keimzellgewebe. Die TGR Mutation Assay ermöglicht die parallele Prüfung und Vergleich der induzierten Mutationsraten in mehreren Geweben unter Verwendung der gleichen Transgens. So testen Vergleichs Mutation mit der TGR-Test würde helfen, Datenlücken zu füllen um die Möglichkeit von Präferenz Auswirkungen auf Keimzellen. Gleichzeitige Beurteilung der somatischen und Keimzelle für regulatorische Mutation Test würde auch die Effizienz zu verbessern, indem die Anzahl der Tiere erforderlich. Die OECD-Richtlinie für die somatische Mutation empfiehlt einen 28-tägigen Verabreichung Zeit, gefolgt von einer dreitägigen Probenahmezeit (28 + 3). Analyse der Cauda Spermien geringe Empfindlichkeit zu diesem Zeitpunkt bieten, da sie meist in den Zellen Spermatozyten und Spermatiden Phasen der Spermatogenese (Abbildung 3) ausgesetzt abzielt. Zellen in diesen Phasen nicht synthetisieren DNA und schrittweise verlieren ihre Fähigkeit zur DNA-Reparatur-6 &lt;/ Sup&gt;. Außerdem würde Probenahme Cauda Spermien zu diesem Zeitpunkt nicht zu Mutationen in Spermatogonien und Stammzellen auftreten zu erkennen. So ist die Integration in die 28 + 3 Design, empfiehlt die OECD-Richtlinie Sammeln Keimzellen aus den Samenleiter. Diese gemischte Population enthält Zellen, die aus der DNA-Synthese und Reparatur beherrschen Zelltypen, einschließlich Stammzellen abgeleitet und über den Großteil der Spermatogenese Phasen ausgesetzt. Jedoch wegen der gemischten Charakter dieser Zellen, Samenleiter Zellanalyse bietet keine phasenspezifischen Informationen. Darüber hinaus gibt es die Sorge, dass die Anwesenheit von Nicht-Zielzellen können die beobachteten MF beeinflussen (zB falsch positive Keimzellenmutagen Anrufe durch Verschmutzung von mutierten Körperzellen, oder Verdünnung eines mutierten Keimzelle Signal von DNA-Reparatur-defizienten Keimzellen) . Derzeit gibt es keine ausreichenden Daten zu dem Schluss, ob die Ergebnisse von Samenkanälchen Zellen bei 28 + 3 bieten die gleiche Sensitivität und Spezifität eins Cauda Spermien zu späteren Zeitpunkten. Unser Labor ist derzeit Vergleich induzierten Marktfaktoren in Samenkanälchen Zellen und Spermien der Cauda nach verschiedenen Probenahmezeiten gesammelt, um diesen Punkt eingehen. Wir stellen fest, dass der OECD-Richtlinie schlägt eine alternative Abtastzeit von 28 Tagen langsam teil Geweben wie der Leber, die auch für die Keimzellanalyse sein kann. Dennoch ist immer noch unzureichend verfügbaren Daten, und wir sind derzeit nicht in der Lage, eine einzige experimentelle Design für die gleichzeitige Analyse von Körperzellen und Keimzellen mit der TGR-Mutationstest für regulatorische Prüfung zu empfehlen. Eine Charakteristik dieses Assays, die beachtet werden sollte, ist, daß Mutationsereignisse werden auf einem nicht-transgene Mäuse bewertet. Jedoch gibt es zahlreiche Beweise dafür, dass das Transgen reagiert auf Umwelt Mutagene in einer ähnlichen Weise, um endogene Gene 20. Zusätzlich, da die genauen Ursachen von unabhängigen Mutationsereignisse sind schwerbeheben, werden die Ergebnisse im allgemeinen als ein Mutantenfrequenz (im Gegensatz zu einer Mutationsfrequenz) angegeben. Die tatsächliche Mutationsfrequenz kann gelöst werden, wenn die Ergebnisse für die klonale Expansion (dh. Der Division und Multiplikation eines einzelnen mutierten Zelle, die zu der beobachteten Häufigkeit von Mutanten Transgen tragen kann), die durch DNA-Sequenzierung korrigiert. Die Sequenzierung der mutierten Transgenen kann durchgeführt werden, um die lacZ-Mutationen zu charakterisieren und zu identifizieren, die Mutanten von klonalen Expansion Ereignissen abgeleitet werden kann, obwohl dies trägt wesentlich zu der Zeit und den Kosten der Analyse. Neben dem lacZ-Gen, theλgt10 transgenen Vektor beherbergt eine alternative temperaturabhängigen mutations Reportergen: eine Variante des λ CII-Gen, das kürzere (294 bp vs das 3021 bp lacZ, Abbildung 1) und leichter zu sequenzieren 29 ist. Sequenzierung erlaubt auch die Analyse der induzierten Mutationsspektrum, die einen Einblick in die mutational Mechanismus der Verbindung in Frage. Ein extremes Beispiel für klonalen Expansion ist das Auftreten eines &quot;Jackpot&quot;-Mutation (dh., Transmutationen in einem sehr frühen Stadium der Entwicklung eines Organs, die zu einer dramatisch erhöhten MF beitragen, manchmal hunderte bis tausende Male größer als Hintergrund). Tiere oder Gewebe mit einem &quot;Jackpot&quot;-Mutation sollte aus der Analyse entfernt werden. Der Test, die wir beschrieben haben, ist breit anwendbar auf andere TGR-Modellen wie dem BigBlue Maus und Ratte, und der lacZ-Plasmid-Maus, die alle ähnliche Mutation Hafen Reporter-Vektoren (in 20 überprüft). Die große Mehrheit der Keimzelle Studien bis heute durchgeführt, die ähnliche Methoden verwenden fast ausschließlich auf gut charakterisiert Mutagenen, wie DEU-und Strahlentherapie (in 30 prüft) konzentriert. Es wird erwartet, dass mit der jüngsten Veröffentlichung des OECD-Prüfrichtlinie für die TGR-Test, dieser Test wirdimmer beliebter für chemische Screening und regulatorische Bewertung. Einbeziehung der TGR Keimzellmutationstest in einen Regelungstestbatterie wird die bestehende Lücke durch die eine effiziente Bewertung der Mutation Induktion in Keimzellen 11 zu füllen. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um MF in nahezu jedem Gewebe zu messen, die eine geeignete Einrichtung zum Vergleichen der relativen Empfindlichkeiten der somatischen Zellen und Keimzellen auf die Induktion von Mutationen, die durch Umwelteinflüsse in identischen genetischen Endpunkten werden.

Sporadische DNA-Mutationen in der Keimbahn können zu einer verminderten Fortpflanzungserfolg führen, und wenn geerbt, können genetische Krankheit oder erhöhten Prädisposition für Krebs bei den Nachkommen 1-3 führen. Erhebliche Beweise zeigen, dass ein großer Anteil der de novo Mutationen werden von der väterlichen Keimbahn vererbt 4, und dass die Anzahl von Mutationen in den Nachkommen positiv mit väterlichen Alter zum Zeitpunkt der Empfängnis 5 korreliert. Der höhere Anteil der männlichen Mutationen ist vermutlich eine Folge der Altersunterschied während der Gametogenese zwischen den Geschlechtern, die größere Zahl der Spermatogenese Zellbereiche im Vergleich mit der Anzahl der oogenic Zellteilungen in der weiblichen Keimbahn 2 und eine progressive Abnahme der DNA Reparatureffizienz mit dem Alter bei Männern. All diese Faktoren tragen zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit des Replikationsfehler in der männlichen Keimbahn 6. Doch die Auswirkungen der väterlichen Engagement in Environmental Faktoren auf die Häufigkeit der de novo Mutationen bleibt ungewiss. Dennoch ist eine große Zahl von Umweltfaktoren sind bekannt, Keimzellmutationen in Nagetieren 7 zu induzieren, und es gibt Anzeichen dafür, dass ein Teil dieser Mittel kann auch die menschliche Keimbahn 8 berührt. Trotz dieser Bedenken sind Chemikalien routinemßig auf ihre Fähigkeit, Mutationen in somatischen Zellen für regulatorische Zwecke zu induzieren, und es wird allgemein angenommen, dass somatische Tests ausreichen, um die Keimbahn zu schützen. Daher werden nur selten Chemikalien auf ihre Fähigkeit zur Keimzellmutationen induziert bewertet. Ein Grund Keimzellmutagenität Tests wurde weitgehend aus dem regulatorischen Entscheidungsprozess weggelassen ist ein Mangel an praktischen Methoden. Traditionelle Nagetier-basierte Methoden, wie die dominant-letale 9 und spezifischen Locus 10 Tests schätzen Keimzellmutationsraten durch Scoring mutierten Phänotypen in Embryonen oder Nachkommen vonEltern ausgesetzt. Diese Tests erfordern die Verwendung einer sehr großen Anzahl von Tieren, die Zeit und die Ressourcen, um statistisch aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Obwohl mehrere moderne Methoden zur Quantifizierung von Keimzellmutation haben vor kurzem entstanden, viele leiden Mängel im Hinblick auf ihre Praktikabilität, Effizienz und biologische Relevanz. Zum Beispiel, wiederholen Länge erweitert Mutationen an einfachen Tandem-Repeat (ESTR) Loci in männlichen Keimzellen mit einem einzigen Molekül PCR Ansatz 15 quantifiziert werden. Jedoch kann die Ausführung dieser Methode technisch anspruchsvoll und aufwendig sein, und im Gegensatz zu Punktmutationen, die biologische und gesundheitliche Bedeutung von Veränderungen in der Rapportlänge des sehr instabilen ESTR Loci unklar 16. Moderne Genomsequenzierungstechnologien können eine Fülle von biologisch sinnvolle Daten zu liefern, wenn für das Problem der vererbbare Mutationen 4,17 angewendet, aber die hohen Kosten, hohe Fehlerraten, verbunden Validierung erforderlichMutationen zu bestätigen, und Bioinformatik Herausforderungen immer noch die routinemäßige Anwendung dieser Option in einen Rechtstestkapazität 18 zu begrenzen. Hier beschreiben wir ein praktisches Verfahren zur Quantifizierung induzierte Mutationen direkt in den Keimzellen des transgenen männlichen Mäusen. Dieses Protokoll ist für die transgene MutaMouse Modell, das mehrere verkettete Kopien eines rekombinanten gt10-Phagenvektor, enthaltend ein in beide Kopien des Chromosoms 3 19 (Figur 1) integriert Escherichia coli lacZ-Reporter-Gen beschrieben. Dieses Protokoll ist auch für andere transgene Nager (TGR) Modelle, die auf den gleichen Prinzipien (BigBlue Maus und Ratte, Maus oder lacZ-Plasmid, etc.) Oder leicht unterschiedlichen Reportergenen (gpt Delta Maus und Ratte, TGR-Modelle in Lambert et Bewertung al. 20). Diese Methode basiert auf der in einer kürzlich veröffentlichten beschrieben TGR Mutation Assayund überarbeiteten OECD-Prüfrichtlinie 21 und wir uns auf die besondere Überlegungen erforderlich, um Beurteilung von Mutationen in der männlichen Keimbahn wegen der einzigartigen Eigenschaften der Spermatogenese Platz zu erarbeiten. Kurz gesagt beinhaltet der Test ausgesetzt transgenen männlichen Mäusen mit einem mutagenen Substanz, gefolgt von einer Abtastzeit in dem Vorausmutations Läsionen in stabile Mutationen fixiert. Bei der gewählten Abtastzeit werden die Mäuse getötet und Keimzellen entweder aus dem Nebenhoden oder Cauda Samenkanälchen gesammelt. Wie unten diskutiert, können mutagene Effekte in verschiedenen Phasen der Spermatogenese durch die Auswahl der Zeitspanne zwischen Belichtung und Probenentnahme zu bestimmen. Transgenen Einsätze, mehrere Kopien des λ-Phagen-Genoms pro Zelle, werden aus Keimzelle genomische DNA isoliert und in leer λ Phagen λ Kapside Schaffung Infektionsphagenpartikel, die dann verwendet werden, um einen E. infizieren verpackt coli-Wirt. Die infizierten Bakterien auf Selec gewachsentive Medien, die Zellen, die einen Vektor mit einer mutierten Kopie des lacZ aus Zellen, die Wildtyp-lacZ unterscheiden kann. Die mutagene Wirkung der Exposition auf die männliche Keimbahn wird durch Vergleichen der Frequenz des mutanten Transgene zwischen Kontrolle und behandelten Mäusen (2, 20 Lambert et al. Bewertung) bestimmt. Eine große Anzahl von Keimzellen aus einer einzigen Maus untersucht werden, was diesen Test überlegene Empfindlichkeit gegenüber traditionellen Methoden, während die Zahl der Tiere zu reduzieren erforderlich. Und weil keine spezielle Ausrüstung oder Ausbildung erforderlich ist, bietet dieser Test eine praktische und effiziente Möglichkeit für Keimzellmutation Tests in den meisten modernen Toxikologie / molekularbiologischen Laboratorien. Eine wesentliche Voraussetzung für die wirksame Anwendung der TGR Keimzellmutationstest ist ein Verständnis der Spermatogenese-Zyklus (Abbildung 3). Die Zeit für die Keimzellen der Maus, um von st Fortschritteem-Zellen in den Samenleiter zu Spermatogonien, Spermatozyten, Spermatiden und schließlich Spermien im Nebenhoden (dh. Spermatogenese) ist etwa 49 Tagen fällig. Mutation kann in verschiedenen Phasen des Zyklus auftreten und ist oft spezifische Verbindung. Zwei wichtige Funktionen, die von besonderer Bedeutung für die Mutagenese in männlichen Keimzellen sind die Beendigung der DNA-Synthese während der frühen Meiose und der fortschreitenden Verlust von DNA-Reparaturkapazität 6 während der späten Post Meiose zwei Prozesse, die für die Einleitung und Fixierung erforderlich sind Die meisten Mutationen. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften der Spermatogenese, gibt es drei kritische experimentelle Variablen für die Durchführung der TGR Keimzellmutationstest: (1) die Testverbindung Verwaltungszeit; (2) den Probezeit; und (3) die Auswahl der Keimzellpopulation zur Analyse (Abbildung 3 und Tabelle 1) zu sammeln. Verwaltung Zeit ist die ExperimeNTAL Variable, wie lange die Zielzellen werden mit den Testverbindungen ausgesetzt bestimmt. Die Länge der Applikationszeit kann auch verwendet werden, um Forderungen an spezifische Zelltypen oder Phasen der Spermatogenese Ziel. Zum Beispiel könnte eine einzelne tägliche Verabreichung verwendet werden, um die Wirkungen einer akuten Exposition auf einen bestimmten Zelltyp zu bestimmen. Ebenso kann die Exposition zu einer gesamten Spermatogenese Phase, indem sie auf nur meiotisch Division Spermatozyten oder mitotisch Division Spermatogonien mit einen 2-wöchigen Verabreichung Zeit und eine geeignete Probenahmezeit fokussiert werden, zum Beispiel. Chronische und subchronische Einnahmezeiten werden verwendet, um die Auswirkungen von Langzeitexposition zu bewerten, um eine ausreichende pharmakokinetischen Verteilung der Testverbindung zu gewährleisten, oder zulassen, ausreichende Akkumulation von Mutationen von schwach mutagen (zum Beispiel der 28-tägigen Verabreichung Zeit im OECD-Test empfohlen Richtlinie). Abtastzeit ist die kritische Größe für die Bestimmung, bei derPhase der Spermatogenese die Zielzellen waren zum Zeitpunkt der Exposition. Die Probenahme bestimmt, wie viel Zeit und damit, wie viel weiter entlang der Spermatogenese Zyklus Zellen nach der Exposition durch geben. Zum Beispiel, um Effekte in der Stammzell Spermatogonien untersuchen, wurde ein Stichprobenzeit&gt; 49 Tage, wenn das Sammeln ausgereifte Spermien erforderlich ist oder&gt; 42 Tage, wenn das Sammeln unreifen Keimzellen aus den Samenleiter, um sicherzustellen, dass alle gesammelten Zellen haben genug Zeit zu haben entwickeln sich aus Stammzellen ausgesetzt. Es ist wichtig zu beachten, daß eine Probenahmezeit von mindestens 70 Tage wäre vorzuziehen, um eine echte Stammzellen Wirkung zeigen, um genügend Zeit für pharmakokinetische Verteilung des Giftstoffes zur Eliminierung von Zellen in späteren Phasen der Spermatogenese ausgesetzt sind, und zur Rechenschaft eine Zeit der vorübergehenden Sterilität, die nach Exposition mit hoch mutagenen Verbindungen 22 6 Wochen auftreten kann ~. Ebenso würde eine Stichprobenzeit von 21 Tagen, die Spermien zu gewährleisten Colleaus den Nebenhoden Cauda cted würde gerade erst abgeschlossen haben Meiose am letzten Tag der Exposition. Keimzellen als reife Spermien der Cauda Epididymis oder als eine Mischung von verschiedenen Samenbildungszelltypen aus den Samenleiter gesammelt werden. Reifen Spermien bleiben in der Cauda für ~ 3 Tage, die es ermöglichen, relativ genau der Zelltyp oder die Phase der Spermatogenese, aus dem das Sperma stammt für einen bestimmten Versuchsanordnung zu bestimmen. So, die Analyse der Cauda Spermien ermöglicht eine sehr gezielte Untersuchungen von stadienspezifischen Mutationseffekte. Auf der anderen Seite, Zellsuspensionen aus den Samenkanälchen gesammelt enthalten eine Mischung aus verschiedenen Keimzelltypen in unterschiedlichen Phasen der Entwicklung, und bieten somit schlechtere Auflösung der Spermatogenese Phase, in der Mutationen entstanden. Außerdem Zellsuspensionen aus den Samenkanälchen erholt neigen dazu, eine Überrepräsentation von Spermatiden, gefolgt von Spermatozyten, und ver enthalteny wenige Spermatogonien und Stammzellen (diese Anteile werden durch abgestufte weiße Balken in Abbildung 3 dargestellt). Darüber hinaus können Suspensionen von den Samenkanälchen vorbereitet auch verschiedene Körperzellen enthalten. Somit, weil so viele Zelltypen vorhanden sind, Mutationseffekte können durch eine Vielzahl von Nicht-Zielzellen beeinflusst werden. Allerdings Sammeln von Proben aus Samenkanälchen bietet eine kostengünstige Option für die gleichzeitige Screening mehrere Keimzelltypen und einfache Integration von Keimzellanalyse in den OECD-Standardtestprotokoll für die somatische Mutation. Um es zu wiederholen, je nach Bedarf des Prüfers, Verabreichungszeit, Abtastzeit und der gesammelten Zellpopulation kann eingestellt werden, um die Wirkungen der Exposition in verschiedenen Zelltypen und in verschiedenen Phasen der Spermatogenese abzufragen. Durch die sorgfältige Auswahl dieser Variablen können Experimente zur gezielten mechanistische Studien, oder für weitere allgemeine regulatorische Prüfung so gestaltet werdenZwecken. Um Kenntnisse im Test erreichen, empfehlen wir den Einsatz einer akuten oralen Verabreichung von 100 mg / kg N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (DEU), gefolgt von einem 70 Tage Abtastzeit als Positivkontrolle. Analyse der Cauda Spermien so zielt Spermatogonien-Stammzellen (Abbildung 3), die typischerweise eine 4-5 fache Erhöhung der Mutationsrate (MF) gegenüber den Kontrollen nach dieser hoch mutagen Dosis DEU. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Dosis ist bekannt, Sterilität induzieren 6 Wochen nach der Exposition werden, so kann es keine geeignete Kontrolldosis für kürzere Abtastzeiten werden. Diese Dosis wird auch produzieren eine erkennbare Zunahme in MF in den meisten somatischen Geweben 20. Die nachstehenden Ergebnisse wurden repräsentativ nach einer akuten Exposition +70 Schema mit drei Dosen von ENU bis einschließlich 100 mg / kg erzeugt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1326">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:664px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MutaMouse</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E.coli (lacZ-/galE-)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;">See reference 25 in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>3001-2-40</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690 FLUKA</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>2/10/7900</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lennon LB broth base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-029</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel mesh filter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3770</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transpack packaging extract</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200220</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH)</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ampicilin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td style="width:664px;">prepare 20 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-024</td>
			<td style="width:664px;">prepare 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15509-097</td>
			<td style="width:664px;">Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenyl-&#946;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6501</td>
			<td style="width:664px;">dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td style="width:664px;">prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 &#181;l per sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate (NaAc)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td style="width:664px;">prepare 3M solutution, pH 5.2</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4390</td>
			<td style="width:664px;">prepare 10% solution in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1 M MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">24.6 g MgSO4&#183;7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">20% maltose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4&#183;7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4&#7506;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Bottom agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X&#160; 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C before pouring into Petri plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline sodium citrate (SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">SM Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4&#183;7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, mutant plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, titre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transgenic rodent assay for quantifying male germ cell mutant frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

Mit einer Durchschnittszahl von 200.000 Plaque Plaques pro Tier, die wir in der Regel beobachten eine mittlere Hintergrund MF von rund 2,8 x 10 -5 in männlichen Keimzellen mit einer Standardabweichung von 1,7 x 10 -5 in unserem Kontrollgruppen (basierend auf Daten von acht unabhängigen Experimente). Mit dieser Plakette Zahl, Hintergrundniveau und Varianz, Dosisgruppen mit n = 5 Tiere jeder ausreichend sind, um eine 2-fache Erhöhung der MF mit Strom&gt; 0,8 zu erkennen. Die Ergebnisse werden in der Regel in tabellarischer oder grafischer Form berichtet. Tabelle 2 und Abbildung 6 zeigen repräsentative Ergebnisse von Cauda Sperma MutaMouse Männer (n = 5 pro Gruppe) zu einem einzigen akuten oralen Dosis von 0, 25, 50 ausgesetzt, und 100 mg / kg N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU), gefolgt von einer 70 Tage Abtastzeit. Diese 70 Tage Zeit erlaubt die Messung der Mutationsereignisse, die in Spermien, die Spermatogonien-Stammzellen bei der Exposition waren aufgetreten ist (Abbildung 3). Typische Plaquedichten auf mutierten und Titerplatten sind in 7 gezeigt. Wie in Tabelle 2 und Figur 6 dargestellt, akute Exposition ENU induzierten eine signifikante dosisabhängige Erhöhung der MF Stammsamenzellen. Die niedrige Dosis induzierte eine signifikante 2,6-fache Erhöhung gegenüber den Kontrollen, die eine Grundlinie von 2,6 MF x 10 -5 hatte. Maximale Induktion trat bei der höchsten Dosis, die eine 4,4-fache Zunahme gegenüber Kontrollen ausgelöst. Ein Beispiel für diesen Test auf Samenkanälchens Keimzellen durchgeführt in Douglas et al. 27, wobei MF in Röhrchen Keimzellen in verschiedenen Zeitintervallen nach einer 5-tägigen Wiederholungs intraperitoneale Injektion von 50 mg / kg bestimmt ENU gefunden werden. In dieser Studie, die Mutantenhäufigkeit in seminiferi Zellen um bis zu 15 Tage nach der Behandlung und blieb danach konstant. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr tr=""><td> Exposicher Regime </td><td> Gesammelte Gewebe </td><td> Die gesammelten Zelltyp (Zielzelle) </td><td> Phase der Zielzelle zu Beginn des Belichtungs </td><td> Phasen während der Belichtung weitergegeben </td></tr><tr><td> Akute + 70 </td><td> Cauda </td><td> Reifen Spermien </td><td> Stammzell </td><td> Stammzell </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> Cauda </td><td> Reifen Spermien </td><td> Spermatogonien </td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td> Cauda </td><td> Reifen Spermien </td><td> Stammzell </td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td> 28 + 3 </td><td> Cauda </td><td> Reifen Spermien </td><td> Spermatocyte </td><td> Spermatocyte Spermatid Reifen Spermien </td></tr><tr><td></td><td> Tubuli </td><td> Stammzell </td><td> Stammzell </td><td> Stammzell </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatogonien </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonien </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatocyte </td><td></td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatid </td><td></td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td> Cauda </td><td> Reifen Spermien </td><td> Stamm cel </td><td> Stammzell </td></tr><tr><td></td><td> Tubuli </td><td> Stammzell Spermatogonien Spermatocyte Spermatid </td><td> Stammzell </td><td> Stammzell </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Zelltypen und Phasen der Spermatogenese, die von der transgenen Nager-Mutationstest von verschiedenen Versuchsanordnungen ausgerichtet sind. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Dosisgruppe </td><td> Tier # </td><td> Mutant PFU </td><td> Gesamt PFU </td><td> MF (x10 -5) </td><td> Avg MF (x 10 -5) </td><td> Fache Veränderung </td><td> p-Wert </td></tr><tr><td> Kontrolle </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180.245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 137835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 431.396 </td><td> 0,5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mg / kg </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162.353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154.401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154.401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mg / kg </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155.727 </td><td> 10,9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193.499 </td><td> 12,9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133.859 &lt;/ Td&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 mg / kg </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170968 </td><td> 15.2 </td><td> 11,5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234.584 </td><td> 11,9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292236 </td><td> 12,0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190.848 </td><td> 11,5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Die lacZ Mutantenhäufigkeit in Cauda Spermien von transgenen männlichen mEis akut um DEU ausgesetzt, wenn sie Stammsamenzellen (Verwaltungszeit = 1 Tag, Probenahmezeit = 70 Tage) waren. PFU = Plaque-bildenden Einheit, MF = Mutationsrate. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> Figur 1 Eine schematische Darstellung des gt10 Phagenkonstrukt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Übersicht der transgenen Nager Keimzellmutationstest. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> Figur 3 Eine schematische Darstellung der Spermatogenese bei der Maus und die Zelltypen und PHAses, die von der transgenen Nager Mutationstest durch verschiedene experimentelle Designs ausgerichtet sind. HINWEIS: Die weißen Balken repräsentieren absolvierte den relativen Anteil von Zelltypen in Zellsuspensionen aus den Samenkanälchen bereiteten (dh Spermatiden&gt; Spermatozyten&gt; Spermatogonien&gt; Stammzellen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Sammlung der Maus Cauda Nebenhoden. A) Einen Einschnitt in den Bauch in Richtung Hodensack. B) Identifizieren Sie die Nebenhodenfettpolster. C) Ziehen Sie die Fettpolster zu ziehen die Hoden und Nebenhoden. D) und die Verbrauch der Cauda Nebenhoden. Abbildung 5. Vorbereitung der Aussetzung der Keimzellen aus den Samenleiter. A) ein Schnitt in der epithelialen Kapsel der Hoden hergestellt, Aussetzen der samenführenden Tubuli. B) die Samenleiter werden aus der Kapsel. C) Gewebewalze sanft über den Tubuli geleitet gequetscht bei 5-10 ° Winkel Lösen der Keimzellen innerhalb. D enthielt) Die Keimzellsuspension wird für eine weitere Verarbeitung gesammelt. <img alt="Figur 6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> Abbildung 6. Grafische Darstellung der lacZ Mutantenhäufigkeit in MutaMouse Spermien akut wie Stammzellen ausgesetzt ENU (n = 5). JederDreieck steht für die MF von einem Tier. * p &lt;0,05, wie durch Poisson-Regression ermittelt. <img alt="Figur 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> Abbildung 7. Repräsentative Agar-Platten aus der transgenen Nager Mutationstest mit Plaques auf einem Rasen von E. gebildet coli Wirtsbakterien. A) Die &quot;Mutanten&quot;-Platten nur sehr wenige Plaques (mit Pfeilen markiert), insbesondere in den Steuerdosisgruppen, die gelegentlich Null Plaques auf einigen Platten. B) Die &quot;Titer&quot; Platten können Hunderte von Plaques haben.

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Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Aufrufe.  Environmental Health Centre. De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Serie: Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Forschung

Biologie

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell migration, gene expression, cell cycle progression and cell adhesion 1. Rho proteins are molecular switches that are active in GTP-bound and inactive in GDP-bound state. Their activation is mediated by a family of Guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) proteins. Rho-GEFs constitute a large family, with overlapping specificities 2. Although a lot of progress has been made in identifying the GEFs activated by specific signals, there are still many questions remaining regarding the pathway-specific regulation of these proteins. The number of Rho-GEFs exceeds 70, and each cell expresses more than one GEF protein. In addition, many of these proteins activate not only Rho, but other members of the family, contributing further to the complexity of the regulatory networks. Importantly, exploring how GEFs are regulated requires a method to follow the active pool of individual GEFs in cells activated by different stimuli. Here we provide a step-by-step protocol for a method used to assess and quantify the available active Rho-specific GEFs using an affinity precipitation assay. This assay was developed a few years ago in the Burridge lab 3,4 and we have used it in kidney tubular cell lines 5,6,7. The assay takes advantage of a "nucleotide free" mutant RhoA, with a high affinity for active GEFs. The mutation (G17A) renders the protein unable to bind GDP or GTP and this state mimics the intermediate state that is bound to the GEF. A GST-tagged version of this mutant protein is expressed and purified from E. coli, bound to glutathione sepharose beads and used to precipitate active GEFs from lysates of untreated and stimulated cells. As most GEFs are activated via posttranslational modifications or release from inhibitory bindings, their active state is preserved in cell lysates, and they can be detected by this assay8. Captured proteins can be probed for known GEFs by detection with specific antibodies using Western blotting, or analyzed by Mass Spectrometry to identify unknown GEFs activated by certain stimuli.

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

The method presented here describes an assay to follow activation of RhoA specific GDP/GTP Exchange Factors (GEFs) in cultured cells by making use of a mutant RhoA GST fusion protein that has high affinity for activated GEFs. GEFs are precipitated from cell lysates, detected by Western blotting and quantified by densitometry.

Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...