Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, das Protokoll für die Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von Herzstammzellen, CSCs aus dem Adult Mouse Heart, zu standardisieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Herz-Kreislauf-Erkrankungen und der regionalen Therapie wie Herzstammzelltherapie und Herzinsuffizienz zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie kostengünstig ist, mit hoher Hilfe in kurzer Zeit.
Starten Sie dieses Experiment, indem Sie alle notwendigen Materialien, Instrumente und Isolationspuffer in einem sterilisierten Zustand vorbereiten, wie im Protokoll beschrieben. Nachdem Sie die Haut aus dem Bauch einer eingeschläferten Maus entfernt haben, schneiden Sie den Brustkorb in der sterilen Kapuze, um die Brusthöhle zu öffnen. Setzen Sie das Herz aus und entfernen Sie dann das Blut in der Nähe des Herzens mit einer Ein-Milliliter-Spritze.
Um Blut in der Nähe des Herzens zu entfernen, waschen Sie die Umgebung mit eiskaltem PBS. Mit chirurgischen Scheren und Pinzetten, um das Herz zu sezieren, legen Sie es in eine 100 Millimeter Petrischale mit 10 Milliliter eiskalte PBS. Verwenden Sie gekrümmte Schaftzangen, um das Herz zu lähmen, und entfernen Sie das Restblut im Herzen.
Übertragen Sie vier bis fünf isolierte Herzen auf eine 100 Milliliter Petrischale mit 10 Millilitereise. Palpate die Herzen wieder, um sie zu waschen und entfernen Sie restliches Blut im Herzen. Um die vollständige Entfernung des Blutes zu gewährleisten, ändern Sie die HBSS-Lösung nach jeder Wäsche.
Halten Sie jedes Herz mit einer Zange und verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um jedes Herz in zwei bis vier Millimeter Stücke in einer 100-Millimeter-Petrischale zu schneiden, die fünf bis sieben Milliliter HBSS enthält. Ändern Sie häufig die Lösung, um eine vollständige Blutentnahme zu gewährleisten. Schließlich, hacken Sie die Herzen in der HBSS-Lösung.
Zentrifugieren Sie die gehackten Herzen in einem 50 Milliliter konischen Rohr bei 500 mal G, bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, und dann den Überstand entsorgen. Fügen Sie fünf bis sechs Milliliter, 0,2%Collagenase II Lösung auf das Pellet, um das Gewebe zu verdauen. Das Pellet gründlich wieder aufhängen, indem man die Röhre auf einem Shaker bei 75-fachem G, bei 37 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten schaukelt.
Alle 20 bis 30 Minuten das Rohr kräftig von Hand schütteln, um die Lyse zu verbessern. Trituieren Sie den lysierten Gewebemix mit fünf Millilitern serologischer Pipette und einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um den Gewebeklumpen in die einzellige Suspension zu dissoziieren. Um die enzymatische Lyse des Gewebes zu stoppen, fügen Sie zwei- bis dreimal so viel kommerziell erhältliches CSC-Wartungsmedium hinzu wie das Volumen des lysierten Gewebes.
Passieren Sie die verdaute Zellsuspension durch ein 100 Mikrometer Zellsieb, das auf einem 50 Milliliter konischen Rohr platziert wird, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen. Um die Zellen auf Dichtegradientzentrifugation zu trennen, fügen Sie 37 Grad Celsius, vorgewärmt, Polysucrose und Natriumdiatrizoat Lösung zu einem 50 Milliliter konischen Rohr. Dann sanft und langsam fügen Sie ein gleiches Volumen von Filtrat über die Lösung, vermeidung jede Mischung der beiden Lösungen.
Es ist wichtig, Filtrat über Polysucrose und Natriumdiatrizoat Lösung langsam ohne Mischen durch Kippen des Rohres bei 45 Grad und gegen die Wand des Rohres hinzuzufügen. Setzen Sie keine Polysucrose- und Natriumdiatrizoatlösung über Filtrat bei. Legen Sie das Rohr sehr langsam in eine Schwenk-Eimer-Zentrifuge, um sicherzustellen, dass die Lösungen nicht stören.
Zentrifuge bei 500 mal G für 20 Minuten bei Raumtemperatur bei einer niedrigeren Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeit eingestellt, um das Mischen der beiden Lösungen zu vermeiden, und für eine ordnungsgemäße Trennung der Herzstammzellen. Es ist wichtig, die Gradientenlösung sehr sorgfältig und ohne Störung in der Zentrifuge zu setzen. Setzen Sie die Beschleunigung und Verzögerung der Zentrifuge muss bei der niedrigsten Geschwindigkeit sein, wie ein oder null.
Verwenden Sie eine 1-Millimeter-Pipette, um die buffy Schicht mit den CSCs zusammen mit zusätzlicher Lösung von der oberen Schicht auf ein 15 Milliliter sterilisiertes Rohr zu übertragen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von CSC-Wartungsmedium hinzu, und mischen Sie es richtig, um die Rest-Polysucrose- und Natriumdiatrizoatlösung zu neutralisieren. Zentrifugieren Sie diese Suspension bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie das Waschen von CSCs mit unvollständiger DMEM-Lösung mindestens zwei Mal. Zentrifuge bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um jede Rest-Polysucrose- und Natriumdiatrizoatlösung loszuwerden.
Nach dem Entfernen des Überstandes setzen Sie das Pellet, das gereinigte CSCs enthält, in einem Milliliter CSC-Wartungsmedium wieder auf und zählen Sie dann die Zellen. Säen Sie die CSCs in einer Sechs-Brunnen-Kulturplatte, die mit einer 0,02%igen Gelatinelösung mit 0,5% Fibronectin beschichtet ist, und fügen Sie zwei Milliliter komplettes Pflegemedium hinzu. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5%CO2.
Wenn die CSC-Kultur die Koninfluenza erreicht, übertragen Sie die Zellen auf eine neue Gelatine- und Fibronectin-beschichtete Platte, wie im Textprotokoll beschrieben. Kultur diese übertragen P0 CSCs in komplette CSC Wartungsmedium bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-Inkubator bis zum Einfluss. Wiederholen Sie den Zelltransfer auf eine neue Platte, um P1-CSCs herzustellen, die für weitere Experimente verwendet werden können.
Um die CSC-Kultur in ihrer Anfangsphase beizubehalten, säen Sie die Zellen weiter aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die kultivierten Zellen zu charakterisieren, legen Sie die CSC-haltige Platte auf das Ziel eines Fluoreszenzmikroskops. Verwenden Sie die zehnfache Vergrößerung, um die Zellen zu fokussieren.
Um die Zellen zu beobachten, verwenden Sie phasenkontrastige Blende, und erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 20-fache, indem Sie die Objektivlinse ändern, und stellen Sie dann die CSCs ab. Nach der Durchführung der Immunfärbung, legen Sie die Kulturplatte unter das Fluoreszenzmikroskop. Fokussieren Sie die Zellen auf verschiedene Vergrößerungen, beobachten Sie die Zellen unter Phasenkontrast und verschiedenen Anregungsfiltern, und speichern Sie die Bilder.
Zur Zelldifferenzierung die CSCs in einer Sechs-Brunnen-Platte mit zwei Millilitern 37 Grad Celsius, vorgewärmtem CSC-Wartungsmedium, anbauen. Wenn die Zellen 80 bis 95% Konfluenz erreichen, ersetzen Sie das Pflegemedium durch zwei Milliliter, 37 Grad Celsius, vorgewärmte Kardiomyozyten Differenzierungsmedium. Inkubieren bei 37 Grad Celsius, in einem 5%CO2 für bis zu zwei bis drei Wochen.
Ändern Sie das Differenzierungsmedium alle zwei bis drei Tage. Beobachten Sie während des mittleren Wechsels die Zellmorphologie unter dem Mikroskop, um die guten Kulturbedingungen zu gewährleisten. Nach 12 Tagen die Zellen nach einem Standard-Immunstainierungsprotokoll für Differenzierungsmarker abbilden.
Zwei- bis dreitage kultivierte CSCs zeigen eine spindelförmige Morphologie, wenn sie unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet werden. Nach sieben Tagen Kultur zeigen sie einen Wandel in der Morphologie, der sich länglich entwickelt. Nach der Immunfärbung für Marker der Pluripotenz zeigen CSCs Ausdrücke von OCT4, SOX2 und Nanog.
Darüber hinaus vermehren sich CSCs im Kulturmedium und drücken den Proliferationsmarker Ki67 aus. Um den kardialen Ursprung von CSCs zu charakterisieren, wurde die Expression von Herzmarkern untersucht, und die Zellen zeigten sich positiv für die Herzmarker Sca-1, NKX2.5 und GATA4. Nach der Kultivierung im Kardiomyozytendifferenzierungsmedium für 12 Tage zeigen differenzierte CSCs die Expression der Kardiomyozytenmarker ACTININ und TROPONIN-I.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass das Mischen der Gradientenlösung und des Filtrats nicht zugelassen wird. Es ist auch wichtig, die Beschleunigung und Verzögerung auf niedrigste Geschwindigkeit einzustellen. Wer auch immer sie verunreinigt, es wird empfohlen, alle Zellisolationsprozess in einem Biosicherheitsschrank durchzuführen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie magnetisch-perlenbasierte Trennung oder strömungszytomettische Zellsortierungsmethoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie klar die homogene Population von Herzstammzellen ist? Der Rissradius in einer Herzstammzelle ist ein großer Marker, und es gibt Unterschiede zu Kardiomyozyten. Nach der Entwicklung wird diese Technik den Weg für die Forscher auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf-Erkrankungen ebnen, die oft hohe Ausbeute von Herzstammzellen aus dem Mausherz, die für die regenerative Therapie bei ischämischer Herzinsuffizienz wichtig sein könnte.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chirurgischen Klinge, Bleichmittel und DMSO gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von PersonalSchutzausrüstungen, PSA, sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
