AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01: Diese Arbeit wurde durch Stipendien an SMM finanziert. Zusätzliche Unterstützung wurde bereitgestellt durch: DW: NIH RO1DK075013, DDK und der Kleberg Foundation, die UCCC Durchflusszytometrie Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), der UCCC Microarray-Kern (NCI P30 CA 46934-14).

1. Lung Isolation <ol><li> Sacrifice erwachsenen Mäusen (8-10 Wochen im Alter; 18-20 g; C57Bl6J) Mäuse mit einer Überdosis Isofluran durch Ausbluten mit sterilen Technik gefolgt. Profile variiert leicht zwischen den Stämmen. </li><li> Chirurgisch entfernen Sie die Membrane, öffnet den Brustraum durch Schneiden der Brustkorb seitlich auf jeder Seite der Maus. Spülen Sie das Blut aus der Lunge durch Perfusion der rechten Herzkammer vorsichtig mit 3-5mls von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Präparieren Sie die Lungenlappen Entfernen der Luftröhre und großen Bronchien und in eine Petrischale mit Hanks gefüllt Salzlösung (HBSS). Nach Sammlung aller Lungenlappen Pinzette verwendet, um Gewebe auf den Deckel der Schale statt. Das Gewebe wird dann in kleine Stücke mit Einweg-Skalpelle mit genügend Flüssigkeit, um sie feucht, aber nicht so sehr, dass sie und Schwimmer bewegen zerkleinert. </li><li> Zerlegen einen Hinterlauf eines der Mäuse und zu isolieren, das Knochenmark als eine Färbung verwenden, um das flo gesetztw-Zytometrie Tore. Stain des Knochenmarks (BM), wie oben beschrieben 1. </li></ol> 2. Erstellung eines Single Cell Suspension aus Lungengewebe <ol><li> ; In sterile HBSS gelöst 5mls vorgewärmtes 0,2% Worthington Collagenase Typ 2 (cat # LS004202 Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ): Jede Lunge wird durch die Verwendung eines optimierten Gewebe Gewicht zu Volumen-Verhältnis von 0,2 g verdaut. Die Mischung wird in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min 2,3 getaucht. </li><li> Man reibt Probe gut, bis Lungengewebe verdauen fließt leicht durch ein 10ml-Pipette (ca. 10 Wiederholungen). Inkubieren für weitere 15 min bei 37 ° C zur Vervollständigung der Gewebe verdaut und sorgt für eine gleichmäßigere einzigen Zellsuspension. </li><li> Verdünnen Sie die Lunge Zellsuspension mit HBSS und verreiben mit einer 5ml Pipette, um restliches Gewebestücke zu zerstreuen. </li><li> Filter die Suspension mit einer 70μM Zelle Sieb, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen. Probe in Multipl aufgeteilt werdene konische Röhrchen an dieser Stelle auf eine Überlastung einer Zelle Sieb und die Zeit verringern. </li><li> Pellet die Zellsuspension für 10 min bei 1500 rpm und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Resuspendieren Zellpellet vorsichtig mit Raumtemperatur RBC Lysispuffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) und inkubieren bei RT 5 min. Fügen Sie ein gleiches Volumen an HBSS dem Lysepuffer inaktiviert und Filtern der Zellsuspension mit einer 40 um Zellsieb zu Schutt und Zellaggregate zu entfernen. </li><li> Pipette 10 &amp;mgr; l jeder Probe werden gefärbt und zählen Zellzahlen sowohl für die Lungen-und BM-Proben mit einer Zählkammer. Hinweis: Notieren Sie sich die Gesamtmenge der Zellen. </li><li> Pellet die einzigen Zellsuspension von Lungenzellen durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min. </li><li> Resuspendieren beide Lungen-und BM-Zellen bei 1x10 6 Zellen / ml in vorgewärmten (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit hoher Glukose (Gibco, Carlsbad, CA, cat # 11965-092) mit 2% fetalem bovine Serum (FBS) und 10mm HEPES. </li><li> Bereiten Sie eine 1mg/ml Stammlösung von Hoechst 33342 Farbstoff (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; cat # B2261) in Wasser und Filter sterilisieren 1,4. Die Hoechst-Farbstoff kann als Aliquots bei -80 ° C gelagert werden </li><li> Add Hoescht 33342 Farbstoff zu einer Endkonzentration von 5μg/ml (a 200x Verdünnung einer 1mg/ml stock) zu den einzelnen Zell-Suspension. </li><li> Mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges Inversion und inkubieren in 37 ° C Wasserbad für genau 90 Minuten. </li></ol> 3. Färbung und Vorbereitung der Lung Zellsuspension für Durchflusszytometrie <ol><li> Nach 90 min alle Schritte mit Hoechst gefärbt Lungenzellen muss bei 4 ausgeführt werden ° C oder auf Eis zu färben Efflux zu verhindern. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min bei 4 ° C, und Zellen in eiskaltem Färbepuffer (PBS +2% FBS). </li><li> Die Zellen in einer Konzentration von nicht mehr als 1x10 7 Zellen / Tube mit 300-600μl PBS mit 2%FBS und 10 mM HEPES. </li><li> Ausreichend kicherten hinzufügen CD45-Antikörper (typischerweise 1:200 Verdünnung des CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864), um die Lungen-und BM-Proben auf Eis inkubieren für 10-15 min Inklusive ungefärbten Kontrolle während der.. experimentelle Vorgehensweise ist sinnvoll, die Analyse Toren gesetzt. </li><li> Pellet-Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute. Dekantieren Sie den Überstand und die Zellen in 500 ul von gekühlten Färbepuffer (PBS +2% FBS). Transfer zum vorgekühlten Schnappdeckel Polypropylenröhrchen (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). </li><li> Add Propidiumiodid (PI, 200μg/ml Lager in PBS), um die Proben für eine Endkonzentration von 2μg/ml um tote Zellen auszuschließen. PI muss in Kombination mit dem Hoechst 33342 Farbstoff auf die richtige Fluoreszenz-Profil auf die durchflusszytometrische Analyse zu erreichen verwendet werden. </li><li> Shop Röhrchen auf Eis, von leichten bis Durchflusszytometrie geschützt. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie-Analyse zu definieren und zu isoliereneine Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge) Bevölkerung mit Hoechst-Farbstoff Efflux zu einem Side Population (SP) Detect <ol><li> Dieser Test hat folgende gerätespezifische Anforderungen: </li><ul><li> 488 nm und UV (350-355 nm) Laser </li><li> 2 Detektoren auf dem UV-Laser-Pfad mit blauen (450/65) und rot (675/50) Filter. </li><li> Die UV-Infrarot-Detektor müssen eine hohe Sensibilität für das rote Signal. Dies kann ein Problem mit älteren Zellsortern werden. </li><li> Chiller-Einheit, um die Probe bei 5-10 ° C zu halten </li></ul><li> Richten Laser und eingerichtet für Zellsortierung nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Sammeln Sie die rote (x-Achse) und Blau (y-Achse) Hoechst-Signale mit einer linearen Skala. </li><li> Passen Sie die Photomultiplier Spannungen an die G0/G1 Gipfel in der oberen rechten Ecke des Zentrums Platz auf dem Grundstück für eine angemessene Darstellung von der hinteren Seite der Bevölkerung zu ermöglichen. Ein Teil der S-Phase und die gesamte G2 des Zellzyklus kann off-Skala auf der rechten oberen Ecke des Grundstückes. Die blaue signal ist relativ hell, während das rote Signal ist schwach. Typische MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) Spannungen sind 425 für den blauen und 650 für den red. </li><li> Tote Zellen werden gated unter Verwendung von PI. Die Standard-PI-Pfad (Anregung 488nm, Emission 630nm) verwendet werden kann. Alternativ ist PI auch durch die UV-Laser angeregt und die Toten Zellpopulation liegt außerhalb des Messbereichs auf der rechten Seite der Side Population (SP) Plot. Somit entfällt die Notwendigkeit, die PI-Signal von einem anderen Fluorochromen wie FITC und PE zu kompensieren. Die ursprüngliche Goodell Methode folgte dem letzteren Verfahren 5-7. </li><li> Achten Sie auf eine relativ geringe Druckdifferenz während der Analyse und Sortierung der engen Auflösung der Side Population zu gewährleisten. </li><li> Die SP wird als Seitenarm abseits der großen Population von Lungenzellen. Diese Bevölkerung wird als Hoechst gering. </li><li> Die Hoechst low / SP wird analysiert, um die CD45 positiven und negativen Populationen mit Hilfe eines Histogramms 2,3 (F separatenBBILDUNG 1). </li><li> Nach Auswahl und Verknüpfung der Hoechst niedrigen CD45 neg Lunge MSC Bevölkerung können die Zellen durch die Sortierung entweder als eine gemischte Bevölkerung in einem Rohr oder einzelne Zellen, um Klone in eine 96-Well-Platte 3 zu isolieren gesammelt werden. </li><li> Für Teller Sortierung der Art stream Ablenkung ist auf 25% eingestellt, um eine vertikale Art stream als die in der Regel für Rohr Sortierung verwendet erstellen. </li><li> Richten Sie die Art stream, indem ein Test-Stream-Puls auf die obere linke und dann die rechte untere Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> Setzen Sie den Sorter Software Platte Karte, um die gewünschte Anzahl von Zellen in jedes Well hinterlegen. </li><li> Zur Isolierung einzelner Zellklone eine einzige Lunge MSC wird in die Vertiefung einer 96-Well-Platte in 150 &amp;mgr; l von Kulturmedien (α-MEM mit 20% FBS) sortiert. Nach der Art einer zusätzlichen 100 &amp;mgr; des Mediums zugegeben. </li></ol> 5. Isolation, Kultur und Charakterisierung von Lungen-MSC und Clones <ol><li> Culture und den Ausbau von gemischten Lunge MSC Bevölkerung und einzelne Zellklone folgende Sortierung ist identisch mit Standard-Kulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 und&gt; 95% Luftfeuchtigkeit). Die Zellen sind erlaubt, nach der Isolierung für 16 Stunden einzuhalten. Media ist alle 48 Stunden ersetzt (α-MEM mit 20% FBS). Wenn die Zellen beginnen sich schneller zu vermehren und zu erreichen zwischen 75-80% Konfluenz passagiert werden (Abbildung 2). </li><li> Die Zellen werden mit vorgewärmtem HBSS gespült und mit 0,5% Trypsin / EDTA (CellGro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) bei 37 ° C für weniger als 2 min. Cells werden anhand einer invertierten Rahmen, um das Erscheinungsbild einer Zellsuspension zu bestätigen. </li><li> Lung MSC werden dann in Verhältnissen von 1:2 oder 1:3 je nach der aktuellen Proliferationsrate der Kultur unterteilt. </li><li> Die Fähigkeit der Lunge MSC in traditionellen mesenchymale Linien der Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten und ihrer Zelloberfläche Ausdruck akzeptiert mesenchymalen Markern differenzieren is für jede Zelle Vorbereitung ausgewertet. Zytogenetische Bandenanalyse wird auch durchgeführt, um das Fehlen grober Chromosomenanomalien 2,3,8-11 bestätigen. </li></ol> 6. Enumeration der Lunge MSC mit einem Colony Forming Assay (CFU-F) <ol><li> Verdünnen Zellen in komplette MesenCult Medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) bis zu einer Endkonzentration von 1x10 6 Zellen / ml. </li><li> Führen Verdünnungsreihen auf Endkonzentrationen in einem 100mm Teller 6x10 4 Zellen, 3x10 4 Zellen, 1,5 x10 4 Zellen und 0,75 x10 4 Zellen in 10 ml Medium zu erreichen. Die Analysen werden in doppelte oder dreifache für jede Zelle Konzentration durchgeführt und kann bei kleineren Flächen skaliert werden. </li><li> Kultur-Zellen für 10 Tage unter Standardbedingungen. Am Tag 10 Zellen werden mit PBS gespült und fixiert mit 100% Methanol für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Ermitteln Sie die CFU-F Kolonien durch Färbung mit 0,4% w / v Giemsa-Färbelösung(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) 1:20 verdünnt mit destilliertem Wasser. Werden die Proben an der Luft trocknen und zu quantifizieren, die Anzahl der Kolonien mit mehr als 25 Zellen pro Kolonie (Abbildung 3). </li></ol> 7. Die Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften von Lungen-MSC auf T-Zell-Proliferation und Apoptose <ol><li> 6.25x10 4 Lunge MSC-Zellen pro Well in 96-well-Platten ausplattiert und über Nacht 2 stehen. </li><li> CD4 +-Zellen aus der Milz von T-Zell-Rezeptor (TCR) transgenen Mäusen, OT-II mit T-Zellen, die Ovalbumin 323-339 Peptid erkennt, werden durch abbauende CD8 +, CD19 +, MHC-II + und CD25 +-Zellen mit gereinigtem ein Miltenyi AutoMACS Zellsortierer (Miltenyi, Auburn, CA). Antigen-präsentierenden Zellen (APC) werden durch positiv Sortierung MHC-II + Zellen 12 isoliert. </li><li> APC sind in 4% Paraformaldehyd fixiert, gewaschen 3 mal in PBS / 5% BSA/2mM EDTA, und beladen mit 0.5μg/ml oder 5μg / ml OVA323 Peptid. </li><li> Simulierte, Wachstum verhaftet APC sind in die Lunge MSC in 96-Well-Platten gegeben. </li><li> Mehr als 95% reinen CD4 + 1x10 5 Zellen werden mit 5 &amp;mgr; M Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE, Sigma, St.Louis MO) bezeichnet in PBS und inkubiert für 5 min im Dunkeln, mit PBS gewaschen-5% BSA, und dann zu den zusätzlichen APC und Lunge MSC-Zellen in DMEM 5% FBS Medien. Die Zellen werden dann für 96 Stunden inkubiert. </li><li> CD4 (APC-Cy7);; CD8 (ViolBlue); T-Zellen werden dann mit anti anti-CD40 (Cy5) angefärbt Vbeta 5 (PE) und untersucht mit Hilfe eines Miltenyi MacsQuant 7-Kanal-Durchflußzytometer (Miltenyi, Aurburn, CA) und Flojo Analyse-Software (Treestar, Ashland, OR). Proliferation als die Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität von CFSE im Vergleich zum Hintergrund gemessen, T-Zellen mit CFSE markiert und nicht zu APC ausgesetzt (Abb. 4). T-Zellen sind in dieser Zeit und die Lebensfähigkeit mit Trypanblau-Ausschluss beurteilt gezählt. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1. Durchflusszytometrische Analyse und Definition von Lung MSC. Einzel-Zell-Suspensionen von Lungengewebe zu verdauen sind mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um Unterschiede in A zu erkennen. forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC) und B. Hoechst blaue und rote Fluoreszenz. Die Anwesenheit eines Side Population (SP) ist sichtbar in das Tor. Die Hoechst niedrige SP wird dann analysiert, um die C trennen. CD45 negativen Bevölkerung von Lungen-MSC. Die CD45-positiven zu negativen Kennzahlen der Lungenfunktion SP sind in der Regel 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Isolierung und Kultivierung von Lung MSC. Nach dem Sammeln der Lunge MSC durch Zellsortierung werden die Zellen in 30mm Gerichte mit α-MEM Nachtr. vernickelttierte mit 20% FBS. A. Frisch sortierten Zellen erscheinen klein, rund und leuchtend. B. Nach etwa 2-3 Wochen Kolonien mit einem mesenchymalen Phänotyp deutlich geworden und Proliferation ist offensichtlich. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Auszählung von MSC durch Colony Forming-Fibroblast-Assay. Expanded Lunge MSC sind gemäß dem beschriebenen Protokoll für die CFU-F-Assay vernickelt. A. Nach 10 Tagen und Giemsa-Färbung Kolonien sind evident. B. Kolonien sind groß und aus einem Einige hundert Zellen. C. Die Zellen zeigen eine mesenchymalen Phänotyp. A &amp; B, Maßstab = 0,5 cm; C Skala bar = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. CFSE Based T-Zell-Proliferation Assay. In Abwesenheit von Lungen-MSC und Gegenwart antigen-präsentierenden Zellen (APC) + / - Ovalbumin (OVA) CD40 positive Effektor-T-Zellen zeigen eine Abnahme der CFSE-Intensität, welche die Proliferation zeigt (roter Kreis). CFSE Fluoreszenz-Intensität des T-Zell-Membran verringert stöchiometrisch mit jeder Zellteilung, dh. mit jeder Sparte. In Anwesenheit von Lungen-MSC, APC + / - OVA zeigen CD40 positive Effektor-T-Zellen keine signifikante Veränderung in CFSE Intensität, die einen Mangel an Verbreitung zeigt (roter Kreis).

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	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Jun, D. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine Methode zunächst zur BM hämatopoetischen Zellen zu identifizieren, um eine spezifische Population von Resident Lunge MSC isolieren angepasst. Aufgrund der Reproduzierbarkeit der Isolierung dieser Zellen wurden dann auch MSC aus. Ihre Herkunft hat als Resident in der adulten Maus Lunge (im Gegensatz zu BM abgeleitet Gegensatz) und einer phänotypischen und molekularen Profil dokumentierten 2 definiert. Die Fähigkeit, immer wieder zu isolieren diese charakterisiert Bevölkerung ermöglicht die weitere Erforschung der biologischen Bedeutung und Rolle der Lunge MSC während Gewebshomöostase und Krankheit. Die jüngste Definition dieser Population in vivo in beiden murinen und humanen Lungengewebe ermöglicht die Entwicklung einer therapeutischen Strategie bei der Rettung von körpereigenen Zellen der Lunge Reparatur während Verletzungen und Krankheiten zu erleichtern gerichtet.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Salzlösung (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington Collagenase Typ 2 </td><td> Worthington Biochemicals </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Rote Blutzellen Lysepuffer </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33342 Farbstoff </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% Trypsin / EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25 bis 053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Komplette MesenCult Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v Giemsa-Färbelösung </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4% Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Dienstleistungen </td><td> 15710 </td><td> 16% paraformeldehyde ist auf 4% mit PBS verdünnt </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolation &#38; characterization of hoechstlow cd45negative mouse lung mesenchymal stem cells

Tissue Wohnsitz mesenchymalen Stammzellen (MSC) sind wichtige Regulatoren der Reparatur von Gewebe oder Regeneration, Fibrose, Entzündung, Angiogenese und Tumorbildung. Zusammen stellen diese Studien deuten darauf hin, dass Resident Lunge MSC eine Rolle spielen bei der Lungengewebe Homöostase, Verletzung und Reparatur während Erkrankungen wie Lungenfibrose (PF) und arterielle Hypertonie (PAH) übernommen. Hier beschreiben wir eine Technologie, um eine Bevölkerung von Resident Lunge MSC definieren. Die Definition dieser Population in vivo Lungengewebe mit einer der Marker zu definieren erleichtert die wiederholte Isolierung eines gut charakterisierten Stammzellen Bevölkerung mittels Durchflusszytometrie und das Studium einer bestimmten Zelltyp und Funktion.

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Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In diesem Artikel zeigen wir die Isolierung von murinen Wohnsitz Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge), deren Expansion, Charakterisierung und Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

20.3K Aufrufe.  University of Colorado Denver. In diesem Artikel zeigen wir die Isolierung von murinen Wohnsitz Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge), deren Expansion, Charakterisierung und Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften.

Serie: Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Forschung

Biologie

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Isolierung, Charakterisierung und hohem Durchsatz extrazelluläre Flux-Analyse der Maus primäre renale tubuläre Epithelzellen

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...