Das Protokoll demonstriert eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung und Kultivierung hochreiner Endothelzellen aus Mäusen, die mehrere Anwendungen haben könnten. Diese Technik ist eine einfachere Methode, die die Ausbeute und Reinheit der Endothelzellen bewahrt. Das Verfahren wird von Nina Nguyen, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin meines Labors, demonstriert.
Wirbeln Sie zunächst einige Sekunden lang die magnetischen Kügelchen. Pipettieren Sie 50 Mikroliter der Kügelchen in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für CD31 und CD102. Fügen Sie einen Milliliter Perlenwaschpuffer hinzu und mischen Sie gut.
Legen Sie die Röhrchen auf einen Magnetabscheider und entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Glas. Resuspendieren Sie die Perlen in 50 Mikrolitern Perlenwaschpuffer. Fügen Sie dann fünf Mikroliter oder 2,5 Mikrogramm CD31- oder CD102-Antikörper pro 50 Mikroliter Kügelchen hinzu.
Inkubieren Sie die Perlensuspension mit sanfter Rotation auf einem End-über-End-Rotator über Nacht bei vier Grad Celsius oder drei Stunden lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Immunobeads viermal und resuspendieren Sie die Immunobeads dann in 50 Mikrolitern Bead-Wash-Puffer. Geben Sie am Tag der Isolierung 25 Milliliter HBSS zu 25 Milligramm Kollagenase Typ 1 hinzu und inkubieren Sie es mit sanfter Rotation.
Anschließend mit einem 22-Mikrometer-Filter filtrieren. Nachdem Sie einen fünf bis sieben Tage alten Mäusewelpen eingeschläfert haben, besprühen Sie den Kadaver mit 70%igem Ethanol. Als nächstes schneiden Sie das Zwerchfell entlang der gesamten Seitenwände des Brustkorbs nach oben, um die Brusthöhle freizulegen.
Injizieren Sie fünf Milliliter kaltes DMEM in die rechte Herzkammer, bis die Lunge weiß wird. Schneiden Sie dann die Lappen distal zu den entsprechenden Bronchien nacheinander durch, um die Lunge zu entfernen. Ziehen Sie die Lungenlappen in ein 50 Milliliter konisches Röhrchen, das mit 20 Millilitern eiskaltem Basalmedium vorgefüllt ist.
Bewegen Sie das Röhrchen 10 bis 15 Sekunden lang vorsichtig von Hand, um überschüssige rote Blutkörperchen zu entfernen. Entfernen Sie die Lunge mit einem Zellsieb aus dem Medium und zerkleinern Sie sie mit einer sterilisierten Schere. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in das 50 Milliliter konische Röhrchen mit 25 Millilitern vorgewärmter Kollagenaselösung.
Sanftes Rühren auf einem rotierenden Mischer. Befestigen Sie eine 20-Milliliter-Spritze an einer stumpfen 15-Gauge-Kanüle und verreiben Sie die Suspension kräftig, ohne 10 bis 15 Mal in eine zelluläre Suspension aufzuschäumen. Filtern Sie die Suspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Spülen Sie dann das für den Aufschluss verwendete konische Röhrchen und das Zellsieb mit 15 Millilitern Basalmedium aus. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 x G für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern des vollständigen Mediums.
Fügen Sie acht Milliliter des vollständigen Mediums hinzu und inkubieren Sie es. Waschen Sie am nächsten Tag die Kolben zweimal mit 10 Millilitern HBSS ohne Calcium und Magnesium und fügen Sie 10 Milliliter komplettes Medium hinzu. Sobald die Zellen zu 90 bis 95 % konfluent sind, sind sie bereit für die Isolierung der primären Immunbeads.
Adhärente Endothelzellen zweimal mit 10 Millilitern HBSS ohne Calcium und Magnesium waschen. Fügen Sie zwei Milliliter trypsinfreie Zellablöselösung hinzu und inkubieren Sie sie, um sicherzustellen, dass alle Zellen aus dem Kolben gehoben werden. Fügen Sie acht Milliliter Basalmedium hinzu.
Als nächstes werden die Zellen bei 400 x G für vier Minuten bei Raumtemperatur heruntergedreht und in zwei Millilitern des Basalmediums resuspendiert. Vortex-Anti-CD31-beschichtete Perlen für einige Sekunden, um die Perlen wieder zu suspendieren. Fügen Sie 30 Mikroliter Kügelchen pro zwei Milliliter Zellsuspension hinzu und verschließen Sie den Deckel.
Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem End-über-End-Rotator. Legen Sie dann die Röhrchen für zwei Minuten auf einen Magnetabscheider. Saugen Sie den Überstand ab und entfernen Sie den Schlauch vom Magneten.
Resuspendieren Sie das Bead-Zellpellet, indem Sie drei Milliliter Basalmedium in das Röhrchen geben und mehrmals auf und ab pipettieren. Setzen Sie den Schlauch für zwei Minuten wieder auf den Magnetabscheider. Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Glas ab.
Nach der letzten Wäsche, wenn der Überstand klar wird, resuspendieren Sie das Bead-Zellpellet in drei Millilitern vollständigem Wachstumsmedium und füllen Sie es in einen T75-Kolben um. Fügen Sie sieben Milliliter des vollständigen Nährmediums hinzu und inkubieren Sie es. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag erneut mit HBSS ohne Kalzium und Magnesium.
Fügen Sie dann 10 Milliliter komplettes Medium hinzu. Sobald die Zellen zu 90 bis 95 % konfluent sind, sind sie bereit für die sekundäre Isolierung von Immunbeads. Die erste Immunobead-Selektion identifiziert die CD31-positiven Zellen, die in einer Kopfsteinpflasterformation wachsen.
Eine zweite Immunbead-Selektion mit anti-CD102-beschichteten Beads erhöht die Reinheit der Endothelzellen und die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung wird verwendet, um zu bestätigen, dass die Zellpopulation CD31-positiv und CD102-positiv ist. Um die endothelialen Entzündungswege und die endotheliale Barrierefunktion zu untersuchen, wurde eine Behandlung mit murinem Cytomix eingesetzt, um eine signifikante IL-6-Produktion durch Endothelzellen mit einem P-Wert von weniger als 0,01 zu induzieren. Darüber hinaus nahm der transendotheliale Widerstand ab, was auf eine erhöhte endotheliale Permeabilität hindeutet.
Isolierte Endothelzellen können in Endothelzellstimulationen oder Barrierefunktionsassays verwendet werden, um endothelbasierte therapeutische Ziele für endotheliale Dysfunktionsstörungen zu entdecken.
