Die Autoren danken Dr. Alistair Garratt (Max-Delbrück-Centrum, Berlin) für hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde von der SFB (SFB665) von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt.

1. Dissection Verfahren Hinweis: Experimentelle Verwendung von Mäusen sollten amtlich zugelassen folgen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren. <ol><li> Vor der Präparation, richten Sie Ihren Präpariermikroskop und legen die chirurgischen Instrumente für die Präparation, darunter grosse und kleine Schere, große Zahn-Zange, einer gebogenen Pinzette und vier Gruppen von Dumont No.5 Pinzette (von denen zwei inside-polierte Spitzen haben) notwendig ( für Details siehe die Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte). Legen Sie ein Blatt Filterpapier in ein 100-mm Sylgard-beschichtete Petrischale. Gießen Sie kaltes PBS in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte, ein 100-mm-Petrischale und einem 12-ml-Tube und lassen auf Eis. Pipette 2ml Fixierung Puffer (4% Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4) in jede Vertiefung einer zweiten 12-Well-Platte und auf Eis stellen. </li><li> Nach Betäubung, opfern die zeitgesteuerte schwangere Mutter bei E12.5 (Nachweis von Vaginalpfropf wurde als E0.5 bezeichnet), platzieren Sie den Mauszeigermit seiner Bauchseite bis auf drei Blatt Papier Handtücher und genießen den Bauchbereich mit 70% Ethanol. </li><li> Öffnen Sie die Bauch-Hohlraum, isolieren die bilateralen Uterushörner und überführen sie in eine der 100-mm-Schalen mit eiskaltem PBS. </li><li> Unter mikroskopischer Kontrolle, machen Sie einen Längsschnitt der Gebärmutterwand mit kleinen, geraden Schere und schnitt jedes Fruchtblase aus der Plazenta. </li><li> Peel entfernt die Fruchtblase von jedem Embryo und die Nabelschnur. </li><li> Mit einer kleinen Schere, enthaupten die Embryonen und legte die Köpfe oder ein Teil von ihnen beiseite für die Isolierung genomischer DNA, wenn Genotypisierung erforderlich sein sollte. Anschließend übertragen Sie die Torsi, die entsprechenden Wells der 12-Well-Platte mit kaltem PBS. </li><li> Wet das Filterpapier in die Sylgard Teller mit ein paar Tropfen PBS und die Position eines embryonalen Torso mit seiner dorsalen Seite nach oben auf dem Papier. Für eine bessere Stabilität, gerade mit dem Schwanz und Extremitäten vom Körper weg. </li><li> Arbeitenunter einem Binokular mit einer Vergrößerung von ca. 16x, sorgfältig Sie die Haut des Embryos über das Rückenmark mit zwei Paaren von feinen Spitzen einer Pinzette und sanft zerreißen. Beginnend in der Mitte, zunächst weiter in Richtung Heck und dann die Wiederaufnahme von der Mitte in Richtung der vorderen Seite. </li><li> Wet der Embryo von Zeit zu Zeit mit zwei oder drei Tropfen PBS auf sie vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Um zu verhindern, dass DRG werden aus dem Rückenmark gerissen, wenn es aus dem Embryo entnommen wird lösen die DRG und das Rückenmark von den umgebenden knorpeligen Wirbelsäule durch Horizontal-Schiebe-Bewegungen mit der Klinge eines feinen Pinzette mit inside-polierte Spitzen. Ab in die Mitte des Embryos der rechten Seite, arbeiten Sie Ihren Weg in Richtung Schwanz und dann auf das vordere Ende. Danach wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite. Achten Sie darauf, rip off der zugehörigen DRG. </li><li> So trennen Sie völlig die gelösten Rückenmark aus dem Embryo, abholen seine cervical Teil mit feinen Pinzetten und ziehen Sie sie in einem Stück zu seinem kaudalen Ende. </li><li> Tauchen Sie die isolierten Rückenmark mit angeschlossenem DRG in eine Vertiefung der 12-Well-Platte mit Fixierung Puffer gefüllt und mit der Vorbereitung des Rückenmarks von den übrigen Embryonen. </li><li> Fix Rückenmark mindestens zwei Stunden auf dem Eis. </li></ol> 2. DiI-Markierung von DRG-Neuronen <ol><li> Für jedes Rückenmark gekennzeichnet werden, bereiten zwei Glas-Nadeln mit einer Mikropipette Abzieher. Wir verwenden eine Sutter Modell P-97-Elektrode Abzieher (Programm-Einstellung: 1 HEAT = 625, VEL = 35, TIME = 175, 2 HEAT = 600, VEL = 25, TIME = 175, 3 HEAT = 630, VEL =... 30, TIME = 150). </li><li> Unter mikroskopischer Kontrolle dip der Spitze jeder Glasnadel drei vor fünf Mal in einer 5% (w / v) Lösung von DiI in Ethanol. Die Verdampfung des Ethanol erzeugt eine dünne Schicht von DiI-Kristalle auf der Nadel. </li><li> Das Arbeiten unter einem Binokular mit einer Vergrößerung von ca. 40x, legen Sie ein Rückenmark mit seinen ventral Seite nach oben auf einer Folie. Mit Feder Schere, öffnen Sie das Netzkabel auf der Bauchseite auf seiner ganzen Länge durch einen Schnitt durch die Bodenplatte, damit die spätere Montage der Zubereitung in einer invertierten Open-Book-Modus (siehe Abschnitt C). </li><li> Position des Rückenmarks mit der dorsalen Seite nach oben auf einer Folie. Dann manuell Ansatz die Schnur mit der DiI verschneiten Spitze der Glas-Nadel unter mikroskopischer Visualisierung und sorgfältig durchdringen jede zweite DRG auf einer Seite des Rückenmarks. Fast keine Spuren von DiI sollte in die durchbohrte DRG sichtbar für die Kennzeichnung von nur einer kleinen Zahl von Neuronen sorgen. Nehmen Sie eine zweite Nadel für die andere Seite des Kabels. Aiming nur jede zweite DRG vermeidet eine Überschneidung der markierten axonalen Projektionen aus dem benachbarten DRG, die die Differenzierung einzelner Axone erschweren könnte. </li><li> Zurück im Rückenmark, die Fixierung Puffer und Inkubation im Dunkeln für mindestens sechs Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C, um Zeit für den Farbstoff geben, diffuse entlang des Axons innerhalb der Plasmamembran. Lassen Sie für eine längere Inkubationszeit (bis zu zwei Tage bei 4 ° C), wenn die Analyse von Sicherheiten Wachstum in das Rückenmark ist erwünscht. </li></ol> 3. Montage-und mikroskopische Analyse <ol><li> Nach Farbstoffdiffusion, Position einer Rückenmark mit seiner dorsalen Seite nach unten auf einem Deckglas in einem Tropfen PBS. Achten Sie darauf, dass die angehängte DRG richtig ausgerichtet sind seitlich und nicht vermischen. Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit und abflachen das Kabel in einem umgekehrten Open-Book-Modus mit einer Pinzette. </li><li> Montieren Sie die Vorbereitung auf einen Objektträger mit PBS. </li><li> Um zu verhindern, die Zunahme von unerwünschten Hintergrundfärbung fluoreszenzmikroskopische Analyse von markierten axonalen Projektionen sollte der Tag der Montage durchgeführt. Bis dahin halten die Folien im Dunkeln bei 4 ° C. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Das Rückenmark der Maus empfängt afferente projections von 8 Paaren von Gebärmutterhalskrebs, 13 Paar Brust-, 5 Paar Lenden-und 4 Paar sakralen DRG insgesamt auf 60 Spinalganglien. Nach einigem Training ein Rückenmark mit den meisten DRG noch befestigt werden aus einem Embryo in unter 5 Minuten isoliert werden. Dieses Verfahren ist für die Isolierung von Rückenmark mit angeschlossenem DRG ab E11.5 E13.5 auf Maus-Embryonen geeignet. Allerdings sind die besten Ergebnisse aus E12.5 erreicht. Beispielhafte Ergebnisse der Kennzeichnung hier beschriebene Verfahren sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Beschriftung der DRG über die gesamte Länge des Rückenmarks kann dann verwendet werden, um axonale Verzweigung Verhalten bei verschiedenen Wirbelkörper Ebenen (Abb. 4) zu quantifizieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> Abbildung 1. Scheme Darstellung der beiden wichtigsten Arten der axonalen Verzweigung. (A) Branching durch die Aktivitäten des Wachstums Kegel, die zu einer Bifurkation führen könnte - wie hier angedeutet - ebenso wie komplexe Klemme Lauben oder(B) Sicherheiten Formation in das Axon Welle (interstitielle Verzweigung). Letzterer Modus ist die dominierende Verzweigung Art der Projektion kortikalen und thalamokortikalen Axone 6,7. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> Abbildung 2 afferente Projektionen von DRG-Neuronen in den embryonalen Rückenmark zeigen beide Arten von axonalen Verzweigung:. Axone erste Filiale an der Drez durch Bifurkation (1) und aus dem resultierenden Tochter Niederlassungen Sicherheiten Form nach einer Wartezeit von interstitiellen Verzweigung (2). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> Abbildung 3. Visualisierung der einzelnen axonalen Bahnen von embryonalen Maus-DRG-Neuronen. (A) des Rückenmarks mit angeschlossenem DRG aus einer E12.5 Maus-Embryo vorbereitet. (Scale bar, 1 mm.) (BD) Dorsale Ansichten von DiI-markierten DRG von Wildtyp-Mäusen bei zunehmender Vergrößerung dargestellt. In B jeden zweiten DRG ist labeled von DiI. Fluoreszenzbilder invertiert werden, ist caudal auf der linken Seite und in C und D, lateral ist am Boden. In C eine kleine Anzahl von Axonen gekennzeichnet ist und bei höherer Vergrößerung der Präsenz von T-like Zweige können in der Drez des Rückenmarks gekennzeichnet. (Scale Bars, 250 pm (B), 100 pm (C) und 50 um (D).) <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quantifizierung von T-förmige Verzweigungen, single rostralen oder kaudalen wird in Wildtyp-und C-Typ natriuretische Peptid (CNP)-defizienten Mäusen bei E13.5. Die Zahl der einzelnen Axone gezählt sind in Klammern für die verschiedenen Stamm Ebenen für jeden Genotyp gegeben. C-oder R-Kurven - Wachstum nur in caudal oder rostral Richtung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> Abbildung 5. A cGMP-Signalweg auslöst sensorischen Axon Bifurkation an der Drez des Rückenmarks. (A) Schema derdes cGMP-Signalweges des Liganden CNP, der Rezeptor Guanylylcyclase Npr2 und der Serin / Threonin-Kinase cGKIα in embryonalen DRG-Neuronen zusammen. Npr2 erzeugt cGMP aus GTP nach Stimulation durch CNP. (B) DiI Tracing einzelner Axone der DRG-Neuronen in Wildtyp-und CNP-defizienten Mäusen. (Scale bar, 25 um.)

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	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Stereotype Projektionsmuster aus beiden Arten von axonalen Verzweigung Bildung zusammen mit einfachen Herstellung in Kombination mit der Verwendung von fixiertem Gewebe für DiI Kennzeichnung macht die embryonalen Rückenmarks mit angeschlossenem DRG ein günstiges Modell zu studieren axonale Verzweigung. Die Anwendung von kleinsten Mengen an DiI mit beschichtetem Glas Nadeln ermöglicht - im Gegensatz zu den Bulk-Kennzeichnung von DRG - die Visualisierung von kleinen Gruppen von DRG-Neuronen und damit die Analyse einze...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Stereomikroskop Stemi DR Kongo </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Lösung (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standard-OP-Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Zahnriemen Standard Pinzette </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra fine Iris Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Pinzette </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 feinen Spitzen einer Pinzette </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 Hochglanz Zange </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-Tübingen Frühjahr Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Filterpapier </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Welt Precission Instruments </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm-Petrischalen </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12-ml Polypropylen-Röhrchen </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12-Well-Zellkulturplatten </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Mikropipette Puller P-97 </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DiI (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethyl - indocarbocyanine Perchlorat) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger SuperFrost Plus </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Glasdeckgläschen </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870,2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

Hier präsentieren wir eine Technik, um die Flugbahnen der kleinen Gruppen von DRG-Neuronen in den embryonalen Rückenmark Label diffusive Färbung unter Verwendung des lipophilen Tracer 1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI) 1 . Der Vergleich der axonalen Bahnen von Wildtyp-mit denen der Maus Zeilen, in denen Gene mutiert sind erlaubt die Prüfung für eine funktionale Rolle der Kandidaten-Proteine ​​in der Kontrolle des axonalen Verzweigungen, die ein wesentlicher Mechanismus in der Verdrahtung des Nervensystems ist. Axonal Verzweigung ermöglicht ein einzelnes Neuron mit mehreren Zielen verbinden, wodurch die physikalische Grundlage für die parallele Verarbeitung von Informationen. Ramifications bei mittleren Zielregionen des axonalen Wachstums kann von Endverzweigung unterschieden werden. Darüber hinaus kann in verschiedenen Modi axonale Verzweigung Bildung abhängig davon, ob Verzweigung ergibt sich aus der Tätigkeit des Wachstums Kegel (Splitting oder verzögert BH klassifiziert werdennching) oder aus den Knospen von Sicherheiten aus dem Axon Welle in einem Prozess namens interstitielle Verzweigung 2 (Abb. 1). Die zentralen Projektionen von Neuronen aus dem DRG bieten ein nützliches experimentelles System, um beide Arten von axonalen Verzweigung Studie: wenn ihre afferenten Axone erreichen die Spinalganglien entry zone (Drez) des Rückenmarks zwischen embryonalen Tage 10 bis 13 (E10 - E13) sie Anzeige einer stereotypen Muster von T-oder Y-förmigen Verzweigung. Die beiden entstehenden Tochterzellen Axone dann in rostralen oder kaudalen Richtungen gehen jeweils an der dorsolateralen Rand der Schnur und erst nach einer Wartezeit Sicherheiten sprießen aus diesen Stammzellen Axone in die graue Substanz (interstitielle Verzweigung) und Projekt-Relais Nervenzellen in bestimmten eindringen Laminae des Rückenmarks, wo sie weiter verzweigen (Klemme Verzweigung) 3. DiI Kurven haben das Wachstum Kegel an der Spinalganglien Eingangszone des Rückenmarks, die in der pr sein schien enthülltocess der Aufspaltung darauf hindeutet, dass Bifurkation durch die Spaltung des Wachstums Konus selbst 4 (Abb. 2) verursacht wird, jedoch auch andere Optionen, wie gut 5 diskutiert worden. Dieses Video zeigt zunächst, wie man das Rückenmark von E12.5 Mäusen Verlassen des DRG befestigt sezieren. Nach der Fixierung des Prüflings winzige Mengen DiI angewendet werden, um DRG mit Glas Nadeln aus Kapillaren gezogen. Nach einer Inkubationszeit Schritt wird der markierte Rückenmark als ein umgekehrtes Open-Book Vorbereitung auf einzelne Axone mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert montiert.

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DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Die stereotypen Projektionen von sensorischen Afferenzen in das Nagetier Rückenmark bieten eine leicht zugängliche experimentelle System zur axonalen Verzweigung durch die Verfolgung einzelner Axone zu studieren.

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.8K Aufrufe.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine. Die stereotypen Projektionen von sensorischen Afferenzen in das Nagetier Rückenmark bieten eine leicht zugängliche experimentelle System zur axonalen Verzweigung durch die Verfolgung einzelner Axone zu studieren.

Serie: DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...