Die Autoren möchten die Unterstützung der Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award sowie Mittel aus dem Institut für Regenerative Medizin Cedars-Sinai und der Guerin Familie anzuerkennen. Das beschriebene Projekt wurde in Form einer CTSI Core-Gutschein vom National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176 finanziert unterstützt und ist jetzt in der National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

Dieses Verfahren ist in Übereinstimmung mit Cedars-Sinai IACUC Anforderungen. Die Ermittler sollten institutionelle IACUC Einhaltung zu gewährleisten, bevor Sie fortfahren. Alle Werkzeuge und Reagenzien sollten vor der Verwendung sterilisiert werden. 1. Vorbereitung der Werkzeuge, Lösungen und DNA-Gemisch <ol><li> Legen Sie 100-mm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren in einer Mikropipette Puller. Stellen Heizung für Standard-gewichtete Pull ermöglichen Pipettenspitze von ca. 17,5 mm bilden. Schneiden mit scharfen Spitzen chirurgische Schere in einem Abstand etwa 8-9 mm von Anfang an der Spitze auf rund ein Mikrometer Durchmesser Öffnung 100 erstellen. </li><li> Es wird in eine Aktien 1% w / v schnelle grüne Lösung durch Mischen gefiltert Nuklease-freies Wasser (unter Verwendung eines 20-um-Spritzenfilter) mit trockenem schnell grün. </li><li> Isolieren gereinigtes Endotoxin-freiem Plasmid-DNA, die hoch konzentriert ist (dh&gt; 3 ug / ul), in Tris-EDTA (TE)-Puffer verdünnt. In gewünschten Mengen Plasmid-Mischung, um in TE-Puffer verdünnt und fügen eine 1:10-Verhältnis der 1% schnell grün-Lösung (Herstellung einer 0,1% w / v Endkonzentration von schnell grün). Verwenden Sie ein 0,5-2,0 ug / ul Endkonzentration von Plasmid für die Expression von Transgenen robust. </li></ol> 2. Tier Anästhesie, Pipette Laden und Pia-Oberfläche Plasmid-Injection <ol><li> Induzieren Hypothermie Narkose auf 1-2 Tage postnatalen Mäusen, indem sie auf einer Petrischale, die auf Eis für 5-8 min (Zeit abhängig vom Alter Welpe / Gewicht) platziert wird. Sobald Hypothermie wird durch Mangel an Bewegung von den Zehen-Quetsch-und / oder Schwanzreflex bestätigt, sind die Mäuse bereit, eingespritzt werden. Zeigen Tiere zurück auf dem Eis, wenn Schmerzen Reflexe sind offensichtlich. Der Einspritzverfahren und Elektroporation in weniger als 2-3 Minuten insgesamt so Zeit die Hypothermie, Injektion und Elektroporation Verfahren entsprechend geeignete Anästhesie zu halten. </li><li> Während der Narkose, mit einem Standard-Pipette vorsichtig Pipette gewünschte Menge plasmid mischen, um auf ein Stück Paraffinwachs Film als Referenz eingespritzt werden (0,5-2 ul). Hier wird ein Gesamtvolumen von 0,5 ul Plasmid Mischung injiziert. Als nächstes mit einem Mikro-Injektor, sorgfältig zusammengebaut einfügen Glaskapillare Pipette in Röhrchen mit Plasmid-Gemisch. Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um die Spitze zu brechen, indem sie verhindern, dass es nicht die Ränder der Röhre berühren. Saugen Sie die Lösung in die Pipette langsam durch die Übertragung der Wahl zurück Zifferblatt. Sobald ein ausreichendes Volumen hat, in die Pipette eingelegt wurde, wählen vorne, bis der Druck wieder in die Neutralposition von 0 hPa. </li><li> Mit 300 bis 450 hPa Druck zur Injektion geeignete Druck für gleichmäßige Befüllung des Pia-Oberfläche / meningealen Raum zu gewährleisten, stellen Sie die Spitze in der Nähe des pipettierte Paraffinwachs Film Bezugseinspritzung (ab 2.2) und verwenden Sie das Pedal von der Mikro-Injektor, um ein Auswerfen Volumens auf den Paraffinfilm. Stellen Sie den Druck entsprechend, bis die Menge ausgestoßenen entspricht der zuvor pipettiert referencE Lautstärke. </li><li> Sobald die Spitze wurde ins Gleichgewicht gebracht und Anästhesie wurde bestätigt, sind die Welpen bereit, eingespritzt werden. </li><li> Das Ziel des Versuchs ist es, die Plasmid-Mischung unter dem Schädel und oberhalb der Pia-Oberfläche zu injizieren, um für die Elektroporation von DNA nach unten in die Pia-Oberfläche Vorläuferzellen (1A) zu erlauben. Für Kortex Injektionen, halten Sie den Welpen nach unten mit dem Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand. Die kortikalen Hemisphären und andere Oberflächenstrukturen wie beispielsweise die überlegene colliculi zwischen P0 und P2 sichtbar, so dass für einfache Ausrichtung dieser Strukturen (Abbildung 1B). Mit der dominanten Hand und Ziel gewünschten Bereich des Kortex (dh Motor, somatosensorischen, etc.), legen Pipette an der Haut und Schädel wobei darauf zu Hirnarterien zu vermeiden. Sicherstellen, dass ein weiteres Eindringen der Spitze an der Schädel (was durch das Fehlen von weiteren Widerstand nur nach Durchstechen des Schädels angedeutet ist) zu verhindern. </li><li> Inject PlasmaID-Lösung unter Verwendung des Fußpedals der Mikro-Injektor und sicherzustellen, dass es gleichmäßig verteilt über das Gewebe (Abbildung 2A). Hinweis: Es ist sehr wichtig, um einen Ansatz, der Plasmid-Lieferung maximiert, während die Vermeidung Hämatom aufgrund des Flüssigkeitsdrucks empirisch zu bestimmen. Dies kann durch Einstellen der Dauer der Einspritzung, wobei der Winkel, der Lautstärke und der genaue Zielort Gefäßstörungen zu vermeiden erfolgen. </li><li> Seien Sie sicher, dass Sie versuchen, und halten Sie die Spitze vor dem Austrocknen in zwischen den Injektionen indem Sie die Spitze im Testtröpfchen von Injektionen zuvor auf Wachs-Papier-oder Kunststoffparaffinfilm. Dies ist erforderlich, um Spitzen Akkumulation verdampft und kristallisiert DNA-Lösung, die die Verstopfung der Spitze und inkonsistent Liefermengen führen können, zu verhindern. </li></ol> 3. Elektroporation <ol><li> Stellen Sie die Electroporator auf 135-150 V für fünf Impulse, dauerhafte 50 ms, 950 ms mit Abständen zwischen jedem Puls. Um Leitfähigkeit zu erhöhen undverhindern, Brennen der Haut, bedecken 3-mm-Platin tweezertrodes Elektroporation mit Gel. Check für toe-Quetsch-und Heck Reflexe an dieser Stelle auf die Anästhesie zu gewährleisten. Wenn anspricht, setzen auf Eis für einige Minuten zu betäuben. </li><li> Für Kortex (und Colliculus superior) Injektionen, verwenden eine 3-mm-Elektrode (2B), um die Lebensfähigkeit der Jungtiere zu erhöhen (im Vergleich mit der 7 - und 10-mm-Elektroden, die für ventrikuläre Zone Elektroporation verwendet werden). Platzieren der negativ geladene Sonde der Elektrode über der Injektionsstelle und dem positiv geladenen Sonde auf der kontralateralen Bereich unterhalb des Auges, so daß die Elektrodenausrichtung bei einem 45-60 °-Winkel relativ zu der Mittellinie (Fig. 2C). </li><li> Verwenden Sie das Fußpedal der Elektroporator auslösen Strom und halten tweezertrodes in Platz für 3-5 Impulse, je nach Alter und Gewicht Welpe, effektiv Targeting-DNA in Zellen zugrunde liegenden Pia-Oberfläche bei der Bilanzierung von Krümmungder Halbkugeln. Hinweis: Der negative Pol auf die Injektionsbereich zwischen den Impulsen oder eine größere Elektrode eingesetzt, um den Bereich zu erhöhen Elektroporation werden gekehrt werden. </li><li> Unmittelbar nach der Elektroporation, sorgfältig säubern Gel aus Welpen und sie unter einer Wärmelampe für ca. 5 min. </li><li> Pups wird akut verlieren ihre natürliche rötlich-rosa Farbton in den Minuten nach der Elektroporation durch Zyanose. Beachten Sie die Welpen für die Wiederherstellung der natürlichen Farbe und der Einleitung der normalen Bewegung, bevor sie dann wieder in ihre Käfige. </li><li> Stellen Sie sicher, Resozialisierung mit der Mutter durch die Beobachtung, ob sie bringt die Welpen zurück ins Nest und beginnt, sie zu pflegen. Wenn sie aggressiv wird, stellen Sie sicher, dass Welpen nicht haben Reste von Gel und bebrüten sie mit einigen der Bettwäsche, den Geruch, um die Welpen übertragen. </li></ol> 4. Modifikationen für Targeting der Superior-Colliculi Targeting: <ol><li> Inject der Colliculus superior in der gleichen Weise wie die Rinde, aber beachten Sie, dass der Zielbereich liegt nur posterior und lateral Lambda und etwa an der Mittellinie (3A und 3B). Mit der erfolgreichen Injektionen, die Plasmid-Mix natürlich füllt die Konturen des Colliculus superior. Sobald Injektionen wurden erfolgreich gemacht, sind Tiere, bereit für die Elektroporation. </li></ol> Elektroporation: <ol><li> In einer sehr ähnlichen Weise für Colliculus superior Injektionen, platzieren Sie den negativ geladenen Sonde der Elektrode über der Injektionsstelle und dem positiv geladenen Sonde um das Auge, Schnauze oder Kinn, Fahr DNA in den oberflächlichen Regionen des Colliculus superior (3C) . In diesem Fall ist die Elektrodenausrichtung bei einer 25-40 °-Winkel relativ zu der Mittellinie. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Der wichtigste Aspekt für die erfolgreiche Elektroporation von Pia-Oberfläche Vorläufer sind: 1) Targeting-Plasmid Mischung der Pia-Oberfläche; 2) Verhinderung der Entstehung von Hämatomen an der Injektionsstelle; und 3) die Vermeidung von Sterblichkeit, die mit Mittelhirn Elektroporation verbunden. Geeigneter Ausrichtung der Pia-Oberfläche wird gemessen und sorgfältige Punktierung des Schädels erreicht, um das Eindringen der Pia-Oberfläche zu vermeiden. 1) Verschiebung der schnelle...

Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen sind in der gesamten Säugetier-ZNS-1, 2. Art und Eigenschaften der embryonalen und adulten Keimzonen um die ventrikulären Regionen des Gehirns und des Rückenmarks sind ausführlich in den letzten zehn Jahren 1-3 dokumentiert. Zum großen Teil ist dies auf die Entwicklung von immer präzise genetische Werkzeuge, wie das Nervensystem spezifische Cre Rekombination von floxed Allele oder retroviral-Linie 4 Verfolgung gewesen. Allerdings ist eine Vorläuferregion-Pia-Oberfläche der Vorläufer-Zone hat erst vor kurzem im Detail 7.5 beschrieben und erwartet umfassende Untersuchung. Der Pia-Oberfläche des Gehirns wird als die Schnittstelle zwischen der Oberfläche des Gehirns und der Hirnhaut umgebenden 8 definiert. Während der Entwicklung neuroepithelialen und später radiale Gliazellen Ende Füßen befestigen zu dieser Fläche 9,10. Einige der Tannest Neuronen im Gehirn und viele neuronale Mitosen in diesem Bereich 11 beobachtet. Später, während der embryonalen Neurogenese, kortikale Inter sind bekannt, die Pia-Region durchqueren, zusätzlich zu ihren Migrationsrouten in der Zwischenzone und Subventrikularzone 12-14. Während dieser Zeit können Stammzellen aus diesem Bereich kultiviert werden, und es scheint eine aktive Stelle des Neuro-und Gliogenese 5 sein. Im erwachsenen Gehirn, wurde berichtet, dass Inter kann von Pia-Oberfläche Vorfahren folgenden hypoxischen Herausforderung 7 geboren werden. Allerdings ist die Beteiligung der Region an, um seine während der embryonalen und postnatalen Entwicklung genensis hat obskuren Teil auf die Schwierigkeit, die speziell der Untersuchung dieser Region 6 geblieben. In den Colliculus superior und in der Großhirnrinde kann oberflächlich (oder Schicht I in der Rinde) Inter den Schaltungsausgang der zugrunde liegenden erregenden Neuronenpopulationen zu modulieren und damit beitragen significantly der Funktion dieser Strukturen. Insbesondere sind Schicht ein Inter in bester Lage, das Feuern von Neuronen in den oberen Schichten der Hirnrinde angesichts ihrer umfangreichen Konnektivität zu den oberflächlichen und tiefen Schichten der kortikalen Säulen 15,16 regulieren. In ähnlicher Weise erhalten horizontalen Inter erregenden Input von kortikalen und Netzhautfasern, Projekt über einen relativ weiten Bereich und spekuliert auf die Hemmung der neuronalen Populationen Reaktion auf visuelle Reize Fern 17,18 vermitteln. Auch ist ihre Morphologie gut geeignet, um eine mögliche Rolle in der strukturierten Wellenaktivität in den Entwicklungs visuelle System 19 spielen. Interessanterweise Intern Entwicklung und Reifung geschieht zu einem großen Teil postnatal. Ferner kann dieser Reifungsprozess wurde festgestellt, durch neuronale Aktivität reguliert werden und ist somit ein Substrat der Plastizität mit lebenslangen Folgen für Schaltungsfunktion 20,21. Insbesondere no Promotoren beschrieben, die gezielt können diese Zellen transgen. Die Aufteilung Vorfahren mit Retrovirus 7 richtet werden, aber die Virusproduktion ist zeitaufwendig und erfordert Geschick, um die hohe Titer für die Zellübertragung notwendig ergeben. Elektroporation hat zu einer Renaissance in der Studie der Entwicklung des Nervensystems geführt, wie es ermöglicht eine schnelle und effiziente Abfrage der genetischen Signalwege in neuronalen Vorläuferzellen 4, 22, 23. Die Elektroporation umfasst die Injektion von Plasmid-DNA, gefolgt von der Abgabe von elektrischen Impulsen an die Außenseite des Kopfes, um in einer Richtung in die proliferierenden Vorläuferzellen umgibt die Kammern 4, 22, 23 treiben die DNA. Elektroporation scheint Transitzellen durch M-Phase des Zellzyklus für die Expression von Transgenen Plasmid 24 erforderlich. Insbesondere wurde gefunden, dass nurZellen, die durch M-Phase innerhalb von 8 Stunden der Elektroporation von Plasmiden wird Transgene trotz ihrer wirksamen Zustellung an alle Zellen innerhalb von ~ 160 um der Kammerwand 24 zum Ausdruck bringen. Es wird spekuliert, dass dies in Berücksichtigung Kern Zugang der episomalen Plasmiden aufgrund der Notwendigkeit für die Kernhülle Bruch, Chemikalien verursacht Kern Permeabilisierung kann die Expression von Plasmiden, die in der Post mitotischen Zellen 25 zu induzieren. Ursprünglich in der Embryo-22 verwendet, Elektroporation wurde für den Einsatz in der postnatalen Gehirn viel später 26, 27 angepasst. Kürzlich haben wir Elektroporation zur Verwendung bei der genetischen Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläufer 6 angepasst. Weitere, mit diesem Ansatz haben wir gezeigt, dass es offenbar zwei verschiedene Linien der Vorfahren in dieser Region und Astrozyten-intern 6. Dieses Protokoll Details eine einfache, schnelle und leistungsfähige Methode, um diese Zellen für die Abfrage Zielder Mechanismen, die Entwicklung dieser Zellen.

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		<col />
		<col />
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			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

In den vergangenen Jahren ist der Pia-Oberfläche wurde als Keim Nische von Bedeutung bei der Embryonalentwicklung, perinatale und Erwachsenen Neuro-und Gliogenese identifiziert worden, darunter nach der Verletzung. Allerdings Verfahren zur genetischen Abfrage diese Vorläufer Bevölkerung und die Verfolgung ihrer Abstammungslinien beschränkt hatte aufgrund einer mangelnden Spezifität oder zeitaufwendig Produktion von Viren. So hat die Fortschritte in diesem Bereich mit nur einer Handvoll von Untersuchungen dieser Lage relativ langsam. Elektroporation ist seit über einem Jahrzehnt in der postnatalen Gehirn eingesetzt, um neurale Stammzelleigenschaften im Embryo zu studieren, und in jüngerer Zeit. Hier beschreiben wir eine effiziente, schnelle und einfache Technik für die genetische Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläuferzellen auf Basis eines angepassten Ansatz Elektroporation. Pia-Oberfläche Elektroporation ermöglicht einfache genetische Kennzeichnung und Manipulation dieser Vorläuferzellen und damit zu einer zeitsparende und wirtschaftliche Lösung für das Studium dieser Zellen.

Pia-Oberfläche Elektroporation führt zur Expression von Plasmid-DNA in Zellen-Vorläufer-meist an oder nahe der Pia-Oberfläche 6. Genauer gesagt, ist die Orientierung der Elektroden kritisch diktiert die Richtung der Bewegung Plasmid und anschließende Expression. Somit wird in Doppelelektrodenkonfigurationen, das Plasmid in etwa einer geraden Vektor zwischen dem negativen und positiven Elektrode gerichtet. Deshalb, wenn der negative Pol wird über die Injektionsstelle gelegt und der positive Pol ventral m...

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Neonatal Pial Surface Electroporation

Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Aufrufe.  Cedars-Sinai Medical Center.  Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von To...

Serie: Neonatal Pial Surface Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

Aufzeichnung von EEG in frei bewegten neonatalen Ratten mit einer neuartigen Methode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...