We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

HINWEIS: Alle Experimente wurden von der University of Ottawa Animal Care Ethikkommission genehmigt wurde, zu den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care haften. 1. Präoperative Vorbereitung und Materialien <ol><li> Plasmidpräparation: <ol><li> Bereiten Plasmiden unter Verwendung des Qiagen MegaPrep nach dem Protokoll des Herstellers. Innoculate mindestens 400 ml LB-Medium mit transformierten Bakterien, um eine hohe DNA-Ausbeute zu gewährleisten und Inkubation über Nacht. </li><li> Resuspendieren Plasmid in 100-200 ul TE auf eine Endkonzentration von wenigstens 5 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l. Aliquoten DNA und bei -20 ° C. Wenn die Konzentration zu niedrig ist, nicht ausfallen und Resuspendieren da dies Verunreinigungen hinzufügen. Starten Sie mit einem neuen Präparat. </li><li> Vor der Operation, verdünnte ein einzelnes Plasmid (Cre-GFP zum Beispiel) zu 2 ug / ul in sterilem Wasser mit 1 &amp; mgr; l von 0,1% (w / v) Fast Green Farbstoff pro 10 oder 20 &amp; mgr; l verdünnt Plasmidlösung. Wenn GFPund das Gen von Interesse sind, auf getrennten Plasmiden co-elektroporiert werden, spritzen die GFP-Plasmid und das Plasmid, das das Gen von Interesse in einem Verhältnis von 1: 4, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass alle mit GFP markierten Zellen werden mit beiden co-elektroporiert Plasmide. </li></ol></li><li> Ziehen Glas Mikrokapillarröhrchen (1 mm Außendurchmesser - im Folgenden als Nadeln bezeichnet) auf einem Standard-Nadelzieher, mit einem einzigen Schritt Pull bei 62 ° C. </li><li> Autoklavieren eine chirurgische Packung, die die folgenden: Nadelhalter, Wundhaken, Zangen, Scheren für die Chirurgie, Scheren für Nadeln, Hefter, Heftklammern, Gaze, Wundabdeckungen, OP-Abdeckungen (1A, B, Werkstoff-Tabelle). </li><li> Sammeln Sie anderen erforderlichen Werkzeuge: Electroporator, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 oder 7 mm), Kochsalzlösung, Naht, 5-ml-Spritze (Werkstoff-Tabelle). </li></ol> 2. Bereiten Maus für Chirurgie <ol><li> Zur Schmerztherapie, spritzen ein zeitlich-pregnant Maus mit Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) eine Stunde vor der Operation. Wenden Sie dieses Protokoll, um Mäuse überall von embryonalen Tag 12,5 (E12.5) E17.5 zeitgleich. </li><li> Verwenden Sie Microloader Pipettenspitzen zu Back-Last gezogen Nadeln mit dem Plasmid-Lösung. Nicht ganz zu füllen nicht in die Spitze der Nadel noch da sonst die Nadel verstopft zu werden. </li><li> Betäuben Maus unter Verwendung von 2-5% Isofluran Gas mit 1 l / min O 2. Sobald unbeweglich, legen Sie in der Gesichtsmaske und wenden Salbe die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Injizieren mit 1 ml Salzlösung (0,9% NaCl) subkutan im Rücken. HINWEIS: Bei der Arbeit mit Isofluran Gas, mit einem Gas-Scavenger, um überschüssiges Gas zurückerobern und verhindern, dass sie an der Flucht in den Raum. </li><li> Rasur Bauch. Waschen Sie Bauch mit Chlorohexadine Peeling, mit Wasser abspülen, und tragen Sie eine endgültige Lösung von prep chlorohexadine und 70% Ethanol. Abdeckung Maus mit sterilen Tuch oder Gaze zu Pelz ab, sondern lassen Leib ausgesetzt sind (Abbildung 1 C, D). </li></ol>In utero Elektroporation <ol><li> Einen Einschnitt in die Haut über dem Bauch zwischen den unteren Zitzen. Ziehen Sie die Haut von der zugrunde liegenden Muskelschicht durch Abreißen des Bindegewebes, dann durch das Bauchfell geschnitten in die Bauchhöhle entlang der Linea alba. Legen Sie die Wundhaken, um die Wundränder auseinander zu ziehen. </li><li> Entfernen Sie die Gebärmutter aus der Bauchhöhle und legte es wie gezeigt (Abbildung 1E). <ol><li> Wenn verschiedene Welpen mit verschiedenen Plasmiden (wie GFP gegen GFP mit dem Gen von Interesse) eingespritzt werden, zählen die Jungen auf jeder Seite und entscheiden, welche und wie viele mit jedem Plasmid injizieren. Ersetzen Sie eine Seite der Gebärmutter wieder in den Bauch, um die Embryonen warm und geschmiert zu halten. Sofort befeuchten ausgesetzt Gebärmutter mit Kochsalzlösung (vorzugsweise auf Körpertemperatur erwärmt). </li><li> Wenn die Injektion alle Welpen mit dem gleichen Plasmid (wie bei der Injektion Cre-GFP in transgenen Embryos) only entfernen ein Horn des Uterus zu einer Zeit. </li></ol></li><li> Setzen Sie einen geladenen Nadel im Spannkopf der Spritzstab und schneiden Sie vorsichtig die Spitze mit einem Paar von kleinen chirurgischen Schere oder feinen Pinzette. Schneiden Sie die Spitze, so dass die Nadel bleibt so lange wie möglich, während immer noch damit Fluid durch (Abbildung 1ji-iv) übergeben. <ol><li> Verstellbaren Länge der Injektion (in Sekunden) und der Einspritzdruck am Mikroinjektor so daß ein kleines, leicht sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 &amp; mgr; l wird auf der Spitze der Nadel, wenn der Fuß Paddel gedrückt. Halten Sie die Lautstärke dieses Tröpfchen so konsistent wie möglich zwischen verschiedenen Nadeln. Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben Embryo (siehe Diskussion). </li><li> Verwenden Sie die folgenden Einspritzparameter für den FemtoJet: Injektion Druck (pi) = 250-300 hPa; Einspritzzeit (ti) = 0,8-1,2 sec; Kompensationsdruck = 10 bis 50 hPa. Falls erforderlich, stellen Sie diese Parameter, um Unterschiede zwischen den Nadeln unterzubringen. </li></ol></li><li> Swählt einen Embryo und sanft positionieren Sie es auf dem Rücken, den Kopf nach oben geneigt (1F). HINWEIS: Dies kann erfordern, Drehen oder Verschieben des Embryos; darauf achten, nicht zu viel Druck anwenden und vermeiden Ruptur der Fruchtblase, während die Manipulation des Embryos. </li><li> Sobald der Embryo vorhanden ist, suchen Sie die Herzkammer, die als halbmondförmigen Schatten parallel zum Sinus sagittalis präsentiert. Berühren Sie die Spitze der Nadel in die Gebärmutter über der Herzkammer in einem leichten Winkel und führen Sie die Nadel durch die Gebärmutterwand. Der erforderliche Druck hängt von der Schärfe der Nadel. Die Nadel in die Rinde in die Herzkammer. HINWEIS: Auch wenn es selten jede zusätzliche nachweisbar Widerstand, Leiter des Embryos wird oft weg leicht geschoben und dann zurückweicht, wenn die Nadel durch die Rinde in die Herzkammer führt. </li><li> Pumpen Sie den Fuß Paddel, um das Plasmid-Lösung zu injizieren. Weiter zu pumpen, bis ein grüner Bereich sichtbar und entspricht derBogenform des Ventrikels (Figur 1G). In jungen Embryonen (E12.5 bis E14.5) der Farbstoff oft diffundieren in die kontralaterale Ventrikels. HINWEIS: Die Anzahl von Pumpen ist abhängig vom Durchmesser der Nadelspitze, dem Alter des Embryos (und resultierende Größe des Ventrikels) und dem gewünschten Einspritzvolumen. Halten Volumen zwischen Embryonen injiziert so konsistent wie möglich. </li><li> Injizieren drei oder vier Embryonen. Bewahren Sie alle exponierten Embryonen feucht mit Kochsalzlösung im gesamten Verfahren. </li><li> Zurück zu den ersten Embryonen injiziert und legen die Paddel, so daß die positive Elektrode, die das Plasmid in die gewünschte Region des Gehirns (Abbildung 1H) ziehen. Winkel der negativen Elektrode, so dass der kürzeste Weg zwischen den Elektroden direkt durch die Struktur zur Elektroporation gezielte (Abbildung 2). </li><li> Sobald die Paddel sind vorhanden, wenden Sie den Schock. Je nach Alter und Größe des Embryos, nutzen 5 Impulse von 35-50 V (siehe TLage 1). Verwenden Sie die folgenden Elektroporationsparameter: Impulslänge von 5 ms mit einer Impulspause von 950 ms. Wiederholen Sie dies mit allen injizierten Embryonen. </li><li> Schneiden Sie die Spitze der neuen vorinstallierten Nadel, wie in Schritt 3.3 als die letzte Nadel wahrscheinlich, getrocknet und im Schritt 3.9 verstopft. Injizieren Sie die nächste Gruppe von drei oder vier Embryonen entweder mit dem gleichen Plasmid oder einem anderen Plasmid und dann den Schock wie in Schritt 3.9. Wenn alle Welpen in einer Seite der Gebärmutter injiziert werden, entfernen Sie die zweite Seite der Gebärmutter von Bauch des Weibchens und ersetzen Sie dann die fertige Seite, um sie warm zu halten. </li><li> Zurück auf beiden Seiten der Gebärmutter auf die weibliche darauf achten, die Oberfläche feucht mit Kochsalzlösung und nicht zu halten, um zu viel Druck, um Verletzungen der Fruchtblasen zu verhindern. Naht der Muskelschicht geschlossen mit einem einfachen kontinuierlichen Stich. Staple die Haut verschlossen. Wenn Heftklammern nicht verfügbar sind, nähen die Haut mit einer einfachen unterbrochenen Stich. (1I) </li><li> Während suturing, schrittweise reduzieren Sie die Isofluran-Narkose, damit der schwangeren Weibchens zu erhellen. Hinweis: Dies wird Erregung des Dammes zu beschleunigen, nachdem die Operation abgeschlossen ist; Halten des weiblichen für so kurze Zeit wie möglich wird Embryo Überleben verbessern betäubt. Gesamtoperationszeit, ab wann sich der weibliche zunächst betäubt, sollte ca. 30 min. </li></ol> 4. Nachsorge <ol><li> Legen Sie die Naht weiblichen in einem Brutschrank oder auf einem Heizkissen, um aus der Narkose zu erholen. Bed sie auf saubere Bettwäsche und legen Sie ein Standard-Recovery-Gel in den Käfig zu halten Feuchtigkeit. Für die Schmerztherapie nach einer Operation, ergeben die weiblichen drei Dosen von Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) in 8 Stunden Intervallen nach der Operation erhalten die vier zusätzlichen Dosen in 12 Stunden Intervallen. </li></ol> 5. Ernten Brains HINWEIS: Brains kann in jedem Alter bis zum Erwachsenenalter geerntet werden. Es giltzum Sammeln Gehirn vor der Geburt. Beachten Sie, dass einmal Welpen geboren werden, die Reihenfolge in der Gebärmutter ist verloren, also entweder alle Welpen im Wurf mit der gleichen Plasmid injiziert werden, oder ein anderes Verfahren zur Differenzierung zwischen Kontroll- und Versuchstiere müssen entwickelt werden. <ol><li> Bereiten kaltem (4 ° C) und filtriert, 4% Paraformaldehyd (PFA) vor euthanizing weiblich. </li><li> Euthanize das weibliche Verwendung einer intraperitonealen Injektion einer letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht) und aufgeschnitten Abdomen. Ziehen Sie beide Seiten der Gebärmutter und das Layout wie der Jungtiere zunächst injiziert. <ol><li> In dem Fall, wo alle Jungtiere erhielten die gleiche Plasmid wie beim Injizieren Cre zu einer transgenen Wurf ist Embryo Reihenfolge unwichtig, deshalb schneiden den Uterus aus dem weiblichen und in PBS. </li><li> Bei Jungtieren wurden mit verschiedenen Plasmiden injiziert ist, lesen Sie jeden Welpen zu finden und stellt fest, tote Jungtiere, und festzustellen, welche mit Steuer und experimen injiziert wurdental Plasmiden vor dem Entfernen der Gebärmutter vom Weibchen. Achten Sie darauf, den Überblick zu behalten, welche Welpen zu welcher Gruppe nach der Uterus in PBS. </li></ol></li><li> Nehmen Sie jedes Welpen einzeln, enthaupten mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge und legen den Kopf in PBS. Im Falle von transgenen Mäusen, sammeln Gewebeproben für die Genotypisierung und halten jeden Kopf getrennt, wie in einer 12-Well-Platte. </li><li> Unter einem Binokular, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, man aufpassen, nicht nick die Rinde oder reißen die Mittellinie. Mit einem Fluoreszenzmikroskop, prüfen Sie, ob Gehirne haben eine GFP + Patch, was darauf hinweist, dass sie erfolgreich elektroporiert wurden. </li><li> Fix Gehirn durch Eintauchen in PFA bei 4 ° C über Nacht. HINWEIS: Überprüfen Sie Gehirne für die Expression von GFP vor der Fixierung seit PFA oft das Signal löscht. </li><li> Cryoprotect Gehirn durch Eintauchen in 20% Saccharose für mindestens drei Tage vor dem Einfrieren. Verwenden einen Saccharosegradienten von 10%, 15% und 20% (24 h in jeder Lösung) to verhindern Gewebeschädigung durch osmotischen Druck. Bewahren gefrorenen Gehirne bei -80 ° C und auf einem Kryostat geschnitten auf 10-14 um dicke Abschnitte. </li></ol> 6. Co-Färbung mit anti-GFP HINWEIS: Wenn Antigen-Retrieval, um Co-Fleck mit anti-GFP notwendig ist, ist es wichtig, eine schonende Antigen-Retrieval-Protokoll, das die GFP-Signal nicht beeinträchtigt verwenden. Einige Antigen-Retrieval-Protokolle sind zu hart, um in Verbindung mit der GFP-Färbung (sogar mit einem Antikörper gegen GFP) zu verwenden. Eine grundlegende Zitronensäure Vorbehandlung vor dem Aufbringen des primären Antikörpers ist erfolgreich für die meisten Epitope 24. <ol><li> Machen Sie eine 0,01 M Lösung von Zitronensäure in ddH 2 O. pH 6 unter Verwendung eines kalibrierten pH-Meters. </li><li> Wärme Zitronensäure in Färbung Kammer in Mikrowelle oder Wasserbad, bis Zitronensäure erreicht 75 bis 80 ° C. Legen Sie Folien in Färbung Kammer für 10-15 min. Haltetemperatur so stabil wie möglich. </li><li> Waschen Sie Dias in PBS3x für 3 min bei Raumtemperatur. Übernehmen Sie die primären Antikörper und fahren Sie mit Immunfärbung nach einem Standardprotokoll. </li><li> Bestätigen Cre vermittelte Exzision durch Co-Kennzeichnung für GFP und des Gens von Interesse zu bestätigen, knock down (3A). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

Zwei der wichtigsten Herausforderungen bei der Durchführung in utero Elektroporationen sind 1) verhindert Embryoletalität und 2) abnehmende Variabilität zwischen Elektroporationen. Einer der wichtigsten Faktoren bei der Vermeidung Letalität ist Nadelqualität, da stumpfe Nadeln verursachen mehr Schaden an dem Embryo. Beim Schneiden der Nadel, halten Sie die Spitze so lange wie möglich während immer noch eine sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 &amp; mgr; l der Flüssigkeit zu erscheinen im Anschluss an eine ...

Radial Migration ist ein zentraler Prozess zur frühen kortikalen Entwicklung. Es hängt von einer Vielzahl von Zell autonomen Faktoren wie korrekte mitotischen Ausfahrt und die neuronale Differenzierung, Zellpolarität, die Regulierung des Zytoskeletts und die Expression des Transmembran-Rezeptoren, wie auch nicht-zell autonomen Faktoren, wie die Bildung von radialen Gliazellen Gerüst und Sekretion der Migrationsberatung Moleküle 1-3. Da Störungen einer dieser Mechanismen neuronaler Migration in einem transgenen Mausmodell 4-8 In utero Elektroporation (IUE) beeinträchtigt, die Bestimmung der Ursache eines Fehlers in der Migration kann ein komplexer und schwieriger Prozess sein. Kann verwendet werden, zu ergänzen und zu vereinfachen Interpretation des Phänotyps einer genetischen Knock-out-Modells und damit wichtige Mechanismen aufzuklären radiale Migration 7,9-11 erforderlich. In utero Elektroporation (IUE) ist der Vorgang, bei dem ein Plasmid carryi<html> ng sowohl ein Gen von Interesse und ein Reportergen in die Ventrikel des Gehirns eines Maus oder Rattenembryo injiziert und dann in die Zellen der Herzkammer durch Anwendung eines elektrischen Stroms 12-14 gezogen. Dies ermöglicht dem Prüfer, die Wirkung der nach oben oder unten Regulation eines Gens von Interesse in der Entwicklung oder Funktion elektroporiert Neuronen zu analysieren. Nach IUE können Gehirne für die Immunhistochemie 7,9-11, Elektrophysiologie 15 oder Zellkultur 16,17 verarbeitet werden. Der große Vorteil ist, dass IUE wird ermöglicht hochspezifische Manipulation der Genexpression. Weiterhin kann IUE verwendet, um einen bestimmten Bereich des sich entwickelnden Gehirns durch einen gerichteten Strom (Abbildung 2) zu zielen. IUE können auch verwendet werden, um einen spezifischen Zelltyp, durch Injektion von Plasmiden, die Gene unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren oder Plasmid Aktivierungssysteme abzuzielen (Tetracyclin induzierte Genexpression ist ein Beispiel) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE kann in Verbindung mit dem Cre-Lox-vermittelten Gen Exzision System 7-9,11,22 verwendet werden. kann ein Plasmid, das ein Gen, das die Nachricht für die Cre-Protein kodiert, in einen Embryo homozygot für das Allel floxed (elektroporiert werden in denen das Gen oder spezifische DNA-Regionen werden durch zwei loxP-Stellen für Cre-vermittelte DNA-Rekombination) flankiert. Cre dann induzieren Rekombination des Gens von Interesse spezifisch in elektroporiert neuralen Vorläuferzellen, Erzeugen eines Knock-out des floxed allele.The Wirkung Protein auf neuronale Migration und Entwicklung in einzelnen Neuronen Knockdown kann dann untersucht werden. Die Elektroporation von Cre Rekombination induziert in nur einer kleinen Population von betroffenen Zellen, so dass die Unterstützung von Umwelt intakt. Im Gegensatz dazu gewebespezifische Expression von Cre unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotor, tritt während des gesamten Gewebes, so daß beide Migration Neuroblasten und der Umgebung beeinträchtigt werden. So juxtaposition dieser beiden Ansätze können bestimmen, ob ein bestimmter Migrationsdefekt aufgrund autonomer oder Zell nicht autonomen Mechanismen der Zelle ist. Defekte Migration in beiden experimentellen Systemen legt nahe, dass die beobachteten Phänotyp resultiert aus einer Zelle autonom Mechanismus; normaler Migrations nach Elektroporation von Cre mit defekten Migration auf eine gewebespezifische Cre Modell zeigt, dass das Gen von Interesse durch eine nicht-zell autonomen Mechanismus wirkt. IUE kann auch verwendet werden, um Rettungsversuche durch Elektroporation potenzielle Interaktion von Genen in Knock-out-Tiere 7,9,10 durchzuführen. Zum Beispiel könnte ein Forscher versucht, eine Migration Phänotyp in einer transgenen Modells durch Elektroporation ein stromabwärtiges Ziel und Bestimmen, ob die Migration Defekt in elektroporierten Neuronen korrigiert retten. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass ein erfolgreicher Rettungs zeigt an, daß normale Migration kann durch Manipulieren der Proteinexpression in einer spe wiederhergestelltsche Neuron, obwohl die Umgebung noch defizient Zielgens. Wiederum ist dieser Ansatz mehr Zeit und kostengünstiger als die Kreuzung oder transgene Linien, mit dem zusätzlichen Vorteil der Bestimmung, ob der defekte Mechanismus Zelle autonom. IUE verwendet werden, um die Migration zu verfolgen Neuronen durch Elektroporation von einem Reporter-Plasmid in Knock-out-Embryonen (4C) werden. Da nur die Neuronen Auskleidung der Herzkammer zu der Zeit der Operation werden elektroporiert 17 kann IUE verwendet, um die Nervenzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt mit dem Vorteil der Visualisierung ihrer Morphologie in vivo geboren folgt. Schließlich ist es möglich, IUE wie der medialen oder dorsalen Telencephalon, Hippocampus oder Ganglienhügel (Abbildung 2) zu verwenden, um Hirnregionen gezielt. Dies gibt Forschern die Möglichkeit Genfunktion in einem bestimmten Bereich unabhängig von Komplikationen zu untersuchendie sich aus Protein in benachbarten Strukturen Knockdown. Retinoblastom Protein (pRb), p107 und p130 umfassen die Tasche Proteinfamilie und sind gut etabliert Regulatoren des Zellzyklus zu beenden. Allerdings gibt es immer mehr Anzeichen dafür, dass diese Proteine ​​des Zellzyklus unabhängige Aspekte der neuralen Entwicklung regulieren auch. Wie wir bereits gezeigt haben, pRb und p107 spielen eine entscheidende Rolle in beiden tangentialen 4,23 und radiale Migration 6. Hier zeigen wir die Rolle der Tasche Proteinfamilienmitglieder pRb und p107 neuronaler Migration 6, den Einsatz von in utero Elektroporation von Cre in einem transgenen Modell veranschaulichen. Zusammengefasst stellt IUE eine leistungsfähige Möglichkeit zum Analysieren Zelle autonom Wirkungen der Gen-Deletion (oder Überexpression). Wenn mit gewebespezifischen Knock-out-Modelle kombiniert werden, können IUE zusätzliche Informationen über die Mechanismen, die neuronale Migration bieten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

Genetische Löschen mit Hilfe des Cre-Lox-System in transgenen Mauslinien ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Proteinfunktion zu untersuchen. Außer in sehr spezifische Cre-Modelle, Deletion eines Proteins während eines Gewebe- oder Zellpopulation führt häufig zu komplexen Phänotypen aus mehreren zusammenwirkenden Mechanismen resultieren. Bestimmen, ob ein Phänotyp Ergebnisse Störung einer Zelle autonom Mechanismus, der untrennbar mit der betreffenden Zelle, oder von einem nicht-zellautonomen Mechanismus ein, wodurch Beeinträchtigung der Umgebung dieser Zelle führen würde, kann schwer zu erkennen sein. Um einen Einblick in die Proteinfunktion in einem in vivo-Kontext zu ermöglichen, in utero Elektroporation (IUE) ermöglicht Gendeletion in einer kleinen Untergruppe von Zellen innerhalb des Entwicklungsrinde oder einem anderen ausgewählten Hirnregion. IUE können bestimmte Gehirnbereiche, einschließlich der dorsalen Telencephalon, Endhirn medialen, Hippocampus oder Ganglienhügel zielen werden. Dies erleichtert die Beobachtung of die Folgen der Zelle autonom Gendeletion im Rahmen einer gesunden Umwelt. Das Ziel des Protokolls ist es, zu zeigen, wie IUE können zur Unterscheidung zwischen den Zell autonom und nicht zell autonome Wirkungen von Protein Löschung verwendet werden, um einen Defekt in radiale Migration in einer floxed transgene Mauslinie zu analysieren, mit einem Schwerpunkt. Durch den Vergleich des Phänotyps, die aus Gen-Deletion innerhalb des gesamten Kortex im Vergleich IUE-vermittelte Gen-Deletion in einem begrenzten Zellpopulation, einen besseren Einblick in die Proteinfunktion in der Entwicklung des Gehirns kann als mit beiden Techniken in Isolation erreicht werden.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

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Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Induktion der Protein Deletion Durch<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.1K Aufrufe.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Serie: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...