Dieses Projekt wurde von der Case Western Reserve University Start Mittel bereitgestellt, um E. Jolly finanziert. Infizierte Schnecken wurden von der Bilharziose Resource Center, NIH-NIAID (NIAID Contract No HHSN272201000009I) zur Verfügung gestellt. Wir danken auch Chris King und Ronald Blanton für die Unterstützung bei der Sicherung infiziert schistosome Schnecken und für hilfreiche Diskussionen.

Schutzmaßnahmen: Schistosome Cercarien können direkt in die Haut eindringen, ohne die Bedürfnisse eines Schnittes oder Poren, und verursachen die chronische Krankheit Bilharziose. S. mansoni ist eine Sicherheitsstufe 2 Organismus, also richtige persönliche Schutzausrüstung und geeignete Schutzmaßnahmen zu beachten bei der Arbeit mit infektiösen Zerkarien werden. Die meisten der Geräte notwendig, um zu wachsen und verwandeln schistosomes ist Standard, mit ein paar wichtigen Ausnahmen in der Tabelle am Ende des Protokolls zur Kenntnis genommen. Alle Zerkarien Arbeit sollte in einem isolierten Raum durchgeführt werden. Schistosomules sollten in einem sterilen, genehmigt Biosicherheit Haube kultiviert werden. Zwei Schichten von Nitril-oder Latexhandschuhe getragen werden, da sollte ein Kittel, eine wasserdichte Schuhe, Hosen ohne Löcher oder Risse, und wasserdicht Ärmelschoner für Ihre Handgelenke und Arme. Im Falle eines unbeabsichtigten Ausbringens sofort Spray kontaminierten Bereich mit 70% Ethanol oder 10% Bleichmittel, reibt energisch, wenn auf Ihre Person. Dies wird ausreichen, um die Parasiten zu deaktivieren, sondern alle möglichen Infektionen sollten gemeldet und ernst genommen werden. Obwohl schistosomules nicht angeboren infektiöse, variieren institutionelle Vorgaben, und sollte konsultiert werden, um festzustellen, ob BSL2 Vorsichtsmaßnahmen bei infektiösen Lebensphasen erforderlich sind. Desinfizieren Sie alle Flächen, die in Kontakt mit potentiell infektiösen Substanz nach dem Experiment durchgeführt und entsorgen Abfälle in einem genehmigten geltenden Bestimmungen. HINWEIS: Cover Schnecke Host bins 1 bis 2 Tage vor dem Vergießen und vor Licht schützen 1. Harvesting Cercarien aus der Schnecke Host <ol><li> Füllen Sie ein sauberes, 500ml Becher frei von Waschmittel halbwegs voll mit destilliertem Wasser auf Raumtemperatur gebracht. Bei der Arbeit mit Host-Schnecken mit Miracidien zu verschiedenen Zeitpunkten infiziert, verwenden Sie einen separaten Becher für jede Infektion date (Dies ist besonders wichtig, wenn die Schnecken für zukünftige Experimente wieder verwendet werden). Die Größe der Becher kann auch kleiner sein je nach Erfahrung des Anwenders. </li><li> Sammeln infizierten Schnecke Hosts, die Sie wollen, Schuppen und sorgfältig hinterlegen sie in das Becherglas mit einem Standard-Aquarienfische net und für allgemeine Zwecke Pinzette nach Bedarf. </li><li> Legen Sie Becherglas auf einen Notfall Auffangwanne ca. 8 bis 12 cm unterhalb Lichtquelle eine Glühlampe. Lassen Sie Standplatz für 1-2 Stunden unter dem Licht. Cercarien verlassen die Schnecke Host, wenn sie hellem Licht ausgesetzt. </li><li> Sorgfältig herauszufiltern Schnecken aus der Cercarien Mischung. Nehmen Sie zusätzliche Sicherheitsvorkehrungen, als Gemisch ist hochgradig ansteckend. Denken Sie daran, Cercarien können direkt durchdringen die menschliche Haut! </li><li> Ersetzen Mischung unter Lichtquelle für ca. 15 Minuten, so dass keine Partikel Abfallstoffe zu begleichen. </li><li> Transfer Cercarien in einen sauberen Erlenmeyerkolben mit einer Pipette, die Vermeidung der Ablagerungen am Boden des Bechers. Der Kolben wird bei ca. 45 °-Winkel auf Eis im Dunkeln für 45 bis 60 Minuten, so dass Cercarien in einer Ecke zu begleichen. </li><li> Verwenden Sie eine 50-ml-Pipette von 75 bis 90% der Überstand zu entfernen und lagern es in Becherglas mit 10% Bleichmittel oder 70% Ethanol, dabei nicht zu lassen Wassertropfen mit Cercarien Tropfen aus der Pipette. </li><li> Swirl den Erlenmeyerkolben mit Cercarien sanft auf die Cercarien in Lösung zu resuspendieren. Verwenden einer Pipette auf die Probe zu sterilen 50 ml konische Röhrchen übertragen. Die Röhrchen wieder auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Cercarien wird zum Boden des Röhrchens im Dunkeln zu begleichen. </li></ol> 2. Manuelle Umwandlung von Cercarien zu schistosomules Bevor Sie beginnen: Stellen Sie RPMI 1640 komplett (RPMI, 5% fötalem Rinderserum, 1X Pen / Strep) und warm bis 37 ° C. (Es ist wichtig, dass die Rinderfötenserum verwendet durch Inkubation inaktiviert wurde ein 56 ° C für 1 Stunde als schistosomes können empfindlich zu ergänzen). <ol><li> In einem biohazard Kapuze, entfernen Überstand bis auf 5 bis 10 ml Lösung in je 50 ml konische mit einer Pipette oder Vakuum-Gerät. </li><li> Bringen Sie einen 22-Gauge-double-ended, Luer-lok Emulgieren Nadel zu einem entsprechend dimensionierten Spritze. </li><li> Langsam ziehen Mischung in die Spritze. Sammeln Cercarien aus allen 50 ml-Tuben in einer Spritze. Seien Sie aufmerksam der tropfen. </li><li> Drehen Sie vorsichtig Spritze über eine solche mit dem freien Nadel am Ende ist. Bringen Sie eine weitere Spritze aus auf diese Seite des emulgierenden Nadel. </li><li> Pass die Mischung durch die Nadel insgesamt 40-mal (20 mal hin und her), um die Cercarien verwandeln. </li><li> Positionieren Sie die Kartusche so dass die Mischung in der unteren Spritze enthalten ist und die obere Spritze leer ist. Entfernen Sie die obere Spritze und desinfizieren in 70% Ethanol. </li><li> Kaution Mischung tropfenweise in ein sauberes hoch ummauerten 100mm x 50mm Pyrex Schüssel oder Kristallisierschale. Desinfizieren Sie Nadel und Spritze in 70% Ethanol. </li><li> Fügen Sie 37 ° C RPMI 1640 komplette Medien, so dass dieBoden der Petrischale ist komplett abgedeckt, als ob Gießen einer Luria Broth Platte. </li><li> Vorsichtig, um schistosomules in der Mitte der Petrischale zu sammeln. Vermeiden Sie Spritzer. Hinweis: Es kann sinnvoll sein, schalten Sie die Haube Licht für diesen Schritt, um weitere angemessene Visualisierung des schistosomules in der Mitte. </li><li> Unmittelbar Kaution konzentriert schistosomules in ein frisches 12-well Zellkulturplatte auch mit einer sterilen Pipette. </li><li> Wiederholen 2.9 und 2.10 bis schistosomules nicht mehr vorhanden sind in der Mitte der Schale (etwa 10 mal). Kaution jeweils anschließende Sammlung in ein frisches gut. </li><li> Füllen Sie jede Vertiefung bis zur Hälfte (~ 1,5 ml) mit vorgewärmtem RPMI komplette Medien. </li><li> Visualisieren Sie auf einem inversen Mikroskop auf Anwesenheit von schistosomules und Abwesenheit von Cercarien zu überprüfen. </li><li> Wachsen die schistosomules in einer CO 2-Inkubator eingestellt auf 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Bis Transfer von transformierten schistosomules in Kulturmedien, Visualisierung unter einem inversen Hellfeld-Mikroskop (siehe Geräte-Tisch für ein Beispiel) sollte Ausbeute ein Bild ähnlich 1, in denen nur umgewandelt schistosomules sind in der Abbildung gut. Mögliche Verunreinigungen könnten intakt Cercarien, durchtrennt Zerkarien Schwänze, oder andere Fremdkörper. Wenn keine inverse Mikroskop zur Verfügung steht, wird eine Standard-Mikroskop oder sogar eine Dissektion Umfang ausreichen, um die schistosomules visualisieren. Beachten Sie, dass dieses Verfahren nicht immer zu verwandeln 100% der Cercarien. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1: Transformierte schistosomulum <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2: Cercarien und Severed Tails

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	<li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li><li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis+and+water+resources+development:+systematic+review,+meta-analysis,+and+estimates+of+people+at+risk.">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li><li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis.">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li><li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection:+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis.">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li><li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae:+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology.">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li><li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+within+host+tissues:+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration.">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li><li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni.">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li><li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+cercarial+responses+to+irradiance+changes.">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li><li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula,+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum.">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li><li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes.">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing.">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li><li>Yoshino, T. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li><li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules.">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li><li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll.">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li><li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mehrere potenzielle Probleme könnten bei der Transformation Verfahren entstehen, aber dieses Protokoll wurde entwickelt, um die meisten dieser Probleme zu vermeiden. Eine mögliche Gefahr ist die Verstopfung der emulgierenden Nadel, die in der Regel entsteht durch Ablagerungen in der Ernte in Schritt 1.3 links. Achten Sie darauf, damit alle Partikel bis in Schritt 1.5 zu lösen und den Cercarien sorgfältig Transfer in Schritt 1.6, um dieses Problem zu vermeiden. Auch, wie zuvor beschrieben, arbeitet in einem biologischen Sicherheitsschrank, der persönlichen Schutzausrüstung verwenden (auch Gesichtsschutz) und Vermeidung von übermäßigen Druck auf die Spritzen ist ratsam. Freistehendes Zerkarien Schwänzen kann in den Medien, was auf schlechte Trennung in Schritt 2,9 visualisiert. Die Schwänze weisen einen Krampf-wie Bewegung und haben einen ausgeprägten Form (siehe Abbildung 2), und auf diese Weise erkennt man leicht die schistosomules. Die Schwänze können durch Waschen der schistosomules über RPMI komplett so dass die schistosomules absetzen entfernt werden. Die Schwänze bleiben schwebend und kann abgesaugt werden. Wenn intakt Cercarien in den Medien präsent sind, war die Umwandlung in Schritt 2.5 nicht ordnungsgemäß ausgeführt. Ein Bild von einer intakten Cercarie ist in Abbildung 3b als Referenz dargestellt. Wenn dieses Problem auftritt, sicherzustellen, dass die emulgierende Nadel verwendet der richtigen Größe ist. Auch kann die Anzahl, wie oft die Zerkarien Mischung durch die Nadel geführt wird erhöht werden, obwohl 40 Mal wird in der Regel viel mehr als genug, um 100% Scherung der Zerkarien Schwänze Ansatz. Transformation von Cercarien in schistosomules wurde erstmals 1974 von Colley und Wikel (13) beschrieben. Seitdem hat Vorbereitung schistosomules getan entweder mit der Scher-Strategie mit einer Nadel und Spritze, wie in diesem Protokoll beschrieben ist, oder mit Hilfe eines Vortex-Ansatz und getrennt mit Steigungen von Percoll (14, 15) oder wirbelnden wie in diesem Papier gezeigt. Diese beiden Techniken zur Herstellung schistosomules sind wunderschön von Fred Lewis (16) und weitere Informationen für die weitere Züchtung von schistosomules für langfristiges Wachstum kann am NIAID schistosome Resource Center (gefunden werden beschrieben <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;Emulgieren Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 bis 825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medium 1X (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) hitzeinaktiviertem </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Kristallisierschale (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> General Purpose Tweezers </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco Aquarium net für Artemia </td><td> Petco </td><td> SKU: 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

Schistosome Parasiten sind die Erreger der Bilharziose, eine chronische Invalidität nach Krankheit, die mehr als 200 Millionen Menschen betroffen sind weltweit an zweiter Stelle die Malaria unter parasitäre Krankheiten im Bereich der öffentlichen Gesundheit und sozio-ökonomischen Auswirkungen (1-4). Schistosome Parasiten sind Trematoden Würmer mit einem komplexen Lebenszyklus Austausch zwischen einem parasitären Leben in Mollusken und Säugetieren Gastgeber mit dazwischen frei schwimmenden Bühnen. Kurz gesagt, infizieren freischwimmenden Cercarien einen Säugerwirt durch Eindringen in die Haut mit Hilfe von sekretierten Proteasen, während welcher Zeit die Cercarien ihre Schwänze zu verlieren, die Umwandlung in schistosomules. Die schistosomules muss nun entziehen dem Immunsystem des Wirts, die Entwicklung einer gut für die Verdauung der roten Blutkörperchen, und migrieren wenn die Lunge und Pfortaderkreislauf dem Weg zu ihrem endgültigen Bestimmungsort in der Leberpforte und schließlich die Mesenterialvenen (für S. mansoni) wo männliche und weibliche Würmer Paar und mate, Produktion von Hunderten von Eiern täglich. Einige der Eier sind aus dem Körper in frisches Wasser, wo die Eier schlüpfen freischwimmende Miracidien (5-10) ausgeschieden. Die Miracidien infizieren bestimmte Schneckenarten und verwandeln sich in Mutter und Tochter Sporocysten, die ihrerseits produzieren infektiöse Cercarien, die Vollendung des Lebenszyklus. Leider kann die gesamte schistosome Lebenszyklus nicht in vitro kultiviert werden, sondern infektiöse Zerkarien können in schistosomules umgewandelt werden, und die schistosomules können Wochen für die Analyse von schistosome Entwicklung in vitro oder Mikroarray-Analyse kultiviert werden. In diesem Protokoll, bieten wir eine visuelle Beschreibung der Zerkarien Transformation und In-vitro-Kultivierung von schistosomules. Wir werfen infektiösen Zerkarien aus der Schnecke Host Biomphalaria glabrata und manuell wandeln sie in schistosomules durch Lösen die Schwänze mit einem Emulgator Doppel-Nadel. Die in vitro Zerkarien Transformation und schistosomules Kultur beschriebenen Techniken vermeiden die Verwendung eines Säugetier-Wirt, die Visualisierung von schistosomes vereinfacht und erleichtert die Sammlung des Parasiten für experimentelle Analyse. In-vitro-Transformation und Kultivierung von Techniken der schistosomes schon seit Jahren getan (11, 12), aber keine visuelle Protokolle entwickelt worden, die verfügbar sind, die gesamte Gemeinde.

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Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Wir beschreiben einen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Verfahren zur Kultivierung von Schistosomula der flatworm Parasiten<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, Über die Ernte und Umwandlung von infektiösen Cercarien aus der Süßwasserschnecke Zwischenwirt Biomphalaria glabrata.

Zerkarien Transformation und In-vitro- Anbau von Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

17.9K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Wir beschreiben einen In-vitro- Verfahren zur Kultivierung von Schistosomula der flatworm Parasiten Schistosoma mansoni, Über die Ernte und Umwandlung von infektiösen Cercarien aus der Süßwasserschnecke Zwischenwirt Biomphalaria glabrata.

Serie: Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Mit den Eizellen<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als ein<em&gt; In vivo</em&gt; Modell von Helminthen-induzierten Lungenentzündung

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

Der Anbau von<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Biolistischen Transformation einer Leuchtstoff Tagged-Gens in den Opportunistic Pilzpathogenentwicklung<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

In - vitro - Methoden zum Vergleich der Zielbindungs und CDC Induktion zwischen Therapeutische Antikörper: Anwendungen in Biosimilarity Analyse

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikel von Erwachsenen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, investigations of interactions between endobiotics (e.g., drugs and prebiotics) and gut microbiota have become an important research topic. However, in vivo experiments with human volunteers are not ideal for such studies due to bioethics and economic constraints. As a result, animal models have been used to evaluate these interactions in vivo. Nevertheless, animal model studies are still limited by bioethics considerations, in addition to differing compositions and diversities of microbiota in animals vs. humans. An alternative research strategy is the use of batch fermentation experiments that allow evaluation of the interactions between endobiotics and gut microbiota in vitro. To evaluate this strategy, bifidobacterial (Bif) exopolysaccharides (EPS) were used as a representative xenobiotic. Then, the interactions between Bif EPS and human gut microbiota were investigated using several methods such as thin-layer chromatography (TLC), bacterial community compositional analysis with 16S rRNA gene high-throughput sequencing, and gas chromatography of short-chain fatty acids (SCFAs). Presented here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems. Importantly, this protocol can also be modified to investigate general interactions between other endobiotics and gut microbiota.

Described here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems.

Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...