NEPTUNE ermöglicht das Targeting und die genetische Manipulation des embryonalen Nervensystems der Maus ab dem embryonalen Tag 7.5 und ermöglicht die Erstellung von Knockdown- oder Linienverfolgungsmodellen in Tagen. Dieses Protokoll ist anpassungsfähig, flexibel und schnell. Wir können shRNA-, cdRNA- oder Barcode-Virusbibliotheken liefern, um verschiedene Fragen in Tagen statt Monaten oder Jahren zu beantworten.
Wir erwarten, dass NEPTUN Einblicke in die Neurowissenschaften liefern wird, aber es kann auch an andere Organsysteme angepasst werden. Die Identifizierung der Fruchthöhle kann ziemlich schwierig sein, also nehmen Sie sich Zeit, um sich das Ultraschallbild anzusehen und vielleicht ein Lehrbuch oder eine andere Anatomieressource zur Hand zu haben. Um mit dem Laden der Nadel zu beginnen, schieben Sie die Glasnadel auf den Metallkolben und halten Sie die Spannzange befestigt, aber leicht gelöst.
Schieben Sie dann die Kapillarnadel zusammen mit dem Metallkolben durch die vordere Dichtung, bis sie den Abstandshalter erreicht. Drücken Sie Leer, um den Kolben in die Nadel zu drücken und das Öl aus der Nadelspitze zu entfernen. Drücken Sie dann Füllen, um eine Luftblase zu erzeugen, die das Öl und die Lösung teilt.
Senken Sie schließlich die Nadel, tauchen Sie die Spitze in die Lösung und drücken Sie erneut Füllen, um die Nadel zu laden. Nach der Fixierung einer betäubten weiblichen Maus mit Fruchtwasserhöhlen in idealer Größe auf dem Heiztisch Augengel auf beide Augen auftragen, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, und subkutan ein Schmerzmittel injizieren. Sterilisieren Sie dann den Unterbauch, indem Sie ihn mit einem mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Chlorhexidinlösung getränkten Tuch abwischen und die Haut trocknen.
Als nächstes machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 1,5 bis 2 Zentimeter großen vertikalen Mittellinienschnitt im Unterbauch. Dann heben Sie die Haut sanft an und befreien Sie sie von der darunter liegenden Muskelschicht etwa einen Zentimeter um den Schnittpunkt, um das Nähen nach der Operation zu erleichtern. Als nächstes machen Sie einen einen Zentimeter vertikalen Mittellinienschnitt in die Muskelschicht.
Heben Sie mit einer Pinzette eine Seite der Haut und der Muskelschicht an und suchen Sie mit einem anderen Paar nach den Gebärmutterhörnern. Halten Sie dann mit einer Pinzette das Gewebe zwischen den Embryonen und ziehen Sie vorsichtig beide Gebärmutterhörner aus dem Bauch. Zählen und nummerieren Sie die Embryonen, entweder vom Eierstock bis zum Gebärmutterhals oder vom Gebärmutterhals bis zum Eierstock, auf beiden Seiten.
Als nächstes drücken Sie mit einem feuchten Wattestäbchen alle Embryonen vorsichtig zurück in die Bauchhöhle, mit Ausnahme der ersten drei, die injiziert werden sollen. Geben Sie dann einen Tropfen PBS auf eine elastische Membran, die an die runde zentrale Öffnung einer handelsüblichen modifizierten Petrischale geklebt ist, und halten Sie sie unmittelbar über die Embryonen. Führen Sie geschlossene Pinzetten in den Einschnitt des Gummibandes ein, lassen Sie dann die Pinzette los, um den elastischen Einschnitt zu öffnen, und lassen Sie die Flüssigkeit auf die Embryonen fallen.
Ziehen Sie mit einer Pinzette den Abschnitt der Gebärmutter, der den drei Embryonen entspricht, durch das Gummiband und setzen Sie die Petrischale vorsichtig auf den Bauch der Maus. Sichern und befestigen Sie die Petrischale mit vier Lehmfüßen über dem Bauch, um den Druck auf die Maus zu reduzieren und die Empfindlichkeit der Bildgebung auf die Atmung und den Herzschlag der Maus zu reduzieren. Als nächstes passen Sie mit einer Pinzette und einem feuchten Wattestäbchen die Gebärmutter und das Gummiband an, um sicherzustellen, dass das Gummiband um die Haut der Maus versiegelt ist und PBS-Leckagen verhindert.
Um den Uterus zu fixieren, drücken Sie den Modelliertonzylinder rechts von den Embryonen oder der Gebärmutter und fügen Sie PBS zur Petrischale hinzu, bis die Embryonen und die Gebärmutter vollständig mit dem PBS bedeckt sind. Um die Aufzeichnung der Injektionen zu erleichtern, tauchen Sie die Ultraschallsonde in das PBS und stellen Sie die Maus oder den OP-Tisch so ein, dass der erste Embryo mit der Ultraschallsonde ausgerichtet ist. Scannen Sie alle drei Embryonen und untersuchen Sie die Fruchtwasserhöhlen.
Messen Sie dann mit dem Ultraschallgerät den Durchmesser der Fruchthöhle, um das geeignete Injektionsvolumen zu bestimmen. Stellen Sie mit dem Einspritzregler die ermittelten Injektionsvolumina und die Einspritzgeschwindigkeit auf verlangsamt ein, mit einer Einspritzrate von 23 Nanolitern pro Sekunde. Nachdem Sie die Nadel mit den Haupträdern des Schienensystems in das PBS gesenkt haben, drücken Sie auf dem Nanoinjektor-Controller auf Empty (Leer), bis die Flüssigkeit die Nadelspitze erreicht.
Heben Sie dann die Nadel aus dem PBS und drücken Sie Inject, um zu überprüfen, ob ein Tropfen des ungefähren gewünschten Volumens entladen wird. Senken Sie die Nadel wieder in das PBS und bewegen Sie den Nanoinjektor mit dem Y-Ebenenrad am Mikromanipulator, um die Nadel mit der Ultraschallsonde und dem Embryo auszurichten. Stellen Sie den Nadelwinkel mit dem Einspritzwinkelrad ein, um einen nahezu senkrechten Injektionswinkel relativ zur Gebärmutterwand zu gewährleisten.
Führen Sie dann mit dem Injektionsrad des Mikromanipulators die Nadel in einer Bewegung in die Fruchthöhle ein. Wenn die Nadelspitze aus dem Ultraschallbild verschwindet, bewegen Sie die Sonde nach vorne oder hinten, um die Nadel wieder scharf zu stellen. Injizieren Sie dann das gewünschte Volumen, indem Sie Inject für die entsprechende Anzahl von Malen drücken.
Nachdem das erforderliche Volumen injiziert wurde, warten Sie 5 bis 10 Sekunden, bevor Sie die Nadel mit einer sanften Bewegung zurückziehen. Verschieben Sie das Stadium zum nächsten Embryo und wiederholen Sie die Injektion für die anderen beiden Embryonen wie gezeigt. Als nächstes heben Sie die Ultraschallsonde und die Nadel mit dem Mikromanipulator aus dem PBS und drehen Sie die Nadel vom Bediener weg, um Schäden und Verletzungen zu vermeiden.
Setzen Sie den ersten und zweiten Embryo mit einer Pinzette zurück in den Bauch, indem Sie sie sanft durch das Gummiband drücken. Greifen Sie dann vorsichtig das Gewebe neben dem dritten Embryo und ziehen Sie die Gebärmutter zum oberen Ende des elastischen Einschnitts. Ziehen Sie den vierten bis sechsten Embryo vorsichtig mit einer Pinzette hoch und lassen Sie den dritten Embryo wieder in den Bauch eintreten.
Nachdem alle Embryonen mit optimalen Fruchtwasserhöhlen injiziert wurden, drücken Sie die Embryonen und die Gebärmutter vorsichtig zurück in den Bauch der Maus. Die erfolgreiche Transduktion der Neuralplatte führt zu Embryonen mit starker Expression eines fluoreszierenden Reporters im Gehirn und anderen Ektoderm-abgeleiteten Geweben wie Haut. Die Injektion zu hoher Volumina kann zu Neuralrohrdefekten wie Exenzephalie führen.
Erfolgreiche Injektionen am Embryonaltag 7,5 führen zu einer gleichmäßigen Transduktion vom Vorderhirn zum Hinterhirn, einschließlich des Plexus choroideus. Injektionen von niedrigem Titer führen zur Transduktion von einzelligen Klonen, während das Virus mit hohem Titer fast 100% des gesamten Gehirns transduziert. Koronale Schnitte durch embryonale Tag 13,5 Embryonen zeigten eine hohe und gleichmäßige Transduktion von Nervengewebe des Auges, der Linse, der Hornhaut und des Mesenchyms.
Nach der Injektion am Embryonaltag 9,5 entwickeln sich Speicheldrüsen und -gänge um den embryonalen Tag 11,5 aus dem Mundepithel. Das linguale Epithel der Zunge ist gut transduziert, während das darunter liegende Mesenchym negativ ist. Darüber hinaus sind die positiven Cluster innerhalb des lingualen Epithels durch negative Abschnitte getrennt, was auf eine Transduktion der papillaren Oberfläche hindeutet.
Injektionen am Embryonaltag 7.5 führen zu einer weit verbreiteten Transduktion des Zungenmesenchyms am embryonalen Tag 13.5, was darauf hindeutet, dass frühe Injektionen auf Neuralleistenzellen abzielen und zum Mesenchym in der Zunge beitragen. Lentivirale Injektionen führen auch zu einem weit verbreiteten Targeting des zentralen und peripheren Nervensystems und übertragen sowohl Neuronen und Vorläuferzellen im Rückenmark als auch die dorsalen Wurzelganglien. Eine gute Vorbereitung ist unerlässlich.
Stellen Sie sicher, dass keine Leckagen auftreten und dass die Embryonen gut fixiert sind, damit Sie sich ganz auf die Injektionen in die Rattenhöhle konzentrieren können. Nach NEPTUN kann die Analyse mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, z. B. mit Immunfluoreszenzanalyse des Gehirns, Einzelzell-RNA-Sequenzierung oder der Geburt der injizierten Embryonen zur Verhaltensanalyse.
