Wir bedanken uns bei RIKEN für die Finanzierung. P10-Gal4 war eine Art Geschenk Alain Vincent (Université Paul Sabatier, Toulouse, Frankreich).

1. Vorbereitung der Reagenzien Hinweise vor Beginn: Dissection und immunhistochemische Färbung sind in einem magnetischen Kammer durchgeführt und die Larve sich mit speziell geformten Insektennadeln merken. Detaillierte Anweisungen für den Bau eines magnetischen Kammer und Vorbereitung dieser Stifte können in Zusammenhang mit Verweisen 14,15 gefunden werden. Kurz gesagt, ist ein 1x1cm quadratisches Loch in ein magnetisches Blatt und einem Deckglas angebracht auf der Rückseite des Blattes in eine kleine Kammer zu schneiden. Die Seiten der Kammer sind mit Epoxy-Kleber versiegelt; nach dieser Leim abgebunden hat die Kammer mehrmals mit 70% Ethanol vor Gebrauch gewaschen werden. Dissection Insekten Pins sind durch Biegen in die gewünschte Form hergestellt und anschließend verklebt auf eine Metall-Reiter 14,15. Alternativ zu einem Metall-Reiter haben wir ein umgekehrtes Flat-Head Stahl Reißzwecke mit einem Handgriff von einem cut-off gelben Spitze gemacht werden. Die Nutzung dieser magnetische Kammer Anordnung ermöglicht genaue Kontrolle over pin Positionierung und Gewebe Stretching beim Präparieren. Zum Antrieb der Reportergen-Expression in den verschiedenen Untergruppen der DA Neuronen Ermittler können mit mehreren verschiedenen Gal4-Linien (zusammengefasst von Shimono und Kollegen 16). Viele dieser Linien sind aus dem öffentlichen Lager-Zentren zur Verfügung. In dieser repräsentativen Protokoll führen wir Immunfärbung einer Zeile, in der zwei gegensätzliche Klassen von DA Neuronen sind Co-markierten: die einfachste Klasse I und komplexeste Klasse IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8: Kusabira-Orange (KO)). <ol><li> Bereiten Ca + +-freien HL3.1 Kochsalzlösung <ol><li> In mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 Saccharose und 5 Trehalose; pH 7.2 19. Filter-sterilisiert und bei 4 ° C. Hinweis: Ca + +-freier Lösung verhindert Muskelkontraktion beim Präparieren. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 2x PHEM Puffer <ol><li> In mM: 130 PIPES, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4; pH 7,0. Filter-sterilisiert und bei 4 ° C. Hinweis: Diese Materialien werden nicht auflösen, bis der pH-Wert nähert 7,0. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Fixativ frisch unmittelbar vor der Fixierung. <ol><li> Um eine 25ml Lösung, erste Mix 2g Paraformaldehyd, 100 &amp;mgr; l 1M NaOH und 10 ml Wasser in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen vorbereiten. </li><li> Schütteln Sie in einem 55 ° C Wasserbad mit Schüttler Fixativ, bis die Lösung klar ist. (Gesamtvolumen wird bei etwa 11,5 ml sein.) </li><li> Coole Fixativ auf Eis. </li><li> Add 12.5ml 2x PHEM Puffer. </li><li> Der pH-Wert auf 7,0 mit 1 M HCl. </li><li> Füllen Sie die Lösung mit Wasser, bis das Volumen ist 25ml. </li><li> Filtern Sie die Lösung mit Whatman-Papier. </li></ol></li></ol> 2. Larven Dissektion Beachten Sie vor Beginn: Mikrotubuli-Netzwerke und insbesondere in sensorischen Dendriten, werden Zusammenbruch rasch nach Beginn der Dissektion. Achieving schnelle Zerlegung in weniger als fünf Minuten durch eine sofortige Fixierung gefolgt sind Schlüsselfaktoren für den Erfolg dieses Protokolls. <ol><li> Waschen Sie die Larve im Wasser schnell und verschieben Sie sie in dieser Rückgang mit einer Schleife des Haares. </li><li> Orient die Larve dorsal und ventral auf dem Glas. Hinweis: Diese Orientierung ist die ventrale Cluster Neuronen zu untersuchen. Um zu untersuchen, dorsalen Cluster Neuronen, invertieren die Orientierung. </li><li> Verwenden Sie das Zentrum Insekten-polig auf dem vorderen Ende in der Nähe der Mündung Haken pin. Legen Sie den Stift kurz vor dem Ende für die besten Ergebnisse. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung HL3.1 in der Sektion Kammer. </li><li> Schneiden Sie das sehr hinteren Spitze der Larve off mit Mikroschere. Hinweis: Dieser Schritt eröffnet eine Öffnung am hinteren Ende der Larve, die den Zugang für die Mikroschere (Schritt 2,7) ermöglichen wird. </li><li> Schnappen Sie mit der Zange der Region gut, dass jetzt Stossen ist aus der Öffnung am hinteren Ende der Larve. Ziehen Sie die gesamte Darm. </li><li> Legen Sie dieSpitze von einem Blatt der Mikroschere durch die Öffnung und entlang der ventralen Mittellinie in Richtung der vorderen. </li><li> Mit der Ecke Stifte, Bolzen der nun freien Ecken, posterior, dann anterior. Gleichzeitig sanft dehnen öffnen Sie die Larven Filet. </li></ol> 3. Fixation, Sperrung, Färbung und Montage von Larven Filets Hinweise vor Beginn: Alle Fixierung und Färbung Schritte werden in der Sektion Kammer durchgeführt. Während dieses Prozesses darauf achten, nicht das Insekt Stifte halten die Larve, da dies zu Gewebeschäden führen kann klopfen. Um zu verhindern, das Experiment vor dem Austrocknen, das tut alles Färbeschritte in eine kleine Tupperware Behälter befeuchtet Gewebe umgeben. <ol><li> Saugen Sie das Ca + +-freien HL3.1 Puffer unter Verwendung eines gelben Spitze. Unmittelbar fügen Sie die Fixiermittel mit einem anderen pipetteman. </li><li> Gently Pipette auf und ab, um das Fixiermittel mit den restlichen Spuren von Ca + +-freien HL3.1 Puffer-Mixin der Kammer. Unmittelbar absaugen und dann fügen Sie frisches Fixativ in die Kammer. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten. </li><li> Wash 6x 10 Minuten in PBST (0,1% Triton X-100 in PBS). </li><li> Block mit 5% Ziegenserum in PBST für 20 min bei RT. </li><li> Ersetzen Sie die Blocking-Lösung mit primärem Antikörper in 5% Ziegenserum in PBST verdünnt. Die primären Antikörper verwendet werden Maus-anti-α-Tubulin (DM1A) und Ratte anti-CD8 (5h10), beide verdünnt 1 / 1000. Hinweis: Der Prüfer kann wollen Maus-anti-α-Tubulin (DM1A) mit Maus-Anti-futsch (22C10) 20,21 verdünnt 1 / 1000 unter bestimmten Umständen ersetzt (siehe Diskussion). </li><li> Inkubieren über Nacht (mindestens 16h) bei 4 ° C. </li><li> Wash 6x 10 Minuten in PBST. </li><li> Add sekundären Antikörper-Lösung in 5% Ziegenserum in PBST verdünnt. Die sekundären Antikörper verwendet werden, Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG und Cy3 donkey anti-Ratte-IgG. Halten Sie die Probe abgedeckt, um zu verhindern FluorophorFoto-Bleiche 22. </li><li> Inkubieren entweder bei RT für 2 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C eine Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Wash 6x 10 Minuten in PBST. </li><li> Setzen Sie den Larven Filet auf der Folie Nagelhaut-Seite nach unten, in 80% Glycerin montieren und Dichtung den Seiten des Deckglases mit Nagellack für einen &quot;schnellen&quot; zu montieren. Hinweis: Für eine verbesserte Gewebe Lichtung, und eine dauerhafte stabile Probe, mount in DPX wie bisher 23 beschrieben. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Fluoreszenzfärbung wurde unter einem konfokalen Mikroskop untersucht. In den Abbildungen 1-2, verschiedene Zweige innerhalb eines Dendriten Laube haben verschiedene Zytoskelett-Organisation. Abbildung 1 zeigt einen Bereich der Laube einer Klasse IV DA Neuron bei der 1. Larvenstadium Larvenstadium. Die ganze Laube ist mit mCD8 markiert:: KO erkannt und mit einem Anti-CD8-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Cy3). Tubulin wird unter Verwendung anti α-Tubulin-Antikörper und Fluorescent sekundären (Alexa Fluor 488). Die wichtigsten Branchen sind für Tubulin positiv, einige dünne Seitenäste Tubulin-negativ. Movie 1 ist eine Reihe von seriellen Schnitten durch eine ähnliche Färbung einer Klasse-I-DA Neurons. Abbildung 2 zeigt einen Bereich der Laube einer Klasse IV DA Neuronen mit Antikörpern gegen futsch und CD8 an der 1. Larvenstadium Larvenstadium gefärbt. Die wichtigsten Branchen sind futsch-positiv, einige dünne Seitenäste futsch-negativ. Abbildung 3. Tracheen in der larvalen Körper Wand zeigen eine komplexe Mikrotubuli Organisation. Filme 2 und 3 zeigen Schnittserien der Färbung durch Körperwand Muskeln und Luftröhre. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig1.jpg" /> Abbildung 1. Abb.. 1 zeigt eine Region von der Laube einer Klasse IV DA Neuron bei der 1. Larvenstadium Larvenstadium. : Die ganze Laube ist mit mCD8 gekennzeichnet: KO erkannt und mit anti-CD8-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Cy3). Tubulin wird unter Verwendung anti-&amp;-Tubulin Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa 488). Panels AC sequentielle konfokalen z-Abschnitte (0,5 um), C&#39;-C &quot;, single Antikörper-Färbung von Feld C Beispiel von Ästen mit einem (gelbe Pfeilspitze) oder ohne (lila Pfeil) Mikrotubuli sind hervorgehoben. Roten Pfeile markieren Mikrotubuli in der zugrunde liegenden Epithelzellen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig2.jpg" /> Abbildung 2. Abb.. 2 zeigt eine ähnliche Region von der Laube einer Klasse IV da Neuron mit Antikörpern gegen futsch und CD8 an der 1. Larvenstadium Larvenstadium gefärbt. : Die ganze Laube ist mit mCD8 gekennzeichnet: KO erkannt und mit anti-CD8-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Cy3). Futsch erkannt wird mit anti-futsch-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa 488). Die wichtigsten Branchen sind futsch-positiv, einige dünne Seitenäste futsch-negativ. Beispiel für Branchen mit (gelbe Pfeilspitze) oder ohne (lila Pfeil) futsch sind hervorgehoben. Abbildung 3. Trachea befleckt mit dem anti-Tubulin-Protokoll beschrieben. Diese Larve ist der dritte Larvenstadium und seziert wie zuvor 23,24 beschrieben. Movie 3 zeigt vergrößert Schnittserien aus dem Bereich von einem Quadrat markiert. Movie 1. Serienschnitte Tracing Tubulin-Färbung in der dendritischen Dorn einer Klasse I Neuron. Die ganze Laube ist mit mCD8 markiert:: KO (Magenta) erkannt und mit anti-CD8-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Cy3). Tubulin (grün) wird unter Verwendung eines Anti-α-Tubulin-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa Fluor 488). Maßstab: die eine Seite des Videobildes entspricht 46.88μm im Abschnitt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie1.avi">Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.</a> Movie 2. Serienschnitte Tracing Tubulin-Färbung in body Wand Muskeln eines dritten Larvenstadium Larve. Tubulin wird unter Verwendung anti-α-Tubulin-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa Fluor 488). Maßstab: die eine Seite des Videobildes entspricht 46.88μm im Abschnitt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie2.avi">Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.</a> Movie 3. Serienschnitte Tracing Tubulin-Färbung in einer Körperwand Luftröhre eines dritten Larvenstadium Larve, mit einem quadratischen in Abbildung 3 markiert. Tubulin wird unter Verwendung anti-α-Tubulin-Antikörper und fluoreszierende sekundäre (Alexa Fluor 488). Maßstab: die eine Seite des Videobildes entspricht 46.88μm im Abschnitt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie3.avi">Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.</a>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Um zu verstehen, wie komplex Zellformen sind es erreicht ist wichtig in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode Assay Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten. Neben Färbung sensorischen Neuronen erreicht diese Methode robust immunhistologische Färbung der Luftröhre, Muskeln und andere Körperteile Wand Gewebe. Wir verwenden dieses Protokoll, um Mikrotubuli Orga...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog Anzahl </th><th> Kommentare (Optional) </th></tr><tr><td> Zange </td><td> Dumont </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroschere </td><td> FST </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-α-Tubulin (Clone: ​​DM1A) </td><td> Sigma </td><td> T9026 </td><td> Verdünnung 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Maus anti-futsch (Clone: ​​22C10), Überstand </td><td> Entwicklungsbiologie Studium Hybridoma der Bank </td><td> 22C10 </td><td> Verdünnung 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Rat anti-CD8 (Klon: 5h10) </td><td> Caltag </td><td> MCD0800 </td><td> Verdünnung 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Anti-Maus-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td> Verdünnung 1 / 500 </td></tr><tr><td> Cy3 anti-Rat IgG </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 712-166-150 </td><td> Verdünnung 1 / 200 </td></tr></tbody></table>

immunohistological labeling of microtubules in sensory neuron dendrites, tracheae, and muscles in the drosophila larva body wall

Um zu verstehen, wie sich Unterschiede in komplexen Zelle Formen erreicht werden, ist es wichtig, genau zu verfolgen Mikrotubuli Organisation. Die Drosophila Larve Körper Wand enthält verschiedene Zelltypen, die Modelle, um Zellen und Gewebe Morphogenese Studie sind. Zum Beispiel Tracheen werden verwendet, um Rohr Morphogenese 1, und die dendritische Verzweigung (DA) sensorischen Neuronen der Drosophila Larve zu einem primären System für die Aufklärung der allgemeinen und Neuron-Klasse-spezifische Mechanismen der dendritischen Differenzierung 2-5 und Degeneration 6 prüfen . Die Form der Dendriten Niederlassungen erheblich variieren kann zwischen Neuron Klassen und sogar zwischen verschiedenen Niederlassungen eines einzelnen Neurons 7,8. Genetische Studien in DA Neuronen lassen vermuten, dass Differential Zytoskelett-Organisation kann morphologischen Unterschiede in dendritische Verzweigung Form 4,9-11 zugrunde liegen. Wir bieten eine robuste immunologische Kennzeichnung Methode, um einessay in vivo Mikrotubuli Organisation in DA sensorischen Neurons Dendriten Laube (Abbildungen 1, 2, Movie 1). Dieses Protokoll zeigt die Zerlegung und Immunfärbung des ersten Stadiums Larve, eine Bühne, wenn sie aktiv sensorischen Neurons Dendriten Auswuchs und Verzweigung Organisation auftritt 12,13. Neben Färbung sensorischen Neuronen erreicht diese Methode robust Kennzeichnung von Mikrotubuli Organisation in den Muskeln (Filme 2, 3), Luftröhre (Abbildung 3, Movie 3), und andere Körperteile Wand Gewebe. Es ist für die Ermittler wollen Mikrotubuli Organisation in situ Analyse in die Wand des Körpers bei der Untersuchung von Mechanismen, die wertvolle Kontrolle von Geweben und Zellen zu gestalten.

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Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

Um zu verstehen, wie komplex Zelle Formen, wie neuronalen Dendriten, während der Entwicklung erreicht werden, ist es wichtig, in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode, um Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten, Luftröhre, Muskeln zu untersuchen, und andere<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Körperwand Gewebe.

Immunhistologische Markierung von Mikrotubuli in Sensory Neuron Dendriten, Tracheen und Muskeln in der Drosophila Larva Körperwand

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

12.3K Aufrufe.  RIKEN Brain Science Institute. Um zu verstehen, wie komplex Zelle Formen, wie neuronalen Dendriten, während der Entwicklung erreicht werden, ist es wichtig, in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode, um Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten, Luftröhre, Muskeln zu untersuchen, und andere Drosophila Larve Körperwand Gewebe.

Serie: Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Forschung

Neurowissenschaften

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Biologie

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Entwicklungsbiologie

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detektion<em&gt; In-situ-</em&gt; Protein-Protein-Komplexe bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Betrachtung von Mikrotubuli-Netzwerken in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mikrotubuli-Netzwerks in neuromuskulären Verbindungen von Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Immunhistologische Markierung von Mikrotubuli in Sensory Neuron Dendriten, Tracheen und Muskeln in der Drosophila Larva Körperwand

Zusammenfassung

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Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

Detektion

Entfernung von

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks