Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (OPP1015402) von der Bill and Melinda Gates Foundation durch die Grand Challenges Explorations-Initiative und durch die NIH durch Zuschüsse GM062958-01 und 2R01EB002046 finanziert. Diese Arbeit wurde zum Teil unter der Schirmherrschaft des US Department of Energy Lawrence Livermore National Laboratory durchgeführt unter Vertrag DE-AC52-07NA27344.

1. Einstellen der Bühne <ol><li> Erwerben Sie die entsprechenden, chemisch modifizierten DNA-Sonde aus einer benutzerdefinierten Oligonukleotidsynthese Unternehmen wie Biosearch Technologies (Novato, CA) oder Midland Certified (Midland, TX). Die Sonde wird während der Synthese durch die Zugabe eines C6 Thiol an seinem 3&#39;-Ende und einem redoxaktiven Methylenblau an seinem 5&#39;-Ende modifiziert. </li><li> Lösen Sie die DNA-Sonde in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 zu einer Konzentration von 200 pM und überprüfen Sie die Konzentration durch Messung der Absorption bei 260 nm mit einem Spektralphotometer. Aufgrund der Methylenblau-Einheit auf der DNA-Sonde sollte die Lösung einen sichtbaren Blaustich. </li><li> Frisch zubereiten 1 mL einer 10 mM Lösung von Tris (2-carboxy) phosphin TCEP in destilliertem, deionisiertem Wasser (DI-Wasser). Nach unseren Erfahrungen bleiben diese TCEP Lösungen für eine Woche frisch, wenn im Dunkeln bei 4 ° C gelagert </li><li> Zur Reduzierung einer Disulfidbindungen, die vorhanden sein in der Sonden-DNA-Lösung könnten, kombinieren 1 ul der Sonde DNA-Stammlösung mit 2 ul der TCEP-Lösung und vorsichtig mischen mit einer Pipette. Inkubieren Sie die Mischung für eine Stunde in einem dunklen, Kühlcontainer. Die ursprünglich blaue Lösung soll klar werden, wie die TCEP reversibel reduziert die Methylenblau. Wenn die Lösung nicht geworden ist klar, wiederholen Sie den Vorgang mit einem frischen TCEP-Lösung oder eventuell bei Raumtemperatur. </li><li> Nach einer Stunde verdünnen reduziert DNA-Sonde Lösung mit 1 ml Puffer, das wird es zu einer Konzentration von 200 nM verdünnt. Später werden Sie inkubieren eine Reihe von Gold Disk-Elektroden in 200 ul Portionen dieser verdünnten Sonde Lösung. </li><li> Frisch vorzubereiten mindestens 2 mL von 2mm Mercaptohexanol in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. </li></ol> 2. Sensor Vorbereitung <ol><li> Kombinieren 0,05 Mikrometer Aluminiumoxid-Pulver mit Wasser an einem schönen Poliertuch. Polnische eine Reihe von Gold Disk-Elektroden (CH Instruments, Austin, TX), indem Sie die Goldoberfläche fest in den feuchten Tuch und bewegten sie in einer Acht-Muster für etwa drei Minuten pro Elektrode. </li><li> Spülen Sie den polierten Elektroden mit DI-Wasser und tauchen sie in Eppendorf-Röhrchen mit der gleichen gefüllt. Ultraschallbad für 5 Minuten, um restliche Aluminiumoxidpulver zu entfernen. </li><li> Platzieren Sie die Elektroden in einem 0,5 M Schwefelsäure-Lösung, bringen Sie sie an einen Potentiostaten zusammen mit einer Platin-Gegenelektrode und Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode, und führen eine Reihe von Voltammogramme zu oxidieren, zu reduzieren, und elektrochemisch reinigen ihre Oberflächen. Im Anschluss an diese führen eine zweite elektrochemische Reinigung in einer Lösung von 0,01 M KCl in 0,1 M Schwefelsäure. Die feinen Details dieser Reinigungsverfahren finden Sie in unserem Nature Protocols Papier 1, und in der Ergänzung, um dieses Video zu finden. </li><li> Vereinbaren Sie einen Satz von 2 mL Eppendorf-Röhrchen in ein Rack und füllen mit je 200 ul der Sonde DNA-Lösung. Die Konzentration der Sonden-DNA in dieser Lösung wird die Dichte, mit der die Sonde DNAs Pack auf der Sensoroberfläche zu definieren. Sensor Performance ist stark abhängig von Sonde Dichte, mit der optimalen Dichte variierend von einem Sensor-Architektur zur nächsten. Die Sonde Konzentration bei diesem Schritt verwendet werden, sollten daher für jede neue Art von Sensor 2 optimiert werden. Für die Sonde Architekturen, die wir bisher untersucht haben, die Sonden-DNA-Konzentrationen beschäftigen wir in diesem Schritt von 15 nm bis 2 um, mit 200 nM, ein typischer Wert. </li><li> Spülen Sie den Gold-Disk-Elektroden mit DI-Wasser, und dann tauchen sie in den entsprechenden Sonden-DNA-Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen für eine Stunde. An diesem Punkt wird die Sonden-DNA auf die Goldelektrode Oberfläche über die Bildung einer Thiol-on-gold selbst Monoschicht befestigen. </li><li> Spülen Sie die Elektroden mit DI-Wasser, tauchen sie in 2mm Mercaptohexanol in ein Eppendorf-Röhrchen und lagern Sie sie an einem dunklen Ort für 3 Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur um eine vollständige Bildung des Selbst Monoschicht zu gewährleisten. Dieser Schritt beinhaltet die Mercaptohexanol als Teil einer gemischten Monoschicht auf die Bildung einer stabilen Monoschicht zu gewährleisten. Um zu verhindern, Verdunstung möchten Sie vielleicht die Elektrode in die Eppendorf-Röhrchen Dichtung mit Parafilm. Sensoren können in dieser Lösung für mehrere Tage bei Bedarf gespeichert werden. </li><li> Wenn Sie bereit sind, den Sensor zu verwenden, spülen Sie ihn mit DI-Wasser und dann lassen Sie sie in einem Puffer für mindestens 10 Minuten. Sensoren an Antikörpernachweis Ziel muss auch in einer 100 nM Lösung des entsprechenden Anerkennung Strang vor dem Gebrauch durch eine extrem schnelle Spülen mit Puffer gefolgt getaucht werden. </li></ol> 3. Sensor Testing, DNA-Erkennung <ol><li> In diesem Protokoll ist ein 17 Nukleotidsonde Strang zu einer Goldelektrode fixiert. Es hat eine Methylenblau-Redox-Reporter am 3&#39;-Ende (Abbildung 1). Wenn die Sonde Molekül mit einem Capture-Strang hybridisiert, nimmt der Strom durch den Sensor-Schaltung. </li><li> Spülen Sie eine frische Sensor mit DI-Wasser und tauchen Sie in eine leereProbe fehlt das Ziel, um das Hintergrundsignal es produziert aufzunehmen. Befestigen Sie den Sensor an der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten. Legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und einer Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung. </li><li> Führen Sie einen Rechteck-Messung von 0 bis -0,6 V mit einer Amplitude von 25 mV und einer Schrittweite von 1 mV. Die optimale Rechteck Frequenz wird über die Details der Sonde Architektur 2,3 ab; für die Sonde Architekturen haben wir die optimalen Werte werden typischerweise im Bereich von 60 bis 600 Hz. Sie sollten eine abgerundete Spitze bei etwa -0,35 V, das Redox-Potential von Methylenblau (der Gipfel Potenzial kann leicht verschieben je nach den genauen pH-Wert der Testlösung). Die Höhe von der Grundlinie Strom dieser Peak ist proportional zur Effizienz Elektronen-Transfer zwischen den Methylenblau und der Goldelektrode (Abbildung 2). Speichern Sie diese Hintergrund-Messung. </li><li> Bewegen Sie die Elektroden an einer Lösung, die die Ziel-DNA-Molekül von Interesse enthält, äquilibriert (5 bis 120 min in Abhängigkeit von der Größe, Struktur und Konzentration der target4, 5) und sammeln ein zweites Rechtecksignal voltammagram. Die Höhe des Peaks auf -0,35 V wird von der ersten, Hintergrund Messung ändern. Die Größe dieser Änderung ist es, die Konzentration des Analyten im Zusammenhang. Es ist das wichtigste Output-Daten dieses Sensors (Abbildung 3). </li><li> Messung der relativen Signaländerung, die prozentuale Abnahme oder Zunahme der Signal relativ zum Hintergrund Spitze, ist oft besser reproduzierbar als die Messung der absoluten Veränderung in der aktuellen, da dies korrigiert Variationen in der Oberfläche der Elektrode. Dazu sind die Differenz zwischen dem Spitzenstrom und der Hintergrund Spitzenstrom durch den Hintergrund Spitzenstrom unterteilt. </li></ol> 4. Sensor Regeneration <ol><li> Nachdem Sie Ihre Messungen abgeschlossen sind, bewegen Sie den Sensor in einen Behälter mit DI-Wasser für 30 s gefüllt, oder spritzen sie mit einem stetigen Strom von DI-Wasser für 30 s. Wiederholen Sie diesen noch zwei weitere Male mit frischem deionisiertem Wasser. Hinweis: Einige Analyte sind resistent gegen diesen Ansatz, denn sie versuchen aggressive Spülen in 6 M Guanidin-Hydrochlorid oder 70% Ethanol. </li><li> Setzen Sie den Sensor wieder in eine Lösung, bei der Messungen vorgenommen werden. Innerhalb einer Minute sollte die Peak-Höhe auf den ursprünglichen Wert zurückgekehrt sind. Es ist bemerkenswert, dass diese Sensoren weisen oft eine etwas größere Signaländerung bei ihrem ersten Test-und Regenerationszyklus und sehr konsistente Ergebnisse bei der späteren Zyklen 6. </li></ol> 5. Sensor Testing, Antikörper-Nachweis <ol><li> In diesem Protokoll dient dem Methylenblau und Thiol-modifizierten DNA-Sonde in diesen Sensoren verwendet als &quot;Anker&quot; Strang 7. Es ist direkt an der Goldelektrode angebracht. Dies ist dann mit einer zweiten, &quot;Anerkennung&quot; DNA-Strang, die kovalent an das betreffende Antigen (Abbildung 4) hat hybridisiert. Wir haben viel Glück mit kommerziellen Synthese Häuser wie Biosearch Technologies und Panagene hatte, für die Synthese der benötigten DNA-Antigen-Chimären. Die Hybridisierung wird durch die Übertragung eines vorgefertigten Sensor in ein Eppendorf-Röhrchen mit 100 nM des entsprechenden Anerkennung DNA-Strang in PBS für 1 Stunde durchgeführt. </li><li> Platzieren Sie den Sensor in den entsprechenden Blindprobe. Bringen Sie es zu der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten und legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung. </li><li> Führen Rechteck Voltammetrie wie oben beschrieben. Für die besonderen Sonde Architektur haben wir hier das optimale Rechteck-Frequenz beträgt 60 Hz eingesetzt werden. Sie sollten eine abgerundete Spitze um -0,35 siehe V. Save diesem Hintergrund Messung. </li><li> Übertragen Sie die Elektroden an einer Lösung des Zielanalyten, für 5 bis 60 min inkubieren, und sammeln Sie ein zweites Rechteck voltammagram. Wenn das Ziel Antikörper vorhanden Gipfel von -0,35 V sinkt. Die Größe dieser Änderung ist es, die Antikörper-Konzentration zusammen. </li></ol> 6. Sensor Testing, Small Molecule Detection- <ol><li> In diesem Fall ist das Sondenmolekül auf der Sensoroberfläche ein Aptamer, ein DNA-oder RNA-Molekül, das in vitro ausgewählt wurde, um eine spezifische molekulare Analyten, dass seine Struktur ändert (Falten) nach Bindung an ihren Zielanalyten 8,9 bind ( Abbildung 5). Hier beschäftigen wir einen Kokain-Bindung, DNA-Aptamer durch die Stojanovic 10,11 Labor entwickelt. </li><li> Spülen Sie eine frische Sensor mit DI-Wasser und tauchen Sie es in einer Blindprobe fehlt das Ziel, um das Hintergrundsignal es produziert aufzunehmen. Befestigen Sie den Sensor an der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten. Legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und einer Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung. </li><li> Führen Rechteck Voltammetrie wie oben beschrieben. Für die besonderen Sonde Architektur, die wir hier haben, beschäftigt die optimale Rechteck Frequenz ist 200Hz (Aber 60 Hz funktioniert auch). Sie sollten eine abgerundete Spitze um -0,35 siehe V. Save diesem Hintergrund Messung. </li><li> Übertragen Sie die Elektroden an einer Lösung des Zielanalyten, für ~ 5 min inkubieren, und sammeln Sie ein zweites Rechteck voltammagram. Die Höhe des Peaks auf -0,35 V wird sich ändern. Die Größe dieser Änderung ist es, die Konzentration der Analyt zusammen. Wenn Sie nicht erhalten eine Kokain-Probe, Procain, deren Verwendung nicht reguliert ist, kann als Ersatz verwendet werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Wenn verwendet, um DNA zu erkennen mit der ersten Architektur, sollte das Signal von mindestens 60% verringern, wenn äquilibriert bei 200 nM Ziel. Nach drei kurzen Spülen in deionisiertem Wasser, sollte das Signal sehr nahe return (innerhalb 0,1-5%) auf den ursprünglichen Wert. Antikörpernachweis Sensoren sollten einer Abnahme des Signals um 40 bis 80%. Aptamer-basierte Sensoren für den Nachweis von Kokain zeigen ein Signal von bis zu 200% in Abhängigkeit von der Frequenz und Flächendeckung in denen sie tätig sind. Für die Kokain-Sensor ist eine geringe Flächendeckung besten 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Erkennung von DNA mit einem elektrochemischen DNA-Biosensor. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Screenshot zeigt das Signal von einem E-DNA-Biosensor im Rechteck Voltammetrie produziert. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Screenshot zeigt die Signale von einem E-DNA-Biosensor im Rechteck Voltammetrie produziert, vor und nach der Hybridisierung mit einem Analyten. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Nachweis von Antikörpern mit einem Gerüst Biosensor. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Erkennung von Kokain oder Procain mit einem elektrochemischen Aptamer Biosensors. <table border="1"><tbody><tr><td> Benutzerdefinierte Oligo </td><td> Reihenfolge </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Linear Probe DNA (LP17) </td><td> 5&#39;-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 &#39; </td><td> HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden </td></tr><tr><td> Zielanalyten DNA </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Unverändert </td></tr><tr><td> Recognition Strand </td><td> 5&#39;-Antigen-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 &#39; </td><td></td></tr><tr><td> Scaffold Anchor </td><td> 5&#39;-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7-MB </td><td> HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden </td></tr><tr><td> A4 Cocaine Aptamer </td><td> 5&#39;-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 &#39; </td><td> HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Sonde und Target DNA-Sequenzen.

<ol>
	<li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+electrode-immobilized,+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing.">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li><li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor.">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li><li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry.">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li><li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Probe+Length,+Probe+Geometry,+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor.">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li><li>Lubin, A. A., Plaxco, K. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein?Small+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices.">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li><li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electronic,+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid,+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids.">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li><li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum.">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li><li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine.">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li><li>Stojanovic, M. N., Prada, P. d. e., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine.">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li><li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Reusable,+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum.">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe.">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li><li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Specificity,+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices.">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li><li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices.">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li><li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless,+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA.">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li><li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor.">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li><li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous,+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic,+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor.">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li></ol>

Ein wichtiger Hinweis ist, dass keines der oben beschriebenen Experimente ordnungsgemäß funktionieren, wenn die Elektroden richtig gereinigt worden sein. Hier ist eine Anleitung für unsere elektrochemische Reinigung. Bei der Arbeit mit CH Instruments Potentiostaten, führen wir diese Reinigungsschritte mit einem Satz von drei Makro-Programmen. Phase Zero (E-clean O) Tauchen Sie die Elektroden in 0,5 MH 2 SO 4 und verbinden sie mit der Arbeit Elektroden eines Potentiostaten. Auch legen und tauchen ein Ag / AgCl Referenz-und Platin-Gegenelektrode. Beginnen Sie mit einer Oxidationsstufe (2 V für 5 s) und dann ein Reduktionsschritt (0,35 V für 10 s). Phase One (E-clean 1) Initiieren Oxidation und Reduktion Scans unter den gleichen sauren Bedingungen (0,5 M H 2 SO 4) 0,35 bis 1,5 V (20 Scans mit einer Abtastrate von 4 V / s und eine Probe im Abstand von 0,01 V, die von vier Scans mit einer Abtastrate gefolgt von 0,1 V / s und einem Abtastintervall von 0,01 V). Phase Zwei (E-clean 2) Führt eine Reihe von elektrochemischen Oxidation und Reduktion Scans unter sauren Bedingungen (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4) für vier verschiedene Möglichkeiten reicht (alle für 10 Segmente mit einer Abtastrate von 0,1 V s 1 und eine Probe im Abstand von 0,01 V durchgeführt ): (i) Potentialbereich von 0,2 bis 0,75 V, (ii) Potentialbereich von 0,2 bis 1,0 V; (iii) Potentialbereich von 0,2 bis 1,25 V, (iv) Potentialbereich von 0,2 bis 1,5 V. Viele Arten von Gold-Elektroden können verwendet werden, um diese Experimente durchzuführen. Neben Gold Disk-Elektroden, wie sie hier verwendeten, hatten wir Erfolg mit mikrostrukturierten Goldoberflächen, Golddraht und Gold auf Leiterplatten. Zusammen mit den Sensoren in diesem Papier beschrieben, haben viele andere elektrochemische DNA-Biosensor-Architekturen berichtet worden. Dazu gehören Sensoren mit Pseudoknoten 12, Triple-Strang 13, Sandwich-14, Super-Sandwich 15, oder Triplex-16 Architektur. In Zukunft erwarten wir, dass diese Sensoren in point of care medizinischen Diagnostik verwendet werden. Sie wurden erfolgreich in mehreren mikrofluidischen Bauteilen 17,18 integriert und bieten viele Vorteile gegenüber optischen Analyt-Detection-Systeme. Insbesondere können diese Sensoren in trüben Funktion, optisch dichten und hoch auto-fluoreszierende Proben.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Gold Disk-Elektroden </td><td> CH Instruments </td><td> CHI101 </td><td> Kann wieder verwendet werden </td></tr><tr><td> Synthetische DNA-Sonde </td><td> Biosearch Technologies </td><td> Brauch </td><td></td></tr><tr><td> Synthetische Ziel-DNA </td><td> Sigma Genosys </td><td> Brauch </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> An einem kühlen dunklen Ort </td></tr><tr><td> Platinelektrode </td><td> BASI </td><td> MW-1032 </td><td> Kann wieder verwendet werden </td></tr><tr><td> Ag / AgCl Referenz </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td><td> Kann wieder verwendet werden </td></tr><tr><td> Poliertuch </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Alumina polnischen </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instruments 605A </td><td> CH Instruments </td><td> 605A </td><td> Verwenden Sie Potentiostaten </td></tr><tr><td> Newborn Calf Serum </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Eingefroren gelagert </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Verwenden Sie keine UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Eingefroren gelagert </td></tr><tr><td> Kokain </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA Lizenz erforderlich </td></tr><tr><td> Procain </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Ersatz für Kokain </td></tr><tr><td> Anti-Flag Antikörper </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of electrochemical-dna biosensors for the reagentless detection of nucleic acids, proteins and small molecules

Als Medizin derzeit praktiziert wird, schicken Ärzte Proben an ein zentrales Labor für die Prüfung und muss daher Stunden oder Tage warten, um die Ergebnisse zu erhalten. Viele Patienten würden besser durch schnelle, Nachttisch-Tests serviert werden. Zu diesem Zweck unser Labor und andere haben ein vielseitiges, Reagenzienfreier Biosensor-Plattform, die quantitative, Reagenzienfreier, elektrochemische Detektion von Nukleinsäuren (DNA, RNA), Proteine ​​(einschließlich Antikörper) und kleinen Molekülen Analyten direkt in unverarbeiteten klinischen und Umweltproben unterstützt entwickelt. In diesem Video zeigen wir die Herstellung und Verwendung von mehreren Biosensoren in diesem &quot;E-DNA&quot;-Klasse. Insbesondere fertigen wir und zeigen, Sensoren für die Detektion einer Ziel-DNA-Sequenz in einer Polymerase-Kettenreaktion Mischung, eine HIV-spezifische Antikörper und die Droge Kokain. Die Vorbereitung Verfahren erfordert nur drei Stunden von Hands-on-Aufwand durch eine Inkubation über Nacht folgte, und ihre Verwendung erfordert nur wenige Minuten.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

&quot;E-DNA&quot;-Sensoren, Reagenzienfreier haben elektrochemische Biosensoren, die gute Leistungen, auch wenn direkt in Blut und anderen komplexen Matrices in Frage gestellt, um den Nachweis einer Vielzahl von Nukleinsäure-, Protein-und Small Molecule Analyten angepasst. Hier präsentieren wir ein allgemeines Verfahren für die Herstellung und Verwendung solcher Sensoren.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

fabrication-electrochemical-dna-biosensors-for-reagentless-detection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.0K Aufrufe.  University Of California Santa Barbara. "E-DNA"-Sensoren, Reagenzienfreier haben elektrochemische Biosensoren, die gute Leistungen, auch wenn direkt in Blut und anderen komplexen Matrices in Frage gestellt, um den Nachweis einer Vielzahl von Nukleinsäure-, Protein-und Small Molecule Analyten angepasst. Hier präsentieren wir ein allgemeines Verfahren für die Herstellung und Verwendung solcher Sensoren.

Serie: Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Forschung

Biotechnik

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

Experimenteller und Datenanalyse-Workflow für die Nanoindentation weicher Materie

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...