Wir bedanken uns bei einem internen Fonds von der University of Oklahoma (bis BZ) und einen Zuschuss von NSF (IOS-1025556, zur BZ und RAB) für die Unterstützung TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, und diese Forschung. Eine NIH (RO1 NS060878, um BZ) teilweise RAB unterstützt. RAB erkennt ein NIH NRSA (T32 NS07292) Ausbildung Zuschuss für Brandeis University und einen NIH (RO1 GM21473) bewilligt, um Jeffrey Hall an der Brandeis, für die Unterstützung der frühen Phasen der Studie. Wir danken Jeffrey Hall für seine kontinuierliche Ermutigungen für dieses Projekt. Wir danken Dr. Kristin Scott für die Bereitstellung der Wanne P&gt; GAL80&gt; Stamm.

1. Drosophila-Stämmen <ol><li> Gal4-Treiber: GMR-Gal4, die Gal4 drückt in Sehzellen. </li><li> UAS-Linien UAS-MJD78Q (oder UAS-polyQ), die neuronale Degeneration verursacht in Gal4-exprimierenden Zellen. UAS-GFP, die GFP drückt in Gal4-exprimierenden Zellen. </li><li> FLP-Linien ey-FLP, das FLP drückt in Photorezeptoren und in Teilmengen von Hirnregionen. ET-FLPx2 Linien, die Enhancer-trap-Linien, die zwei Kopien von FLP (FLP-IRES-FLP) sind. Wir haben ~ 1.000 ET-FLP-Linien (Bohm et al., 2010), dessen Expressionsmuster sind noch nicht charakterisiert werden generiert. Hier beschreiben wir die Charakterisierung der Expressionsmuster wählen ET-FLPx2 in die Larven und erwachsene Fliege zentralen Nervensystems (ZNS). </li><li> FLP-Reporter yw, Aktin P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), in der über die Expression der ET-FLPx2 durch Aktin-P&gt; Gal4; UAS-GFP auf FLP-vermittelte recombinational Exzision&gt; CD2. </li><li> Zwei komplementäre GAL80-converting-Tools Tub P&gt; GAL80&gt; (Gordon &amp; Scott, 2009), die Flip-out-Konstrukt, das konstitutiv GAL80 in allen Geweben durch eine starke Tubulin-Promotor angetrieben. Bei FLP-vermittelte Rekombination, ist&gt; GAL80 ausgeflippt und GAL80 Ausdruck wird nur in gekündigt ET-FLPx2-exprimierenden Geweben. Tub P&gt; stop&gt; GAL80 (Bohm et al., 2010), die Flip-in zu konstruieren, die nicht exprimiert GAL80 unter normalen Bedingungen. GAL80 Ausdruck ist auf die Tubulin-Promotor nur in sich ET-FLPx2-exprimierenden Geweben, in denen FLP Flips out&gt; Stop und Flips in GAL80. </li><li> Fliegen zum Testen FLP Aktivität im Facettenauge GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 (Bohm et al, 2010.), Das hat entartet und depigmented Augen. In FLP-exprimierenden Sehzellen ist polyQ Ausdruck aus folgenden GAL80 Flip-in aktiviert. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) Wanne P&gt; GAL80&gt;, die normale Augen hat. In FLP-exprimierenden Sehzellen ist polyQ Ausdruck auf folgenden GAL80 Flip-herausstellen. </li></ol> 2. Reagenzien Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, 1X), pH 7,4. 4% Paraformaldehyd (PFA), in PBS von 16% PFA, EM Grad (Kat. Nr. 15710, Electronic Microscopy Sciences, Hatfield, PA) verdünnt PBT, 1XPBS mit 0,1% Triton-X 100 (Sigma) Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa), Flecken alle Neuronen in Drosophila. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa) Flecken Gliazellen in Drosophila. Alexa 594 Hühner gegen Maus Sekundär-Antikörper (Invitrogen) 3. Mapping the Expressionsmuster von Enhancer-trap FLPx2 Zeilen (* entscheidende Schritte) <ol><li> Sammeln Jungfrauen Frauen aus der yw, Aktin P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP Linie und Kreuz Männchen einzelnen ET-FLPx2 Linien. Der ehemalige dient als GFP-Reporter für die Gewebe-Expression von ET-FLP. </li><li> * Dissect wandernde 3 rd instar F1-Larven, behalten das ZNS (dh, das Gehirn und das Bauchmark, VNC) und die Wand des Körpers, fix für 1 Stunde in 4% PFA auf Eis, wäscht mit eiskaltem PBS 3X gefolgt von 3X Waschen mit PBT. Zergliederung <ol><li> Entfernen Sie wandern 3 rd instar F1-Larven und legen Sie sie in eine saubere Schüssel Sylgard (35 mm x 10 mm Petrischale mit 2 Gramm Sylgard gefüllt - gemischt nach den Anweisungen der Herstellung). <ol><li> Entfernen Sie Speisereste mit Pinsel </li></ol></li><li> Füllen Sie die Schüssel mit eiskaltem 1XPBS und auf Eis stellen, um die Larven zu betäuben </li><li> Halten Sie den Mund Haken einer Larve mit einer Pinzette und greifen die Schuppenschicht in der Nähe der Erweiterung vorderen Luftloch mit einer anderen Pinzette und schälen die Oberhaut sich zum hinteren Ende. Das ZNS wird in den Mund befestigt werden Haken zusammen mit den Speicheldrüsen, Darm und Imaginalscheiben. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Gewebe und Imaginalscheiben Umgebung des ZNS. </li><li> Übertragung des ZNS zu einer PBS-gefüllten 3 gut Pyrex Schüssel. <ol><li> Eine silikonisierte P200 Pipettenspitze kann verwendet werden, um zu vermeiden das Trocknen des Gewebes werden. </li></ol></li><li> Fix für 1 Stunde in 200 ul 4% PFA auf Eis. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass das ZNS ist voll in die PFA untergetaucht. <ol><li> Wenn das ZNS schwimmt, dies in der Regel darauf hin, dass das ZNS nicht richtig aus dem umgebenden Gewebe gereinigt. </li></ol></li></ol></li><li> 3x mit eiskaltem PBS von 3X Waschen mit PBT gefolgt. </li></ol></li><li> * Dissect des ZNS von adulten F1 Fliegen. <ol><li> Anesthetize die Fliegen mit CO 2 oder legen Sie das Fliegen in ein leeres Fläschchen auf Eis für 10 Minuten enthalten. </li><li> Ort erwachsenen Fliegen in eine 95% EtOH gefüllten Glasschale auf Eis für 30 sek. </li><li> Übertragen Sie die erwachsenen Fliegen in eine 1XPBS gefüllt Glasschale auf dem Eis. <ol><li> Waschen mit eiskaltem 1X PBS 3X, um restliches EtOH entfernen </li></ol></li><li> Platzieren Sie eine Fliege in einer 35-Sylgard Schüssel mit eiskaltem 1X PBS gefüllt </li><li> Legen Sie die Bauchseite nach oben und stecken ein kleines Insekt Stift (minutiens Stifte 0,1 mm) auf halbem Wege durch die Bauchdecke. <ol><li> Mit einer Pinzette halten die Basis der Beine und entfernen Sie die Beine mit einer anderen Pinzette. </li></ol></li><li> Entfernen Sie den Kopf Nagelhaut <ol><li> Während packte den Rüssel mit einer Pinzette, legen Sie eine weitere unterhalb des Auges und schälen die Oberhaut auf der dorsalen Mittellinie der Fliege den Kopf. </li><li> Schnappen Sie das andere Auge und entfernen Sie die restlichen Schuppenschicht auf der anderen Seite. </li><li> Mit scharfen Pinzette und / oder geschärft Wolframnadel, entfernen tracheale umgebende Gewebe des Gehirns <ol><li> Unsachgemäße Reinigung der Luftröhre wird in starker Autofluoreszenz dadurch behindert GFP-Expression, und damit das Gehirn beim Fixieren float </li></ol></li></ol></li><li> VNC Dissection <ol><li> Entfernen Sie die Brust Nagelhaut <ol><li> Beginnend am hinteren Ende des Thorax, Platz zwei Pinzetten an jeder Seite des 3. preepisternum (dh, packte der Basis der Hinterbeine). </li><li> Vorsichtig trennen die Nagelhaut entfernt von der ventralen Mittellinie Linie, wiederholen Sie diesen, bis Sie die Basis des Halses erreichen. </li><li> Spreizen Sie die beiden Hälften des Thorax Nagelhaut Freilegung der VNC </li></ol></li><li> Nächste entfernen den Bauch aus dem Thorax. Bei der Verwendung einer Pinzette auf den Thorax bei der zweiten Etappe Basis zu halten, verwenden Sie eine andere Zange auf den Bauch in der Nähe der 1. Bauch-Sternit packen und ziehen Sie den Bauch ab. </li><li> Um den VNC aus den umliegenden thorakalen Gewebe zu entfernen. Halten Sie den Oberarmkopf mit einer Pinzette und mit einer anderen Pinzette sanft losreißen die Mehrheit der Brust-Karkasse. </li><li> An diesem Punkt sollte es einen Ring aus Bindegewebe um den zervikalen Bindegewebe (Hals) werden. Mit zwei Zangen reißen den Ring auseinander. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Brust-Gewebe um den VNC </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Gehirn-und VNC auf 9-und Pyrex Schüssel mit 1X PBS auf Eis <ol><li> Eine silikonisierte P200 Pipettenspitze kann verwendet werden, um zu vermeiden das Trocknen des Gewebes werden </li></ol></li></ol></li><li> * Fix der erwachsenen ZNS für 1 Stunde in 4% PFA auf Eis und wäscht mit eiskaltem PBS und 3X mit PBT 3X. </li><li> Inkubieren Sie die erwachsenen ZNS Vorbereitung oder die Larven ZNS und Körper Wand bei 4 ° C über Nacht mit Antikörpern entweder Neuronen (anti-Elav, 1:10) oder Gliazellen (anti-Repo. 1:10). Waschen Sie die Vorbereitung 5X mit PBT. </li><li> Inkubieren mit Erwachsenen oder Larven-Vorbereitung mit Alexa 594 Hühner gegen Maus Sekundär-Antikörper (1:100) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, und waschen Sie das Präparat mit PBS. </li><li> Montieren Sie die Larve oder das adulte ZNS auf einer Folie. Zur Erhaltung der natürlichen Form des ZNS, verwenden Sie einen O-förmigen Kunststoff-Ring (Clear Reinforcement Label, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) auf der Folie als Mini-Brücke zum Deckglas auszusetzen. </li><li> Untersuchen Sie die Vorbereitung für GFP und Elav (oder Repo) Expressionsmuster unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 4. Die Anwendung von zwei sich ergänzenden GAL80-Converting-Werkzeuge der Repression Gal4 in Photorezeptoren <ol><li> Flipping GAL80 erfolgt über Wanne P&gt; GAL80&gt; (Abbildung 5A). <ol><li> Sammeln Männchen von den GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; GAL80&gt; Linie. Beachten Sie, dass die Facettenaugen sind normal in diesen Fliegen. </li><li> Mate mit ey-FLP Jungfrauen. </li><li> Sammeln Sie die F1 Fliegen und untersuchen das Auge Phänotyp. </li></ol></li><li> Flipping GAL80 in über Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 (Abbildung 5B). <ol><li> Sammeln GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 männlichen Fliegen und untersuchen das Auge Phänotyp. Beachten Sie die entarten und depigmented Augen in diese Fliegen zu Wildtyp-Stämme (Canton-S) im Vergleich </li><li> Mate mit ey-FLP Jungfrauen; </li><li> Sammeln Sie die F1 Fliegen und untersuchen das Auge Phänotyp. </li></ol></li><li> Wählen ET-FLPx2 Linien mit Ausdruck in Sehzellen </li></ol> Schritte 4.1 und 4.2 kann wiederholt werden, mit ET-FLPx2 Linien sein, dass ausdrückliche FLP in einer Untergruppe von Sehzellen. Alternativ entweder der GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Fliegen oder GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; GAL80&gt; Fliegen können die einzelnen ET-FLPx2 Zeilen-Bildschirm für Linien überschritten, die zum Ausdruck FLP in Sehzellen. Wertvolle ET-FLPx2 Linien sind diejenigen, die nur ausdrücken FLP in einer Untergruppe oder einzelne Sehzellen (Abbildung 6). 5. Repräsentative Ergebnisse Das Expressionsmuster von einer bestimmten ET-FLPx2 Linie kann leicht überprüft und dokumentiert in der F1-Larven oder erwachsenen Fliegen aus der Kreuzung zwischen yw, Aktin P abgeleitet&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP Jungfrauen und ET-FLPx2 Männer (Abbildung 1) . Typischerweise repliziert drei vor fünf der F1-Tiere werden seziert und untersucht, um die Reproduzierbarkeit der FLP Expressionsmuster (Bohm et al., 2010) zu bestimmen. <strong&gt; Abbildung 2 zeigt die Expression der FLP in ET-FLPx2 Linie 173A in die Larven und erwachsenen ZNS. Die FLP-Muster kann weiter analysiert werden mit Hilfe eines neuronalen oder glialen Marker (Abb. 3 und 4). Die Ergebnisse in Abbildung 7 zeigen die Wirksamkeit von GAL80 Flip-in-und Flip-out-Systeme in intersectional Verdrängung der Gal4 folgenden FLP-vermittelte Rekombination. Die Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Konstrukt scheint nicht alle undichten Ausdruck GAL80 (basierend auf den einheitlichen Degeneration und Depigmentierung von Photorezeptoren) haben, und doch ist es 100% effektiv in Spiegeln GAL80 in mit Hilfe von eyFLP zu unterdrücken GMR- Gal4 und zur Wiederherstellung der Blick auf normale Erscheinungen (Abb. 7A). Im Gegenteil, Badewanne P&gt; GAL80&gt; voll unterdrückt GMR-Gal4 vor der Einführung von eyFLP. Nach GAL80 Flip-out,, GMR-Gal4-Laufwerke UAS-polyQ Ausdruck, was zu entarten und depigmented Augen (Abb. 7B). In diesem Beispiel verwendeten wir ein pan-photorecetor FLP zu dem Fotorezeptor &quot;Schaltungen&quot; Karte, aber nicht untersuchen die Auswirkung auf das Verhalten. Mit ähnlichen Ansätzen mit verhaltensrelevanter Gal4 Linien, wir Teil der CCAP-Gal4 Schaltung abgebildet Regulierung Flügel Expansion in erwachsenen Fliegen (Bohm et al., 2010). Wir glauben, dass die FINGR Methode wird bei der Unterstützung von unserem Verständnis der neuronalen Grundlagen von Verhalten wertvoll. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. . Untersuchung des Expressionsmusters eines ET-FLPx2 line Das FLP Expressionsmuster (blau Ovale) von einem ET-FLPx2 Linie kann durch Überschreiten einer ET-FLPx2 männlichen (oben links) mit einem Aktin-P&gt; CD2&gt; Gal4 bestimmt werden; UAS- GFP Jungfrau (oben rechts). Ubiquitous Aktin P&gt; Gal4 Ausdruck in der elterlichen Weibchen ist durch die Einfügung der FRT (graue Dreiecke) flankiert CD2 Folge behindert. In der F1-Nachkommen, wird FLP Verbrauchsteuern die CD2-Sequenz erlaubt Aktin P&gt; Gal4 zu UAS-GFP-Expression zu fahren. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Expression Muster einer ET-FLPx2 Linie in der larvalen und adulten Zentralnervensystems. Diese Bilder zeigen das ZNS (Gehirn und Bauchmark, VNC) aus dem Nachwuchs von der Paarung yw, Aktin P produziert seziert&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP Eltern auf die ET-FLPx2 173A Linie. Durch Rekombination aus dem&gt; CD2&gt; Kassette, aktiviert FLP Aktin P&gt; GAL4 Ausdruck (die konsequente Ausdruck der UAS-GFP). Daher meldet der GFP-Muster FLP-exprimierenden Zellen. Panel A zeigt die Larven FLP Expressionsmuster während Panel B zeigt die Erwachsenen Expressionsmuster in line 173A. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Charakterisierung von Zelltypen, die Flippase Ausdruck in ET-FLPx2 Line # 688A. A, A Composite-Bild von einem festen F1 3 rd instar Larve mit anti-REPO aus einer Kreuzung zwischen ET-FLPx2 Zeile # 688A und ein GFP Flippase Berichtslinie gefärbt. BD, A hoher Vergrößerung (Zeiss Plan-Apochromat 63x Öl) Blick aus dem hinteren Ende eines VNC von einem 3 rd Larvenstadium übernommen. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Charakterisierung von Zelltypen innerhalb der Pilzkörper von ET-FLPx2 Line # 150. AC, A hoher Vergrößerung Bild (63x Öl-Immersion) der Pilzkörper von einem festen F1 dritten Larvenstadium Larve mit anti-REPO gefärbt. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Illustration von GAL80 Flip-in und Flip-out-Strategien. A. In den Flip-out-Strategie, Tubulin-Promotor angetrieben GAL80 (Tub P&gt; GAL80&gt;) ist konstitutiv aktiv, was die Unterdrückung der GMR-Gal4 und einem Wildtyp-Augen-Phänotyp (rote Augen). Diese Repression ist durch die Einführung von FLP (violett), die GAL80 out (Mitte, rot) Flip und ermöglichen es GMR-Gal4 zu UAS-polyQ Ausdruck Laufwerk entfernt. Dies führt in Photorezeptorzelle Degeneration (dargestellt durch weiße Punkte im Auge). B. In der reziproke Wert der bisherigen Strategie, ist Tubulin-Promotor angetrieben GAL80 Ausdruck von FRT (graues Dreieck) flankiert &quot;Stop&quot;-Codon unterbrochen. In Abwesenheit von GAL80 bindet GMR-Gal4 zu UAS-polyQ verursacht neuronale Degeneration in Photorezeptoren (dargestellt durch weiße Punkte im Auge). Nach der Überquerung der GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Männchen mit jungfräulichen Weibchen, die FLP auszudrücken in der Sehzellen, FLP (violett) wird Rekombination am FRT Websites katalysieren, Ausschneiden der &quot;Stop&quot;-Codon (Mitte, rot), so dass für GAL80 Meinungsäußerung und der GMR-Gal4. Dieser behält die Neurodegeneration in Sehzellen (dargestellt durch den Mangel an white Punkte im Auge). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Die Anwendung der Methode in FINGR Spiegeln GAL80 erfolgt mit ET-FLPx2 Line # 688A F1-Nachkommen aus einer Kreuzung zwischen ET-FLPx2 Zeile # 688A Jungfrau GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 männlich. Das Fehlen von Pigment in der Mitte des Auges Ommatidia stellt FLP Ausdruck in Zeile # 688A. In diesem Bereich GAL80 Unterdrückung von GMR-Gal4 war erleichtert, so dass die Gal4 zu UAS-polyQ fahren. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Abbildung 7"/> Abbildung 7. Die Anwendung der Methode in FINGR Spiegeln GAL80 in oder out zu Gal4 in Photorezeptoren schneiden. A. Die Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Flip-in-System beschränkt GAL4 Ausdruck in einer FLP-abhängigen Weise. In GMR-Gal4, UAS-polyQ; Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Fliegen, Sehzellen sind entartet und depigmented (links fliegen). Nach der Einführung der eyFLP ist GAL80 in Photorezeptor-Zellen exprimiert, was zu einem vollen Unterdrückung von GMR-Gal4, die wiederum schaltet den Ausdruck polyQ und produziert Fliegen mit normalen Augen (rechts fliegen). B. Die Wanne P&gt; GAL80&gt; flip -out-System funktioniert in umgekehrter Weise, wie die Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 Flip-in-System. Tub P&gt; GAL80&gt; konstitutiv reprimiert GAL4 und unterdrückt die Expression von polyQ (links fliegen, mit normalen Augen). Nach der Einführung der eyFLP ist GAL80 ausgeflippt von Sehzellen, entlastet die Unterdrückung der GMR-Gal4 und Drehen auf die Expression polyQ. Dies führt zu Fliegen mit degenerierten und depigmented Augen (rechts fliegen).

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Die Gal4/UAS System wurde vielfach und erfolgreich durch Drosophilists für verschiedene biologische Studien (; Duffy, 2002 Brand &amp; Perrimon, 1993) verwendet. Bis heute hat die Fliege-Community Tausende von Promotor-driven und Enhancer-trap Gal4 Linien erzeugt. Eine wesentliche Stärke des FINGR Methode ist, dass es mit dem Gal4/UAS ist, die es ermöglichen, deutlich erweitern die Macht der Gal4 in Drosophila-Studien. Eine wichtige Anwendung der FINGR Methode ist die Feinabstimmung neuronalen Schaltkreisen zugrunde liegende Verhalten durch Gal4/Gal80 Kreuzung. Diese Verhaltensweisen können beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Lernen und Gedächtnis, Balz, Schlaf und zirkadiane Rhythmik beschränkt. Die FINGR Methode kann auch verwendet werden, um die kritische Neuronen, die anfällig für Neurodegeneration bei der Modellierung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), und der Parkinson-Erkrankungen sind abzubilden. In ähnlicher Weise könnte Brennpunkte von Neuronen oder neuronalen Schaltkreisen entscheidend für die Vermittlung von Kokain, Alkohol und andere Substanzabhängigkeit abgebildet mit dem FINGR Methode. Anzumerken ist, dass bedingte Gal4s (Osterwalder et al, 2001..; Roman et al, 2001) werden mit dem FINGR Methode könnte benutzt werden, um zeitliche Steuerung der neuralen Schaltkreisen und Verhaltensweisen zu erlangen. Änderung des GAL80-converting-Tools mit einem temperaturempfindlichen GAL80 (GAL80 ts, McGuire et al., 2003) produzieren kann Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 ts oder Badewanne P&gt; GAL80 ts&gt;, Hinzufügen weiterer zeitlicher Flexibilität in der Schaltung Manipulation. Jenseits des Nervensystems ist die FINGR Methode gleichermaßen für die Beschränkung Gal4 Ausdruck in Teilmengen von Zellen, ob es die Flügel oder das Bein. Die ET-FLPx2 Linien eine wertvolle Ressource für alle Drosophila Biologen in FRT / FLP-basierte klonale Analyse (Xu &amp; Rubin, 1993), einschließlich MARCM (Lee &amp; Luo, 1999) interessiert sein. Es wird auch erwartet, dass einige ET-FLPx2 Linien können Hitzeschock-FLP für die Herstellung von reproduzierbaren Klonen und für die wiederholte morphologischen und Verhaltensanalysen zu ersetzen. Wie Enhancer-trap Gal4-Linien sind die meisten ET-FLPx2 Linien unwahrscheinlich, dass speziell in den Zellen ein Interesse ausgedrückt werden. Die meisten Linien werden FLP in die Zellen von Interesse und in anderen Zellen oder Geweben, wie gut ausdrücken. Allerdings wird der Mangel an &quot;Gewebsspezifität &#39;der beiden Gal4 und ET-FLPx2 nicht ein wichtiges Anliegen für die FINGR Methode, solange ihre überlappenden Bereich wünschenswert für ein bestimmtes Experiment ist. FINGR wurde entwickelt, um zwei &quot;großen&quot; Systemen in einer raffinierten eine Umdrehung. Die Methoden in diesen Protokollen dargestellt sind eher Standard und sollte reproduzierbar sein. Die wichtigsten Vorsichtsmaßnahmen Schritte, die die Aufmerksamkeit erfordern, sind die Auswahl und Nutzung der Fixateur. Fixative andere als PFA sollte vermieden werden, da sie GFP Signal auslöschen werden. Wir haben auch festgestellt, dass die Dissektion Gericht sollte nicht zur Fixierung mit PFA verwendet werden, um die Möglichkeit, dass FLP Ausdruck nicht zuverlässig von GFP gemeldet werden vermieden.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

Die Gal4 / UAS binären Methode ist mächtig für die Gen-und neuronalen Schaltkreisen Manipulation in Drosophila. Für die meisten neurobiologischen Studien ist jedoch Gal4 Ausdruck selten Gewebe-spezifisch genug, um für eine präzise Korrelation der Schaltung mit Verhaltensproblemen Auslesen zu ermöglichen. Zur Überwindung dieser großen Hürde haben wir vor kurzem entwickelte die FINGR Methode zu einer restriktiveren Gal4 Ausdruck in das Gewebe von Interesse zu erreichen. Die FINGR Methode besteht aus drei Komponenten: 1) die traditionelle Gal4/UAS System, 2) eine Reihe von FLP / FRT-vermittelte GAL80 Konvertierungstools, und 3) Enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 wird verwendet, um die primären neuronalen Schaltkreise von Interesse zu definieren. Vergleich der Gal4 mit einem UAS-Effektorzellen, wie UAS-MJD78Q oder UAS-Shi ts, regelt die neuronale Aktivität, die wiederum durch Veränderungen in-the-fly Verhalten manifestiert. Mit einem zusätzlichen UAS-Reporter wie UAS-GFP, die neuronalen Schaltkreis in das spezifische Verhalten Beteiligten können gleichzeitig für die morphologische Analyse zugeordnet werden. Wanne P&gt; GAL80&gt; (&quot;flip out&quot;) und Wanne P&gt; stop&gt; GAL80 (&quot;Flip-in &#39;):. Für Gal4 Linien mit breiten Ausdruck kann Gal4 Ausdruck mithilfe zweier komplementärer GAL80-converting-Tools beschränkt werden Schließlich können die Ermittler wiederum GAL80-oder ausschalten, bzw. mit Hilfe von Gewebe-spezifischen ET-FLP. In den Flip-in-Modus, GAL80 wird Gal4 Ausdruck, wo Gal4 und ET-FLP schneiden zu unterdrücken. In den Flip-out-Modus, wird GAL80 entlasten Gal4 Repression in Zellen, in denen Gal4 und FLP überlappen. Beide Ansätze ermöglichen die Beschränkung der Anzahl der Zellen in der Gal4-Schaltung definiert, sondern in einer inversen Muster. Die FINGR Methode ist kompatibel mit dem riesigen Sammlung von Gal4-Linien in-the-fly-Community und vielseitig einsetzbar für traditionelle klonale Analyse und neuronalen Schaltkreis-Mapping. In diesem Protokoll, zeigen wir die Zuordnung von FLP Expressionsmuster in ausgewählten ET-FLPx2 Linien und die Wirksamkeit der Methode FINGR in Sehzellen. Das Prinzip der FINGR Methode sollte auch auf andere genetische Modellorganismen in der Gal4/UAS, GAL80 und FLP / FRT verwendet werden.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Wir beschreiben ein Flippase-induzierte intersectional Gal80/Gal4 Repression (FINGR)-Methode, so dass Gewebe-spezifische FLP zu GAL80 Expressionsmuster zu bestimmen. Überall dort, wo Gal4 und FLP überlappen, wird Gal4 Ausdruck eingeschaltet (GAL80 ausgeflippt) oder aus (GAL80 gespiegelt in). Die FINGR Methode ist vielseitig für klonale Analyse und neuronalen Schaltkreis-Mapping.

Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K Aufrufe.  University of Oklahoma - Norman. Wir beschreiben ein Flippase-induzierte intersectional Gal80/Gal4 Repression (FINGR)-Methode, so dass Gewebe-spezifische FLP zu GAL80 Expressionsmuster zu bestimmen. Überall dort, wo Gal4 und FLP überlappen, wird Gal4 Ausdruck eingeschaltet (GAL80 ausgeflippt) oder aus (GAL80 gespiegelt in). Die FINGR Methode ist vielseitig für klonale Analyse und neuronalen Schaltkreis-Mapping.

Serie: Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Funktionelle Bildgebung Auditory Cortex bei erwachsenen Katzen mit Hochfeld-fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

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The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Verhalten der Erwachsenen aus einer seitlichen Perspektive

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...