Arbeit im Labor SM wird durch ein Wellcome Trust Forschung Career Development Fellowship [WT097411MA] unterstützt.

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Bei der Überwachung von Autophagie und das Zytoskelett in vitro unter Verwendung von Gewebekulturzellen, können die in den Abschnitten 1 und 2 beschriebenen Protokolle für eine Vielzahl von Gewebekulturzelltypen angewendet werden. Darüber hinaus, um die Autophagie folgen (zB ATG8 / LC3 + ve Autophagosomen) und Zytoskelett (zB., Actin Schwänze, septin Käfige) Dynamik in Echtzeit während der Infektion mit Shigella Live-Bildgebung können Gewebekulturzellen transient mit GFP transfiziert werden, RFP- oder GFP-markierten Konstrukte wie zuvor beschrieben, 7,8. (. Dh in der Regel für die Echtzeit-Analyse bedenkt, dass Shigella können 5-30% der HeLa-Zellen bei 100 eindringen wünschenswert: 1 MOI), den Anteil der Zellen, die durch Shigella infiziert zu erhöhen, direkt hinzufügen 400 ul Shigella (OD 600 = 0,3 0,6), um Zellen in 2 ml MEM (Serummangel) und warten Sie mindestens 1,5 Stunden nach der Infektion für eine ausreichende Bakterieneintrag, die Flucht aus dem Phagosom, Replikation, autophagy Anerkennung und septin Käfighaltung. Alternativ kann man die M90T Shigella AFAI Stamm, der das Adhäsin AfaE exprimiert und haben viel höhere Invasion Fähigkeiten in epithelialen Zellen im Vergleich zu dem Stamm 28 M90T verwenden. Zu beachten ist, die M90T AFAI Stamm wurde noch nicht in vivo unter Verwendung von Zebrafisch getestet. Platten von Shigella-Kolonien können bei 4 ° C für 2-3 Tage gehalten und für verschiedene Experimente verwendet werden. Im Laufe der Zeit wurden Kolonien von Shigella, die die Virulenz-Plasmid können die Kongorot absorbieren und erscheinen verloren haben, ihre Virulenz-Plasmid beibehalten haben. Aus diesem Grund empfehlen wir, frische Bakterienbestände verwenden, wenn möglich. Bei der Überwachung der Zellbiologie der Infektion in vivo, in den Abschnitten 3 und 4 verwenden Wildtyp-AB-Linie Zebrafisch beschriebenen Protokollen. Um Shigella -leukocyte Wechselwirkungen zu überwachen, können transgenen Zebrafischlinien verwendet werden, zB MPX: GFP oder Lyz: DsRed, um visuelleize Neutrophilen 19,29,30 oder MPEG1: mCherry zu Makrophagen 19,31 visualisieren. Autophagie in vivo sichtbar zu machen, kann das GFP-transgenen Linie Lc3 Zebrafisch 19,24 verwendet werden, wie in Abschnitt 3.8 beschrieben. Autophagie in vivo zu stören, hat die effektive Dosis Morpholino Oligonukleotid experimentell geprüft werden auf der Grundlage ihrer Effizienz Transkript Spleißen oder Proteintranslation zu hemmen. Es ist ratsam, eine Titration Experiment durchzuführen und die Erschöpfung durch RT-PCR (für Splice Morpholino-Oligonukleotid) bestätigen oder durch SDS-PAGE (für die translationale Morpholino-Oligonukleotid) 32. RNA-Isolierung aus Zebrafisch Embryonen oder Larven können mit Hilfe Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion werden. Um Protein aus Zebrafisch-Larven (8 bis 15 Larven / Rohr) zu extrahieren, mechanisch zu homogenisieren mit einem Stößel in 200 ul Lysepuffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% Octylphenol Ethylenoxid Kondensate, und Protease-Inhibitor). Zentrifugenröhrchen bei 19.000 × g bei 4 ° C für 15 min und den Überstand in ein neues Röhrchen. Hinzufügen Laemmli-Puffer und Erwärmung der Probe bei 95 ° C für 15 min. Lysate können bei -80 ° C gelagert werden, bis sie benötigt, und kann durch Western-Blot wie in Abschnitt 2.3 beschrieben, bewertet werden. Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell für die in vivo Anwendung Droge. Analyse mittels Morpholino-Oligonukleotide mit etablierten Medikamenten ergänzt werden, um die Autophagie (zB Rapamycin und Bafilomycin) zu manipulieren. Nicht infizierten und / oder infizierten Larven können mit Rapamycin (1,5 uM) oder Bafilomycin (80 nM) in E2 verdünnt und autophagischen Fluss kann durch Western-Blot wie in 25,33 beschrieben, bewertet werden behandelt werden. Die Folge der Autophagie Manipulation auf das Ergebnis der Infektion und das Überleben der infizierten Larven, wie in Abschnitt 3.5 beschrieben ausgewertet werden. Neben dem Studium WirtszelleDeterminanten, in vitro und in-vivo-Protokolle können angewendet werden, um bakterielle Determinanten für die Autophagie Anerkennung erforderlich beurteilen, mit bakteriellen Mutanten-Stämme, die unterschiedlich von Autophagie erkannt werden, zB., Shigella ΔicsA (die Shigella Protein IcsA rekrutiert N-WASP und dann Arp2 / 3 für Aktin Schwanz und septin Käfig Bildung, in seiner Abwesenheit, in seiner Abwesenheit kann es keine Aktin-Schwänze, keine septin Käfige) und ShigellaΔicsB (Shigella vermeidet die Autophagie Antwort über das bakterielle Protein-Effektor ICSB, die die Einstellung von Autophagie Maschinen IcsA verhindert sein kann es mehr septin Käfige, mehr Autophagie) 7,8 sein. Shigella keine natürliche Erreger der Zebrafisch und wächst optimal bei 37 ° C aufweist. Allerdings hat Arbeit, die Virulenzfaktoren für Shigella Invasion erforderlich gezeigt, die Flucht aus dem phagocytic Vakuole und Replikation in den cyTosol ausgedrückt werden und sind funktional in Zebrafisch-Larven bei 28 ° C 19. 28 ° C ist die am häufigsten verwendete Temperatur für Zebrafisch Aufzucht und Standardtemperatur auf Normal Zebrabärblingentwicklung 23 zu gewährleisten. Auffallend sind die großen Ereignisse, die zu pathogenen Bakterienruhr beim Menschen führen (dh Makrophagen-Zelltodes, Invasion und Vermehrung in Epithelzellen, Zell-zu-Zell-Ausbreitung, entzündliche Zerstörung der Wirts Epithel) treu in der Zebrafisch-Modell der Shigella-Infektion wieder 19. Autophagie und Zytoskelett-Gene werden ubiquitär exprimiert und haben eine breite Palette von biologischen Funktionen. Maus-Studien haben gezeigt, dass Knockout von wesentlicher Autophagie 26 oder septin Gene 5 embryonal letalen gezeigt, und es ist wahrscheinlich, dass einige dieser Gene wird auch wichtig für die Zebrafisch-Entwicklung (sein, obwohl dieses Problem durch die Tatsache, dass mehrere Zebrafisch reduziert werden soll,paraloge Gene 33). Wenn ja, gibt es mehrere Alternativen, um dieses Problem, einschließlich (i) der Nutzung von pharmakologischen Reagenzien Autophagie und das Zytoskelett regulieren, (ii) Morpholinos können unten titriert werden, zu überwinden, kann (iii) Knockout von Genen, die für nur bestimmte Zelle ausgelegt werden Typen, und / oder (iv) Gene in autophagischen Erkennung beteiligt, die nicht wesentlich für Tier Entwicklung sind (zB., p62) kann ausgerichtet sein. Während der Zebrafisch ist ein ideales Modellsystem, um die Autophagie und das Zytoskelett während Shigella-Infektion zu untersuchen, werden molekulare Werkzeuge derzeit fehlt. Das Feld muss neue Werkzeuge und Antriebs Zell-spezifische Expression der Proteine ​​von Interesse zu generieren. Niederschlagen Ausdruck der Autophagie / Zytoskelett Gene werden neue Morpholino-Sequenzen erforderlich, und neue Methoden zur Genomtechnik (zB TALEN, CRISPR / Cas9) können ebenfalls verwendet werden. In der Zwischenzeit mehrere Werkzeuge zuvor für Mensch oder Maus-Studien erzeugtgleichermaßen für Zebrafisch arbeiten. Die intrazellulären Bakterien S. flexneri hat als außergewöhnlichen Modellorganismus, um zentrale Fragen in der Biologie, einschließlich der Fähigkeit von Bakterien, die durch das Immunsystem erkannt werden 1,2 adressieren entstanden. Die Wirtszelle beschäftigt Septine auf die Motilität von S. beschränken flexneri und Ziel sie Autophagie, eine kritische Komponente der Zelle autonome Immunität 7,8. Diese Beobachtungen legen nahe, einen neuen Rahmen für die molekulare Autophagie und ihre Fähigkeit, Bakterien abgebaut zytosolischen studieren. Ein großes Problem ist jetzt vollständig entschlüsseln die molekularen und zellulären Vorgänge, und diese Ereignisse in vitro während bakterielle Infektion in vivo analysiert mit relevanten Tiermodellen validiert. Zu diesem Zweck hat der Zebrafisch als wertvolle neue Host für die Analyse von S. etabliert flexneri Infektion 19. Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Wirtszellen können mit hoher Auflösung abgebildet werden, undder Zebrafisch-Modell sollte zum Verständnis der Zellbiologie von Shigella-Infektion in vivo nachzuweisen. Zebrafisch-Larven können verwendet werden, um die Rolle von bakteriellen Autophagozytose der Wirtsabwehr zu untersuchen, und die Arbeit hat gezeigt, dass die Störung Autophagozytose nachteilig in Reaktion auf Shigella Infektion 19 beeinflussen Host Überleben. Die Beobachtungen aus der Studie von Shigella erzeugt, Septin Käfighaltung und Autophagie in vitro unter Verwendung von Gewebekulturzellen und in vivo mit Zebrafisch-Larven könnten grundlegende Fortschritte im Verständnis der Wirtsabwehr liefern. Sie könnten auch darauf hin, die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten ausgerichtet. Eine kritische Ziel dieses Berichts ist es, Sinn der molekularen und zellulären Vorgänge in vitro analysiert machen (dh Autophagie, Actin Schwänze, Septin Käfighaltung) während bakterielle Infektion in vivo im Rahmen einer entire Organismus, mit Zebrafisch-Larven. Wenn nicht mit Zebrafisch-Biologie und der Handhabung vertraut ist, kann man in die Tiefe Protokolle für die richtige Haltung Zebrafisch 23 und in vivo Analyse der Zebrafisch-Infektion 19,35 beziehen.

Shigella flexneri, ein Gram-negatives Bakterium invasive enteropathogenen, kann von Phagosomen in das Cytosol zu entkommen, und polymerisieren die Host-Aktin-Zytoskelett zu zytosolischen Immunantwort zu entgehen und zu fördern intra-und interzelluläre Bewegung 1,2. Trotz des Verständnisses von Aktin-basierte Motilität in vitro 3,4 haben die Mechanismen beschränken bakterielle Verbreitung in vivo nicht vollständig definiert wurde. Dies ist wichtig für ein besseres Verständnis der angeborenen Immunität und Wirtsabwehr. Septine, eine hoch konservierte Familie von Proteinen unter Metazoen sind Guanosintriphosphat (GTP) bindende Proteine, die in hetero-oligomeren Komplexen zusammen und bilden unpolaren Filamente, die mit zellulären Membranen und Zytoskelett 5,6 verknüpfen. Neuere Arbeiten haben entdeckt, dass infizierte Wirtszellen können Shigella aktinvermittelten Bewegung durch Abschottung Bakterien gezielt zu verhindern autophagy innerhalb Septin Käfige &quot;, enthüllt die ersten zellulären Mechanismus, der Aktin-basierte Motilität 7,8 entgegenwirkt. Eine große offene Feld der Untersuchung liegt nun in Septin Biologie und Infektion. Septin Montage, durch eine Vielzahl von Krankheitserregern hervorgerufen (zB Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), kann als ein zentrales Thema in der Wirtsabwehr 5,12 entstehen. Autophagie, eine hoch konservierte intrazelluläre Abbauprozess wird als eine Schlüsselkomponente der Zell-autonome Immunität wegen seiner Fähigkeit, cytosolische Bakterien zum Lysosom 13,14 liefern angesehen. Allerdings ist die Rolle von bakteriellen Autophagie in vivo zu beschränken oder zu fördern bakteriellen Replikations bleibt schlecht verstanden 15,16. Der Zebrafisch (Danio rerio) als ein wirbel Modell für die Untersuchung von Infektionen auf, da sie optisch zugänglich ist,bei den Larvenstadien, wenn das angeborene Immunsystem ist bereits funktionelle 17,18. Neuere Arbeiten haben die Anfälligkeit des Zebrafisch-Larven S. gekennzeichnet flexneri, ein Paradigma für bakterielle Autophagie 15 und hat die Shigella -zebrafish Infektionsmodell verwendet, um die Manipulation der Autophagie für antibakterielle Therapie in vivo 19 studieren. Dieser Bericht bietet neue Tools und Tests zu studieren S. flexneri Wechselwirkungen mit Autophagie und dem Zytoskelett. In einem ersten Schritt, Protokolle zu überwachen Autophagozytose-Zytoskelett Interaktionen mit Shigella-Infektion des humanen epithelialen Zellinie HeLa beschrieben. Um die Rolle der Autophagie-Zytoskelett Interaktionen auf der Shigella Infektionsprozess in vitro zu beurteilen, Methoden Autophagozytose und Zytoskelett-Komponenten (mit siRNA oder pharmakologische Reagenzien) zu manipulieren sind. Neue Arbeit hat gezeigt, dass durch die Verwendung Shigella-Infektion of Zebrafisch-Larven können ähnliche Tests angewendet werden, um die Zellbiologie der Infektion in vivo zu untersuchen. Protokolle zu erstellen und zu infizieren Zebrafisch-Larven detailliert sind, und die Antwort der Gastgeber für Shigella-Infektion in vivo zu beurteilen, Protokolle, um festzustellen Host Überleben und bakterielle Belastung der infizierten Larven vorhanden sind. Methoden, um die Rekrutierung von septin und Autophagie Marker Shigella überwachen (entweder mit festen oder Wohnzebrafisch-Larven) und Methoden, um die Rolle dieser Prozesse in vivo zu testen [mit Morpholino-Oligonukleotide (in 1-4 Zell-Stadium Embryos injiziert) oder pharmakologische Reagenzien ( direkt mit dem Zebrafisch Badewasser zugesetzt)] werden ebenfalls diskutiert. Dieses Arbeitsprogramm wird voraussichtlich Einblick in die für die Kontrolle der Infektion durch cytosolische Wirtsreaktionen erforderlich Mechanismen aus.

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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

Shigella flexneri ist ein intrazelluläres Pathogen, das von Phagosomen entkommen können, um das Zytosol zu erreichen, und polymerisieren die Host-Aktin-Zytoskelett, seine Beweglichkeit und Verbreitung zu fördern. Neue Arbeit hat gezeigt, dass Proteine ​​in Aktin-basierte Motilität beteiligt sind auch die Autophagie, eine intrazelluläre Abbauprozess von entscheidender Bedeutung für die Zell autonome Immunität verbunden. Auffallend ist, können Wirtszellen Aktin-basierte Motilität von S. verhindern flexneri durch Abschottung Bakterien in Septin Käfige &quot;und Targeting sie Autophagie. Diese Beobachtungen zeigen, dass ein vollständigeres Verständnis der Septine, eine Familie von filamentösen GTP-bindende Proteine, werden neue Einsichten in den Prozess der Autophagie bereitzustellen. Dieser Bericht beschreibt Protokolle Autophagie-Zytoskelett Interaktionen von S. verursacht überwachen flexneri in vitro unter Verwendung von Gewebekulturzellen und in vivo mit Zebrafisch-Larven. Diese Protokolle ermöglichen Untersuchung der intrazellulären mechanisms, die Verbreitung von Bakterien auf molekularer, zellulärer und ganzen Organismus-Ebene steuern.

Bei Infektion von Gewebekulturzellen in vitro, S. flexneri aus dem Phagosom entkommen und dringen in das Cytosol. Im Cytosol können Wirtszellen, die das Actin-basierte Motilität von Shigella durch Abschottung Bakterien in septin Käfige (1A) zu verhindern. Bakterien septin Käfigen eingeschlossenen kann auch durch Autophagozytose Marker p62 (1B) und LC3 (1C) gekennzeichnet werden. Diese Beobachtungen unterstreichen einen neuen Mechanismus der Immunabwehr, die Verbreitung von Krankheitserregern invasive beschränkt, und auch zeigen, neue Verbindungen zwischen Autophagie und dem Zytoskelett. Auffallend ist, dass die Erschöpfung der Autophagie Marker deutlich reduziert septin Käfighaltung von Bakterien (2A), und die Arbeit hat auch gezeigt, dass der Abbau der Käfighaltung septin Rekrutierung von Autophagie-Marker 8 deutlich reduziert. Somit sind zumindest im Fall von Shigella, septin Kranz und Autophagosom formation können als voneinander abhängige Prozesse betrachtet werden. Anderen zellulären Anforderungen Kompartimentierung von Shigella septin Käfige umfassen Aktin-Polymerisation und Aktomyosin Aktivität (2B). Es gibt keine natürliche Mausmodell der Bakterienruhr, und Untersuchung von Shigella Pathogenese, septin Biologie und bakterielle Autophagie in vivo kann von einem neuen Tiermodell der Infektion, dem Zebrafisch-Larven 19 profitieren. Es ist möglich, Zebrafisch-Larven durch Injizieren Bakterien in verschiedenen anatomischen Stellen zu infizieren, wie intravenöse Injektionen für die Schwanz Überleben Experimente und Schwanzmuskel Injektionen in vivo-Mikroskopie (Abbildung 3A). Abhängig von der Dosis, S. flexneri injiziert im Zebrafisch-Larven können entweder innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion gelöscht werden, oder kann in einer fortschreitenden und letztlich tödlichen Infektion (3B - 3D) führen. Shigella Virulenzfaktoren factors werden bei 28 ° C, die optimale Wachstumstemperatur von Zebrafisch exprimiert und Zebrafisch Infektion mit Shigella ist streng abhängig von seinem Typ III-Sekretionssystem (T3SS) 19, eine wesentliche Determinante der Virulenz in der menschlichen Krankheit. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass der Zebrafisch-Larve eine wertvolle neue Host für die in vivo-Analyse von Shigella-Infektion. Die optische Zugänglichkeit der Zebrafisch-Larven ermöglicht die Visualisierung von septin Käfighaltung in vivo (4A), eine Leistung, die noch nie zuvor mit Säugerwirt Modelle erreicht wurde. Um Beweise zu ergänzen, dass septin Käfige einschließen Bakterien Autophagie in vivo gezielt, kann man transgenen Zebrafischlarven infizieren, die GFP-Lc3 und beobachten Autophagie Marker Rekrutierung Shigella (4B). Für ultrastrucutral Analyse von Shigella Autophagosomen in vivo, elEctron Mikroskopie verwendet werden, um deutlich die cytosolische Sequestration von Bakterien durch Doppelmembran Vakuolen 19 werden. Autophagie wird als eine Schlüsselkomponente der Zell-autonome Immunität und einem entscheidenden Abwehrmechanismus gegen Bakterien intracytosolic 14-16 angesehen. Autophagie-Funktion in vivo zu charakterisieren, kann p62 Morpholino-behandelten Zebrafisch-Larven eingesetzt werden. Im Unterschied zur Kern Autophagie Maschinen [zB., Die Autophagie 36 verwandte Proteine ​​(ATG) 26], ist p62 nicht essentiell für die Entwicklung von Wirbeltieren und damit 27 Zebrafisch-Larven können in der Regel vor der Infektion zu entwickeln. Auffallend ist, dass p62-verarmten Larven mit S. beimpft flexneri Ergebnis signifikant erhöhte Sterblichkeit und eine erhöhte bakterielle Belastung 19. In Abstimmung mit in-vitro-Arbeiten zeigen, dass septin Kranz ist interdependent mit Autophagosom Bildung 7,8 wird septin Rekrutierung Shigella deutlich in p62-verarmten Larven reduziert ( <strong&gt; 4C). Diese Daten zeigen, daß Zebrafisch Überleben hängt von p62-vermittelten Autophagozytose intrazelluläre bakterielle Infektion zu kontrollieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Die septin Käfig in vitro. (A) HeLa-Zellen wurden mit S. infiziert flexneri 4 h 40 min, fixiert, mit Antikörpern gegen SEPT9 und Phalloidin markiert und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Maßstab wurden 1 um. (B) HeLa-Zellen infiziert mit S. flexneri 4 h 40 min, fixiert, mit Antikörpern gegen p62 und SEPT2 beschriftet und durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Maßstab wurden 1 um. (C) HeLa-Zellen mit GFP-ATG8 / LC3 transfiziert, mit S. infiziert flexneri 4 h 40 min, fixiert, mit Antikörpern gegen SEPT2 von Fluoreszenzlicht km markiert und bebildertMikroskopie. Maßstabsleiste, 1 um. Diese Zahlen wurden von Mostowy et al 7 modifiziert. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Cellular Anforderungen für Shigella -septin Käfig Bildung. (A) HeLa-Zellen wurden mit Kontroll behandelt (CTRL), p62, ATG5, ATG6 oder ATG7 siRNA. Ganz Zelllysaten von siRNA-behandelten Zellen wurden für GAPDH, p62, ATG5, ATG6 oder ATG7 immungeblottet, um die Effizienz von siRNA Erschöpfung (oben) zeigen. siRNA-behandelten Zellen wurden mit S. infiziert flexneri 4 h 40 min, festgelegt, und für die quantitative Mikroskopie markiert. Graphen (unten) stellen den Mittelwert ± SEM% innerhalb von Shigella SEPT2 Käfige aus n ≥3 Experimente pro Behandlung. (B) HeLa-Zellen wurden mit S. infiziert flexneri, mit DMSO behandelt, Cytochalasin D (CytD), Latrunculin B (LATB), Nocodazol (Noco) oder blebbistatin (Bleb) und nach 4 h 40 min wurden fixiert und für die quantitative Mikroskopie bezeichnet. Diagramme stellen den Mittelwert ± SEM der% Shigella innerhalb SEPT2 Käfige aus zwei unabhängigen Experimenten pro Behandlung. Diese Zahlen wurden aus Mostowy et al 7 geändert. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Der Zebrafisch-Modell von Shigella-Infektion. (A) Bilder, um die Orientierung des Zebrafisch-Larve unter dem Stereomikroskop zu veranschaulichen. (Links) Zebrafisch-Larven 72 Stunden nach der Befruchtung wurden seitlich in der Einspritzplatte mit ihrer Rückenseite nach der Injektionsnadel positioniert. (Mitte) Infektion der Blutbahn wurde von inj durchgeführtektierende die Bakterien (rot-Lösung) in die Schwanzvene, hinter der urogenitalen Öffnung. (Rechts) Infektion in den Schwanz Muskel wurde durch Injektion der Bakterien (rote Lösung) über einen Somitengeführt. (B) Überlebenskurven von 72 Stunden nach der Befruchtung Larven mit verschiedenen Dosen von S. spritzt flexneri und bei 28 ° C für 48 Stunden nach der Infektion inkubiert. Die effektive Impfstoff wurde entsprechend niedrig (&lt;10 3 CFU, offene Kreise), mittlere (~ 4 x 10 3 CFU, offene Dreiecke) oder hoch (~ 10 4 CFU, offene Quadrate) eingestuft. Bedeuten% ± SEM (horizontale Balken) von n ≥3 Experimente pro Inokulum Klasse. (C) Aufzählung von lebenden Bakterien in Homogenaten aus einzelnen Larven zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion durch Ausstreichen auf LB gemessen Hinweis, nur Larven mit der Infektion sind in Aufzählung Analyse einbezogen überlebt. Mittelwert ± SEM (horizontale Balken) ebenfalls dargestellt. (D) Verteilung der GFP-Shigella bestimmt durchLive-Bildgebung mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion mit einem niedrigen, mittleren oder hohen Dosis Impfstoff (Schwanz intravenöse Injektionen). Overlay-Transmissionsbild (grau) und GFP-Fluoreszenz (grün) (B) -. (D) Diese Zahlen wurden von Mostowy et al 19 geändert. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Die Zellbiologie der Shigella-Infektion in vivo. (A) Zebrafisch-Larven wurden in den Schwanz Muskel mit GFP-Shigella (niedrige Dosis) für 24 Stunden, fest, mit Antikörpern gegen SEPT7 (rot) und GFP-markierten (grün infiziert ) und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Maßstab wurden 5 um. (B) GFP-Lc3 Zebrafisch-Larven mit mCherry- Shigella (mittlere Dosis) für infiziert4 h fixiert, mit Antikörpern markiert gegen mCherry (rot) und GFP (grün) und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Oder p62 (rechtes Bild) wurden mit GFP-Morpholinos Shigella 4 Stunden (mittlere Dosis) infiziert, fixiert, mit Antikörpern gegen SEPT7 (beschriftet. Entweder mit Steuer (linkes Bild CTRL) Maßstab, 1,5 um (C) Zebrafisch-Larven behandelt rot) und GFP (grün) und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Pfeile markieren einige Beispiele von Shigella in septin Käfige (CTRL) oder nicht eingeschlossen (p62 abgereichertem) ein 4 Stunden nach der Infektion. Maßstabsleiste, 5 um. Diese Zahlen wurden von Mostowy et al 19 geändert.

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Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Um Krankheitserreger Verbreitung entgegenzuwirken, Wirtszellen neu zu organisieren, um Bakterien ihre Zellskelett compartmentalize und induzieren Autophagie. Verwendung Shigella Infektion von Gewebekulturzellen, Wirt und Pathogen Determinanten dieses Verfahren zugrunde liegen, werden identifiziert und charakterisiert. Mit Zebrafisch-Modelle von Shigella-Infektion, sind die Rolle der entdeckten Moleküle und Mechanismen in vivo untersucht.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

15.7K Aufrufe.  Imperial College London.  Um Krankheitserreger Verbreitung entgegenzuwirken, Wirtszellen neu zu organisieren, um Bakterien ihre Zellskelett compartmentalize und induzieren Autophagie. Verwendung Shigella Infektion von Gewebekulturzellen, Wirt und Pathogen Determinanten dieses Verfahren zugrunde liegen, werden identifiziert und charakterisiert. Mit Zebrafisch-Modelle von Shigella-Infektion, sind die Rolle der entdeckten Moleküle und Mechanismen in vivo untersucht. 

Serie: Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...