Name: isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
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JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Alle Verfahren wurden von der Animal Care Committee der University of Ottawa (Tierethik Protokoll Ohri-1696) zugelassen. Tierbetreuung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt. 1. Isolierung von Lung mesenchymalen Stromazellen <ol><li> Bereiten Sie die Enzymmischung in einer 50 ml Tube: wiegen 30 U neutrale Protease, 2.500 U Kollagenase I und 500 U DNAse I. ausreichen Diese Beträge für die Lunge eines erwachsenen Maus oder Ratte Welpen. Bereiten Sie am Tag der Isolierung und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Opfer Rattenjungen am Tag 13 durch eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (0,2 ml, 65 mg / ml). Verwenden Sie die Zehe Prise Reflex Bewusstlosigkeit zu etablieren. Tod des Tieres wird durch Öffnen des Brustgewährleistet, wie weiter unten beschrieben. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut durch das Tier mit 70% Ethanol Spritzen und vorsichtig öffnen den Brustkorb chirurgische Schere, bei der Membran ausgehend und in Richtung der rostralen Seitenschneider, sehr aufpassen, nichtdie Lunge zu beschädigen. Verbreiten Sie den Brustkorb geöffnet blutstillende Schellen, oder alternativ den Brustkorb aufgeschnitten Zugriff auf den Brustkorb zu schaffen. </li><li> Exsanguinate das Tier durch das Herz zu entfernen. Um das Herz zu entfernen, fassen Sie die Thymusdrüse und Herzen mit kleinen Pinzette und schneiden Sie diese mit chirurgische Schere entfernt. Unmittelbar danach nehmen das Blut mit einer Gaze, bis kein Blut mehr aus der abgetrennten Aorta und Lungenarterie kommt. </li><li> Entfernen Sie die Lungen aus dem Thorax wie folgt: Halten Sie die Luftröhre mit kleinen Zange, dann trennen die Luftröhre mit chirurgischer Schere auf dem rostralen Seite. Während sanft die Lunge Paket aus dem Brustkorb ziehen, geschnitten entlang der Brustkorb in die Lunge frei, jede Bindegewebe auf der Rückenseite entfernt. </li><li> Sever die Lungen von der Aorta und der Speiseröhre, mit chirurgische Scheren entlang der Membran zu schneiden. Nun, da die Lungen aus dem Thorax völlig frei nehmen Sie verbleibendes Blut vorsichtig mit einem Gaze. </li><li> Entfernen Sie die Luftröhre und Bronchien mit surgische Schere und sorgfältig die Lungenlappen zu einer 50-ml-Röhrchen übertragen haltige Kalt 35 ml 30% Citrat-Phosphat-Dextrose-Adenin (CPDA-1) Antikoagulans (26,30 g Trinatriumcitratdihydrat, 3,27 g Ascorbinsäure Monohydrat, 2,22 g Natriumhydrogenphosphat, 31,80 g D-Glucose, 0,275 g Adenin in 1 L gereinigtem H 2 O; Sterilfilter die Lösung ein 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Blut und Trümmer zu entfernen verwenden. </li><li> Nach 5 min Spülen in 30% CPDA-1 / PBS, übertragen die Lunge auf eine neue 50-ml-Röhrchen 35 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (RT) enthält, vorsichtig umdrehen Citrat zu entfernen. Transfer in ein Rohr 35 ml Dulbeccos PBS + Natrium-Pyruvat + Glucose (DPBS ++) (RT) enthält. Jeder Waschschritt sollte ungefähr 5 Minuten dauern. Hinweis: DPBS ++ Handel bestellt werden kann oder sich wie folgt zusammen 21: Calciumchloriddihydrat 132,4 mg, Magnesiumchlorid-Hexahydrat 100 mg, Kaliumchlorid (wasserfrei) 200 mg, monobasisches Kaliumphosphat (wasserfrei) 200 mg, Natriumchlorid (wasserfrei) 8,000 mg, dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) betragen mit 1.144,5 mg, D-Glucose 1000 mg, Natriumpyruvat 36 mg in 1 L gereinigtem H 2 O, pH 7,3. Sterilfilter die Lösung einen 0,22 um Membranfilter vor dem Gebrauch verwenden. </li><li> Man löst das Enzymgemisch durch Zugabe von 10 ml DPBS ++ (vorgewärmt auf 37 ° C) und dem invertierenden sanft bis gelöst. </li><li> Übertragen Sie die Lunge zu einem neuen 50-ml-Tube und hacken die Lunge an der Wand der Röhre mit einem Skalpell, bis fein gehackt. In der Enzymmischung auf das Gewebe (10 ml Enzymmischung / pro Erwachsener Maus / Rattenjungen Lunge), schließen Sie das Rohr fest und Inkubation bei 38 ° C unter leichtem Schütteln (entweder in einem Thermomischer, einem Schüttelwasserbad, oder ein Wasser Bad mit regelmäßiger manueller Bewegung). Die Dauer hängt von der Art des Gewebes: fetalen Gewebes 60 min, juvenile / erwachsenem Gewebe 90-120 min, fibrotische erwachsenem Gewebe 120-150 min. </li><li> Stoppen Sie die Verdauung von Chela die zweiwertigen Kationen with 200 &amp; mgr; l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Sterilfilter die Lösung ein 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung verwendet wird). </li><li> 20 ml 5% fötalem Rinderserum (FBS) / PBS und die gesamte Suspension durch 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb in eine neue 50-ml-Röhrchen übergeben. Spülen Sie das Rohr und Zellsieb mit 10 ml 5% FBS / PBS, um das Gesamtvolumen auf 40 ml zu bringen. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 min bei 500 · g, RT. </li><li> Entfernen Sie den Überstand (Pellet sollte gut sichtbar sein), Resuspension in 40 ml 5% FBS / PBS und wiederholen Zentrifugation Schritt 1.13. </li><li> Resuspendieren in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) und 14 vorsichtig auf 3 ml Dichtegradientenmedien (1,073 g / cm 3) in einem 15 ml Rohrschicht. Um eine gute Interphase erhalten, ist es entscheidend, dass die Schichtung der Einzelzellsuspension bei einer auftritt&gt; 45 ° Winkel mit sehr geringer Geschwindigkeit. </li><li> Zentrifuge 20 min bei 900 · g, Medium (5/10) Beschleunigung, keine Verzögerung, 19 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Zellen, die in der interphase und resuspendieren sie in 10 ml sterilem PBS. </li><li> Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 × g, 21 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 10 ml vorgewärmten abgeschlossen L-MSC-Kulturmedium (Minimum Essential Medium Eagle alpha-Modifikation (&amp; agr; MEM), ergänzt mit 2 mmol L-Glutamin pro 500 ml &amp; agr; MEM, 20% vol / vol FBS und 1% vol / vol Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B. </li><li> Wiederholen Zentrifugationsschritt 1,18. Anschließend entfernen Überstand und resuspendieren in 10 ml vorgewärmten frisches Kulturmedium. </li><li> Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer oder automatische Zellzähler und Platte mit einer hohen Dichte, da die Mehrzahl der Zellen in diesem Stadium sind nicht aus Kunststoff anhaftenden. Die genaue Beschichtungsdichte hängt von der Tierart und Alter, zB werden die Zellen eines erwachsenen Mauslunge bei 10 5 Zellen / cm 2, wohingegen Zellen, die aus einer Lungenrattenjungen ausreichend dicht sind bei einer Aussaatdichte von 1-2 x 10 4 Zellen / cm 2 </sup&gt;. Verwenden Sie 0,2 ml L-MSC Kulturmedium / cm 2. </li><li> Kultur L-MSCs in einer befeuchteten 5% O 2, 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C. </li><li> Ändern Medium 24 Stunden nach der ersten Aussaat und danach alle 3 Tage, nachdem er einmal mit PBS spülen. Zellen werden, bis 80-90% Konfluenz kultiviert werden, die in Abhängigkeit von dem Tier Ursprungs 3-5 Tage im Durchschnitt dauert. Höhere Zusammenfluss wird die Differenzierung in Fibroblasten fördern. </li></ol> 2. Auswahl der CD146 + Lung mesenchymalen Stromazellen <ol><li> Beschichtung von Magnetic Beads mit sekundärem Antikörper <ol><li> Beschichten der magnetischen Kügelchen mit biotinyliertem sekundärem Antikörper, bei einem Verhältnis von 10 ug sekundären Antikörper / 100 ul magnetischen Perlen in einem Rundboden sterile 2 ml Kryoröhrchen in sterilen Bedingungen. Verwenden Sie 10 ul sekundären Antikörper pro erwartet 0,5 x 10 6 Zellen, und mit einem Minimum von 100 ul magnetische Perlen und 10 ug Antikörper. Hinweis: das Verhältnis einestibodies pro Volumen der Kugeln verwendet wird, kann von Hersteller zu Hersteller unterscheiden, sollten Sie die Anweisungen des Herstellers für die Perlen der Wahl beraten. Aus diesem Protokoll finden Sie in Tabelle 1 für die Perlen und Antikörper, die bei der Optimierung von diesem Protokoll verwendet wurden. </li><li> Inkubieren in einem rotierenden Probenmischer für 30 Minuten bei 30 Umdrehungen / min (rpm), bei RT. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 1,5 ml steriler 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS und Transfer zu einem 3 ml Rundbodenrohr (Durchflusszytometrie Rohr). Spülen Sie die Kryoröhrchen mit einer zusätzlichen 1,5 ml 0,1% BSA / PBS und Transfer zum 3-ml-Tube. </li><li> Das Röhrchen wird auf einem geeigneten Magnet und warten 2 Minuten, bis alle Perlen an der Rückwand der Röhre befestigt sind, und die Lösung bleibt klar. Entfernen Abfluss und wiederholen Waschen mit 3 ml 0,1% BSA / PBS zweimal. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 3 ml 0,1% BSA / PBS und lagern bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Verwenden Sie innerhalb von 5 Tagen. </li></ol></li><li> Kennzeichnung CD146 + L-MSCs<ol><li> Ernten Sie die mesenchymalen Zellen nach Spülen mit PBS eine sanfte nicht-Trypsin-Lösung. Anmerkung: Volumes hängen von der Größe der Kulturflasche (0,2 ml / cm 2 Medium oder PBS). <ol><li> Kulturmedium entfernen und spülen Zellen dreimal mit sterilem PBS. </li><li> Fügen Sie den entsprechenden Volumen von sanften Nicht-Trypsin-Lösung (siehe Tabelle 1). Im Brutschrank bei 37 ° C inkubieren, bis die Zellen abgelöst, etwa 10 min, wenn die Lösung in Tabelle 1 verwendet wird. </li><li> Inaktivierung des Enzyms durch L-MSC Kulturmedium zugibt und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g. </li></ol></li><li> Überstand entfernen, resuspendieren Zellen in 0,1% BSA / PBS und die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatische Zellzähler zählen. Hinweis: Das Volumen der 0,1% BSA / PBS auf die Größe der Kulturflasche abhängt: Ziel für 5 oder 10 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.2.2 und resuspendieren engagierten Menge an Zellen in 3 ml 0,1% BSA / PBS (Blöcke unspezifischen Bindungsstellen und hält die Zellen am Leben). Halten Zellen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie eine 3 ml-Rundbodenröhrchen mit dem primären anti-CD146-Antikörper, und halten Sie auf dem Eis. Anmerkung: Die Konzentration an primären Antikörper, der an die spezielle Menge an Zellen hinzugefügt wird, hängt auf dem Antikörper, der verwendet wird. Für einen empfohlenen Anti-Ratten CD146-Antikörper siehe Tabelle 1. </li><li> Hinzufügen des Gesamtvolumens der Zellen aus Schritt 2.2.3 auf das Rohr mit dem primären Antikörper. Dicht schließen und 4 ° C bei 15 rpm, 30 min auf einer rotierenden Probe Mischer inkubiert. </li><li> Zentrifuge Zellen 5 min bei 500 × g, 4 ° C, Überstand und resuspendieren Zellpellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS entfernen. Wiederholen Zentrifugenschritt. </li><li> Resuspendieren der Zellen in der Lösung 3 ml sekundärem Antikörper beschichteten Kügelchen enthält, die 2,1 nach den Anweisungen in Abschnitt wurde hergestellt und inkubiert 30 min auf einer rotierenden Probe Mischer bei 15 Upm, 4 ° C. </li></ol></li><li> Auswählen von CD146 + L-MSCs<ol><li> Das Röhrchen wird das markierte CD146 + L-MSCs auf den Magnet enthält. Die positiven Zellen werden an der Rückseite des Rohres gezogen werden. Ohne das Rohr zu bewegen oder um die Perlen zu berühren, ernten den Überstand mit den negativen Zellen langsam mit einer sterilen Pasteurpipette (diese entweder auf der Grundlage der experimentellen Design gesammelt oder verworfen werden kann). </li><li> Entfernen des Rohres aus dem Magneten und Resuspendieren der Zellen in 3 ml 10% BSA / PBS. Wiederholen Sie den Auswahlverfahrens beschrieben in Schritt 2.3.1. vier weitere Male (Σ 5 Stufen des Auswahlverfahrens). </li><li> Resuspendieren CD146 + L-MSCs in vorgewärmte L-MSC Kulturmedium und zurück zum Magneten. </li><li> Überstand entfernen, resuspendieren in L-MSC Kulturmedium und die Platte in einem passenden Kulturflasche (0,2 ml / cm 2). Als Faustregel gilt, aus denen Zellen Platte in derselben Größe Kulturflasche wurden die Zellen vor der Wulst-Auswahl aufgehoben. Die Zahl der CD146 + L-MSCs und damit die Beschichtungs-Dichte, wirdabhängig vom Alter, Art und Stamm des Quell Tier. Immer streben eine Plattierungsdichte von ~ 5.000 Zellen / cm 2. Hinweis: Die Perlen werden nicht das Zellwachstum stören und wird nach und nach verschwinden, wenn die Zellen vermehren. </li></ol></li></ol> 3. Gefrierzellen <ol><li> Verwenden Sie das folgende Gefriermittel: 60% Pentastärke-Lösung (10% Pentastärke in 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) 22. Hinweis: Wenn nicht alle Zutaten vorhanden sind, ist eine Lösung, die 5% DMSO, 30% FBS und 65% &amp; agr; MEM ist eine gute Alternative. </li><li> Die Zellen in 0,5 x 10 6 Zellen / ml aliquoten in Kryoröhrchen von jeweils 1 ml und O / N bei -80 ° C unter Verwendung eines Gefrierbehälters einfrieren. </li><li> Transfer zu einem Flüssigstickstofflagertank am nächsten Tag. </li></ol> 4. Auftauen Cells <ol><li> Auftauen eine Ampulle von Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. </li><li> Die Zellen in 10 mlvorgewärmtes Kulturmedium und Zentrifuge für 5 min bei 500 × g, 21 ° C. </li><li> Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml Kulturmedium. Samenzellen in einem belüfteten Kappe Zellkultur behandelt Kolben bei 5.000 Zellen / cm 2 in 0,2 ml / cm2 Medien (zB 15 ml für einen 75 cm 2 Kolben). </li><li> Kulturzellen in 5% O 2, 5% CO 2, bis 80-90% konfluent zum Ernten und / oder experimentelle Verwendung. Über Konfluenz wird die Differenzierung induzieren. Wenn bei 5.000 Zellen Aussaat / cm 2, L-MSCs werden 80-90% Konfluenz innerhalb von 3-4 Tagen Kultur erreichen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Isolierung und Kultur von Primär L-MSCs stellt eine Chance zu einer besseren ihre Funktion und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellpopulationen auf zellulärer Ebene zu verstehen und ihre Rolle in der Lungenentwicklung, Gesundheit und Krankheit. Dies ist besonders wichtig, da der Mangel an einem bestimmten einzigen Markierung dieser Zellen macht es nahezu unmöglich, diese Zellen in situ zu untersuchen. Wie bei allen primären Zellpopulationen, sollte man im Hinterkopf behalten, dass diese Zellen eher auf ...

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Während der Entwicklung, unter anderem in der Lunge ist das Mesenchym eine wichtige Quelle für Entwicklungsanzeichen und Bewohner MSCs sind ein aussichtsreicher Kandidat in der Mitte davon zu sein. Darüber hinaus wird immer mehr Anzeichen dafür, dass die Bewohner MSCs bei erwachsenen Krankheiten gestört werden, einschließlich Krebs 1,2 und Fibrose 3. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen 4. Stammzell-Antigen-1 (Sca-1) wurde in Mäusen als Marker für eine Vielzahl von Gewebestammzellen identifiziert und können für die Isolierung von L-MSCs 5 verwendet werden, hat aber leider6 Orthologe in anderen Spezies nicht bekannt. Forscher haben eine Vielzahl von verschiedenen Isolationsverfahren für die Isolierung von L-MSCs entweder von Lungengewebe oder Flüssigkeit berichtet. Diese reichen von Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) basierte Verfahren für CD31 Auswahl - / CD45 - / CD90 + Zellen 7, CD31 - / CD45 - / epithelialen Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) - / Sca-1 + Zellen 8, Multidrug-Resistenz-Transporter ATP-Bindungskassette G (ABCG2) positive Zellen 9 oder Hoechst 33342 Farbstoff Auslauf 10, Kunststoffadhärenz 11,12 und Migration von zerkleinerten Gewebes 13. Die Vorteile der hier vorgestellten Verfahren sind mehrfach. Durch die Verwendung von 14 eine sanfte enzymatische Verdauung und Dichtegradienten erhält man alle Zellen des Dichtebereichs, die MSCs gehören, epithelialen oder endothelialen Zellen auszuschließen. Die anschließende Kunststoffadhärenz Schritt stellt sicher, dass nur die mesenchymal Zellen anhaften und in der Kultur bleiben, Leukozyten zu beseitigen. Vor allem aber erlaubt die CD146 + Selektionsschritt zur Beseitigung von Fibroblasten, da diese Zellen nicht CD146 exprimieren. Die Expression des Zelladhäsionsmolekül CD146 positiv mit Multipotenz korreliert, und ist daher eine gute Markierung Fibroblasten aus einer mesenchymalen Zellpopulation 15-19 auszusondern. Dies ist ein Vorteil gegenüber CD90 als Selektionsmarker verwendet, da sie nicht nur in MSCs exprimiert wird, sondern auch in lipofibroblasts 5,20. In diesem Protokoll haben wir ausdrücklich ein magnetisches bead Auswahl gewählt, da es auf die Zellen sanfter ist, und die gesamte Prozedur kann unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Isolierungsverfahren wie zum Auswachsen Verfahren gegenüber, ist, dass es relativ schnell ist, als 6-10 Tage bis zu einem Monat oder mehr für den Auswuchs Verfahren gegenüber. Drei bis fünf Tage nach der ersten Isolierung der mesenchymalen Bevölkerung ist bereit für CD146 + Sele<html> ction; Nach weiteren drei bis fünf Tagen die CD146 + Zellen sind bereit für Experimente verwendet werden oder kann für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Die verringerte Zeit der Kultur verbessert die Qualität der Zellen als MSCs transdifferentiate Richtung Fibroblasten in Kultur verlängert ex vivo 19. Schließlich wegen der Art des Protokolls ist es möglich, dieses Verfahren auf andere Arten anzuwenden, indem einfach geeignete Antikörper oder sogar auf andere Organsysteme Auswahl durch die Wahl der Verdauungsenzyme und Inkubationszeit eingestellt wird. Ein detailliertes Protokoll dieser Isolierungsmethode ist unten angegeben, und eine schematische Übersicht über die Isolierung und anschließende Auswahl der CD146 + Subpopulation ist in 1A und 1B vorgesehen. Zusätzlich werden Details für die Passage enthalten, Einfrieren und diese Zellen aufgetaut. ad / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung von Lungen mesenchymalen Zellen (A) und die anschließende CD146 + Zellauswahl (B) min = Minuten. EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; 2. Ab = Sekundärantikörpers; a-CD146 Ab = primäre anti-CD146-Antikörper; &amp; ndash; ve Zellen = CD146-negativen Zellen; + ve Zellen = CD146-positiven Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Neutral Protease</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td><td>-</td><td>Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>14287-072</td><td>Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &gt;45&amp;deg; angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Magnetic beads</td></tr><tr><td>biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td></tr><tr><td>DynaMag5-magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&amp;rsquo;s instructions of the magnet beads of choice.</td></tr><tr><td>TrypLE express&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE</td></tr><tr><td>anti-rat CD146 antibody</td><td>Lifespan Biosciences Inc.</td><td>C35841</td><td>12.5 &amp;mu;l per 0.5 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells</td></tr><tr><td>Pentaspan (pentastarch solution)</td><td>Bristol-Myers Squibb Canada</td><td>-</td><td>Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty freezing container</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Darüber hinaus haben sie wahrscheinlich eine Rolle bei der normalen Organentwicklung und haben Rollen in Krankheit zugeschrieben worden, insbesondere solche mit einer fibrotischen Natur. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen. Die Isolierung hier beschriebene Technik gilt mehrere Merkmale von Lungen ansässig MSCs (L-MSCs). Nach Opfer der Ratten, sind Lunge entfernt und mehrmals gewaschen, um Blut zu entfernen. Folgende mechanische Dissoziation von Skalpell werden die Lungen für 2-3 Stunden mit einer Mischung aus Collagenase Typ I, neutrale Protease und DNase Typ I. Die obtaine verdautd Einzelzellsuspension wird anschließend gewaschen und überlagert über Dichtegradienten-Medium (Dichte 1,073 g / ml). Nach der Zentrifugation werden die Zellen aus der Zwischenphase gewaschen und in Kulturflaschen behandelt plattiert. Die Zellen werden für 4-7 Tage in physiologischer 5% O 2, 5% CO 2 Bedingungen. Zu verarmen Fibroblasten (CD146 -) und eine Bevölkerung von nur L-MSCs (CD146 +), die positive Selektion für CD146 + Zellen gewährleistet ist, durch magnetische Perle Auswahl durchgeführt. Zusammenfassend ergibt dieses Verfahren zuverlässig eine Bevölkerung von Primär L-MSCs für weitere in vitro-Studie und Manipulation. Aufgrund der Natur des Protokolls kann es leicht zu anderen experimentellen Tiermodellen übersetzt werden.

Zwei der zuverlässigsten physikalischen Eigenschaften von MSCs, Dichte und Kunststoffadhärenz werden im ersten Teil dieses Protokolls verwendet, um die mesenchymale Zellfraktion der Lunge zu erhalten, das L-MSCs enthält. Obwohl der Dichtegradient Interphase wird Monozyten und Makrophagen neben Lungen mesenchymalen Zellen, die Kunststoffadhärenz gefolgt von 3-5 Tagen Kultur gewährleistet sind, dass nur die Lunge mesenchymalen Zellen bleiben. Tatsächlich diese Zellpopulation drückt ...

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Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

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Serie: Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Biologie

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Isolierung von Immun- und Nicht-Immunzellen aus der Lunge von Mäusen für die Durchflusszytometrie

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

Nischenbasierte Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Kieferknochenmark der Ratte

Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are a type of stem cell with multi-directional differentiation potential. Compared with BMMSCs derived from appendicular bones, BMMSCs derived from the jaw have greater proliferative and osteogenic differentiation ability, gradually becoming important seed cells for jaw defect repair. However, the mandible has a complex bony structure and less cancellous content than appendicular bones. It is difficult to acquire a large number of high-quality jaw-derived marrow mesenchymal stem cells using traditional methods. This study presents a &#39;niche-based approach on stemness&#39; for isolating and culturing rat jaw bone marrow mesenchymal stem cells (JBMMSCs). Primary rat JBMMSCs were isolated and cultured using the whole bone marrow adherent method combined with the bone slice digestion method. The isolated cells were identified as JBMMSCs through cell morphology observation, detection of cell surface markers, and multi-directional differentiation induction. The cells extracted by this method exhibit a &#39;fibroblast-like&#39; spindle shape. The cells are long, spindle-shaped and fibroblast-like. The flow cytometry analysis shows these cells are positive for CD29, CD44, and CD90 but negative for CD11b/c, CD34, and CD45, which is congruent with BMMSCs characteristics. The cells show strong proliferation capacity and can undergo osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation. This study provides an effective and stable method for obtaining enough high-quality JBMMSCs with strong differentiation ability in a short time, which could facilitate further studies of the exploration of biological function, regenerative medicine, and related clinical applications.

Autor im Rampenlicht: Anwendung von hochreinen mesenchymalen Stammzellen aus dem Kieferknochenmark im Tissue Engineering

Mesenchymal stem cells from the jaw bone marrow have significant functions in diverse differentiation, self-renewal, and immune modulation. They have emerged as a crucial reservoir of precursor cells in gene therapy, tissue engineering, and regenerative medicine. Here, we present a unique method for isolating jaw bone marrow mesenchymal stem cells in rats.

Technik zur Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Kieferknochenmark von Ratten

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are a type of stem cell with multi-directional differentiation potential. Compared with BMMSCs derived from ...

Isolierung von CD146

Zusammenfassung

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Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs

Isolation und Charakterisierung von Hoechst^Low CD45^Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Technik zur Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Kieferknochenmark von Ratten