Die Einrichtung von Transfektionsprotokollen für Eimeria-Arten würde dazu beitragen, die Erforschung der Genfunktionen voranzutreiben, neue Impfstoffe zu entwickeln und neue Wirkstoffziele für Eimeria zu screening. Mit dieser Technik erreichten wir die Transfektion mehrerer Eimeria-Arten, und die Nukleofektion ist ein nützliches Werkzeug, um die Anwendung genetischer Manipulation bei eimerischen Parasiten zu erleichtern. Die Nukleofektion von Eimeria bietet eine Referenz für die Transfektion anderer Parasiten, die nicht in vitro kultiviert werden können und die Untersuchung ihrer genetischen Manipulation beschleunigen wird.
Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, sollten Sie alle Reagenzien und ihre Instrumente vor Beginn der Transfektion gut vorbereiten, um Rührung während des Experiments zu vermeiden. Die Realisierung dieser Methode hilft Menschen, die sich auf die Transfektion von Eimeria konzentrieren, die komplizierten Details dieses Experiments zu sehen. Um mit der Freisetzung von Sporozysten zu beginnen, Zentrifufuge ein mal 10 zu den sieben sporulierten Oozysten in Kaliumdichromat-Lösung bei 2, 300 mal g für fünf Minuten.
Waschen Sie sie mit PBS dreimal. Das Pellet mit einem Milliliter PBS aussetzen und das Gemisch in ein 15-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Glasperlen mit einem Millimeterdurchmesser hinzu und oszillieren Sie die Oozystensuspension mit einem Wirbelmischer, um die Sporozysten freizusetzen.
Überwachen Sie jede Minute die Freisetzung von Sporozysten durch Mikroskopie. Wenn mehr als 90% der Oozysten gebrochen sind, stoppen Sie das Wirbeln. Übertragen Sie die Sporozystensuspension auf neue 1,5-Milliliter-Röhren und Zentrifugen bei 1,600-fachen g für fünf Minuten.
Setzen Sie den Niederschlag mit einem Milliliter 50%Dichte Gradientenlösung und Zentrifuge bei 10.000 mal g für eine Minute aus. Um Sporozoiten freizusetzen, setzen Sie den Niederschlag mit Excystationspuffer wieder auf und in einem 42-Grad-Celsius-Wasserbad für 40 bis 60 Minuten inkubieren, um die Sporozoiten freizusetzen. Schütteln Sie die Rohre einmal alle fünf Minuten während der Excystation.
Wenn mehr als 90% der Sporozoiten freigesetzt werden, hören Sie auf zu brüten. Zentrifuge bei 600 mal g für 10 Minuten. Setzen Sie den Niederschlag mit einem Milliliter 55%Dichte Gradientenlösung aus, und zentrifugieren Sie das Rohr mit 10 000 mal g für eine Minute.
Setzen Sie den Niederschlag mit einem Milliliter PBS aus, und zählen Sie die Sporozoiten mit einem Hämozytometer. Um die Merozoiten der zweiten Generation von Eimeria necatrix zu sammeln, schneiden Sie den Hühnerdarm längs vom Eigelbstiel in die ileocecal-Öffnung und waschen Sie ihn mit PBS oder HBSS dreimal in einer Petrischale. Den Darm in Stücke schneiden und in einen konischen Kolben mit einem Verdauungspuffer legen.
Legen Sie den Kolben auf einen Magnetmischer bei 37 Grad Celsius mit einem Rührbalken für 30 bis 60 Minuten, um Merozoite freizusetzen. Überwachen Sie nach 30 Minuten Inkubation alle fünf Minuten die Freisetzung von Merozoiten durch mikroskopische Untersuchung. Um die Merozoite zu reinigen, gießen Sie die Suspension mit verdauten Merozoiten über vier Schichten Gaze, um in 50-Milliliter-Röhren zu filtern, und zentrifugieren Sie die Rohre bei 600 mal g für 10 Minuten.
Nach der Zentrifugation den Überstand, der Darmablagerungen enthält, entsorgen. Übertragen Sie den Niederschlag mit gereinigten Merozoiten auf 1,5-Milliliter-Röhren. Setzen Sie den Niederschlag mit einem Milliliter PBS aus, und zählen Sie die Merozoiten mit einem Hämozytometer.
Zunächst zentrifugieren Sie die Sporozoit- oder Merozoitsuspension bei 600 mal g für 10 Minuten. Dann entsorgen Sie den Überstand. In der folgenden Reihenfolge fügen Sie 85 Mikroliter Kerntransfektionspuffer, 10 Mikrogramm Plasmid und 25 Einheiten Restriktionsenzym in die 1,5-Milliliter-Röhre mit Sporozoiten oder Merozoiten ein.
Übertragen Sie die Suspension auf einen nuklearen Transfektionsbecher. Den Becher in eine nukleare Transfernut legen. Schalten Sie das Nahltionsgerät mit dem Netzschalter ein, und wählen Sie das Transfektionsverfahren U-033 aus.
Wenn das Programm abgeschlossen ist, drücken Sie die X-Taste des Nukleofektionsgeräts, und der Bildschirm zeigt OK an, was darauf hinweist, dass die Nukleofektion erfolgreich ist. Fügen Sie 0,5 bis ein Milliliter Dulbeccos Modified Eagle es Medium in den Nukleofection-Becher, um die Reaktion zu stoppen. Nach dem sanften Mischen die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Rohr geben.
Impfen Sie die Nukleofekten Parasiten zu sieben Tage alten Hühnern. Impfen Sie die Merozoiten von Eimeria necatrix oder die Sporozoiten von Eimeria tenella über den kloaken Weg, aber impfen Sie Eimeria acervulina sporozoites durch intravenöse Injektion. Nach dem Sammeln von Oozysten aus Kot, verwenden Sie Fluorescein-aktivierte Zellsortierung und 150 Milligramm pro Kilogramm Pyrimethamin, um das transgene Populationsverhältnis zu erhöhen.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um eimerian Parasiten zu transfekten. In dieser Studie werden hier die Meronts und Merozoiten der zweiten Generation von Eimeria necatrix sowie die Sporozysten und Sporozoiten von Eimeria tenella nach Verwendung der Dichtegradientenlösungen gezeigt. Die Bilder der Oozysten von Eimeria necatrix nach der Infektin mit den nukleofekten Merozoiten und den Oozysten von Eimeria tenella nach der Infektiierung mit Nukleofekten sporozoiten deuten auf eine erfolgreiche Nukleektion hin.
Das Wichtigste beim Versuch dieses Verfahrens ist, sicherzustellen, dass die Reinigung von Sporozoiten und Merozoiten erfolgreich ist und die 50%dichte Gradientenlösung zu verwenden, um das OS2 zu entfernen, während sichergestellt wird, dass die Sporozysten und die Sporozoiten gereinigt werden. Nach diesem Verfahren können Sie dieses Protokoll optimieren, wie z. B. die Transfizierung von Oozysten oder Sporozysten, um die Transfektionsverfahren von Eimeria-Parasiten in Zukunft zu vereinfachen. Mit der Entwicklung der Transfektion in Eimeria wird die CRISPR-Cas9-Technologie in Eimeria die vorsichtige genetische Manipulation von Eimeria deutlich vorbringen und als geeignetes Impfstoff-Lieferfahrzeug eingesetzt werden können.
