Derzeit haben wir ein begrenztes Verständnis der Biologie der Plasmodiuminfektion der Leber. Dieses Protokoll hat uns geholfen, viele transgene Linien zu generieren, die dazu beigetragen haben, einige kritische Fragen über die Biologie des Organismus zu beantworten. Ein grundlegendes Verständnis des Parasiten und seiner Biologie ist erforderlich, um neue Werkzeuge und Ansätze zur Bekämpfung der Malariainfektion zu entwickeln.
Die Methode der Transgenese, die wir hier beschreiben, hat uns geholfen, einige wichtige und komplexe Biologie des Organismus und des Wirts zu entschlüsseln. Dieses Verfahren wird von Carson Bowers, meinem Laborleiter, demonstriert. Nachdem Sie mit P. Bergehei infizierte Mäuse erzeugt und eingeschläfert haben, sammeln Sie zwei Milliliter Blut von zwei infizierten Mäusen in einer sterilen Umgebung in fünf Milliliter Elsevier-Lösung.
Das Blut wird bei 450 g acht Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 10 Milliliter vollständigem RPMI-Medium. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut und suspendieren Sie das Pellet in 25 Milliliter vollständigem RPMI-Medium.
Die Zellsuspension wird in einen T75-Kulturkolben mit einer Filterkappe überführt und durch leichtes Schütteln inkubiert, um die Zellen in Suspension zu halten. Am Ende der Inkubation werden 500 Mikroliter der Probe entnommen. Zentrifugieren Sie das Pellet und suspendieren Sie es in 10 Mikroliter vollständiger RPMI-Medien.
Bereiten Sie als Nächstes einen dünnen Blutausstrich vor. Färben Sie den Blutausstrich mit der Giemsa-Färbung und bestimmen Sie die Häufigkeit von Schizonten. Für eine optimale Transfektionseffizienz sollten sich 60 bis 70 % der Parasiten im schizonten Stadium befinden.
Bereiten Sie einen Gradientenzentrifugationspuffer vor, indem Sie 13 Milliliter Dichtegradienten-Stammmedium in einem 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen rekonstituieren. 25 Milliliter Blutkultur in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen überführen. Tragen Sie dann vorsichtig 20 Milliliter Gradientenzentrifugationspuffer auf den Boden des Zentrifugationsröhrchens auf, indem Sie eine schmale Glaspipette verwenden, um eine Gradientensäule zu erzeugen und eine klare Trennung zwischen dem Puffer und dem Medium zu gewährleisten.
Zentrifugieren Sie den vorbereiteten Puffer und das Medium 20 Minuten lang bei 450 G ohne Pause bei Raumtemperatur. Mit einer Weidepipette wird die Schizontenschicht an der Grenzfläche zwischen dem Nährmedium und dem Gradientenzentrifugationspuffer vorsichtig entfernt. Geben Sie es in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen.
Resuspendieren Sie die isolierten Schizonten in kompletten RPMI-Medien und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 40 Milliliter. Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstandes wird der Schizont erneut in 10 Milliliter vollständigem RPMI-Medium suspendiert. Dann wird für jede Transfektion ein Milliliter dieser Lösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die infizierten Zellen durch Zentrifugation bei 16.000 G für fünf Sekunden pelletiert.
Als nächstes werden 100 Mikroliter des Elektroporationspuffers bei Raumtemperatur mit fünf Mikrogramm Zielplasmid-DNA in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert. Nach dem Zentrifugieren der infizierten Zellen wird der Überstand entfernt und die Zellen vorsichtig in die vorbereitete Nukleoefektorlösung plus Plasmid-DNA resuspendiert. Anschließend wird die Suspension mit einem geeigneten Nukleofektorprogramm in Elektroporation, Küvetten und Transfekt überführt.
Als nächstes geben Sie 100 Mikroliter des vollständigen RPMI-Mediums in die Küvette. Die gesamte Lösung in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen überführen und auf Eis legen. Überprüfen Sie die Parasitämiewerte bei den Mäusen, die mit dem transfizierten Schizont geimpft wurden, täglich ab zwei Tagen nach der Inokulation.
Sobald die Infektion bestätigt ist, beginnen Sie mit der Auswahl des Arzneimittels, indem Sie das Medikament oral verabreichen und Wasser nach Belieben trinken. Überwachen Sie die Parasitämie mit Blutausstrichen ab sechs Tagen nach Beginn der Pyromethymin-Behandlung. Wenn die Parasitämie mindestens 1 % erreicht, übertragen Sie die Parasiten auf naive B6-Mäuse, um Parasitenvorräte im Blutstadium anzulegen.
Sobald die Parasitämie 2 % bis 5 % erreicht, werden Vorräte angelegt und kryokonserviert. Trennen Sie die weiblichen Mücken einen Tag vor der Mückeninfektion, indem Sie einen Handschuh mit auf 37 Grad Celsius erhitztem Wasser auf den Käfig legen, in dem sich sowohl männliche als auch weibliche Mücken befinden. Verwenden Sie einen Insektensauger, um die weiblichen Mücken, die von der Wärmequelle angezogen werden, zu entfernen und sie zur Infektion in einen kleineren Käfig zu bringen.
Am Tag der Mückenfütterung und -infektion ist die Parasitämie bei den infizierten B6-Mäusen zu bestimmen. Eine Parasitämie zwischen 2 % und 5 % ist optimal für eine Mückeninfektion. Nachdem Sie die Parasitämie überprüft haben, übertragen Sie die Infektion auf die weiblichen Mücken, indem Sie die betäubten Mäuse auf die weiblichen Mücken im Käfig legen.
Spreizen Sie die Vorder- und Hinterbeine manuell, um die größte Oberfläche für die Mückenfütterung zu schaffen. Lassen Sie die infizierten Mäuse 15 Minuten lang in jedem Käfig und überprüfen Sie alle fünf Minuten, ob die Mäuse nicht wach sind. Sobald die Fütterung abgeschlossen ist und die Mäuse eingeschläfert sind, entsorgen Sie sie sicher gemäß den Richtlinien der Einrichtung.
Um eine erfolgreiche Infektion innerhalb der Mücken zu überprüfen, isolieren Sie die Mittelweide der Mücken, indem Sie das terminale Bauchsegment 10 Tage nach der Infektion mit einer Zange entfernen. Betrachten Sie dann den Mitteldarm unter polarisiertem Licht, um das Vorhandensein von Oozysten zu erkennen. 18 Tage nach der Infektion werden fünf bis 10 Mücken seziert, um die Anzahl der vorhandenen Sporozoiten zu bestimmen.
Um die Sporozoiten zu isolieren und zu zählen, entfernen Sie vorsichtig den Kopf der Mücke und üben Sie dabei mit einer Zange oder einer feinen Präpariernadel Druck auf den Brustkorb aus. Die Speicheldrüsen bleiben am entfernten Kopf haften. Als nächstes entfernen Sie alle zusätzlichen Mückenreste von den Speicheldrüsen und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 400 Mikrolitern Mückenpräparat.
Brechen Sie dann die isolierten Speicheldrüsen auf, indem Sie sie 15 bis 20 Mal durch eine 30-Gauge-Nadelspritze führen. Danach geben Sie 10 Mikroliter der gestörten Speicheldrüsen in Mückendissektionsmedien in ein Hämozytometer und zählen Sie. Zum Schluss werden die Speicheldrüsen in der gewünschten Konzentration von Mückendissektionsmedien oder PBS zur Injektion in Mäuse oder zur langfristigen Kryokonservierung wieder suspendiert. Wie mikroskopische Aufnahmen von reifem und unreifem P.berghei schizont in parasitierten Mäuseblutkulturen werden präsentiert.
Wie mikroskopische Aufnahmen eines Mückenkopfes, bei dem die Speicheldrüsen während der Sektion noch intakt sind, und die präparierte Speicheldrüse unter niedrigeren und höheren Vergrößerungen gezeigt werden. Die Generierung eines grünen Fluoreszenzsignals in den PB, GFP 11 infizierten HEPA-GFP-1- bis 10-Wirtszellen deutete auf die Lyse der parasitophoren Vakuole hin. Es ist wichtig, die Chaisson-Ebene vorsichtig zu entfernen, ohne die Verlaufsschnittstelle zu unterbrechen.
Außerdem braucht es ein wenig Übung, um die Speicheldrüsen zusammen mit dem Kopf während der Sporenlichtisolierung zuverlässig zu entfernen. Nach der Isolierung können transgene Sporozoiten kryokonserviert oder frisch für In-vivo- oder In-vitro-Infektionsstudien verwendet werden.
