Dieses Protokoll ist bedeutsam für die Produktion von Gedächtnisepithelorganoiden, die ohne Passage erzeugt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Organoide nach enzymatischer Verdauung aus Brust- und Gedächtnisgewebe von Mensch und Maus isoliert werden können. Wir führen eine Reihe von differentiellen Zentrifugationsschritten durch, die Epithelorganoide isolieren, ohne Zellen passieren zu müssen.
Eine Person, die diese Technik durchführt, kann auf Herausforderungen stoßen, wenn sie die Gewebe in Kollagen oder Matrix einbettet und sie in einer 96-Well-Platte plattiert. Darüber hinaus ist die Verwendung von richtig polymerisiertem Kollagen und die Beschichtung stabiler Kuppeln der Schlüssel zur Invasion. Sammeln Sie zunächst das Brustgewebe einer euthanasierten Maus, indem Sie die Gliedmaßen der Maus spreizen und die Maus mit vier 19-Gauge-Nadeln an den Pfoten an ein Brett heften, das mit einem saugfähigen Pad bedeckt ist, wobei die ventrale Seite nach oben zeigt.
Sprühen Sie mit 70% Ethanol ein, um das Fell zu glätten und die Haut zu desinfizieren, und wischen Sie den Kot mit einem Mullkissen oder Taschentuch ab. Beginnen Sie direkt über der anogenitalen Region und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere von der Mittellinie nach oben und achten Sie darauf, das Peritoneum nicht zu durchbohren. Wenn Sie das Kinn erreichen, machen Sie seitliche Schnitte an beiden Schlüsselbeinen und an den Hinterbeinen und stecken Sie die Haut der Maus straff an das Brett, um Brustfettpolster freizulegen.
Nachdem Sie die Leisten- und Brustfettpolster bei Wildtyp-Mäusen lokalisiert haben, verwenden Sie eine Pinzette, um das Brustfettpolster anzuheben. Erstellen Sie mit dem stumpfen Ende einer scharfen, stumpfen Schere eine Tasche unter dem Brustfettpolster von der Haut weg und schneiden Sie das Brustfettpolster in einem vollständigen Stück ab. Sobald die Brustfettpolster entfernt wurden, spülen Sie sie in PBS aus, bevor Sie sie in eine sterile Gewebekulturschale geben, und geben Sie sie dann schnell in eine Gewebekulturhaube.
Zerkleinern Sie die Brusttumoren mit einem Skalpell Nummer 10 oder Nummer 11, um das Gewebe zu lockern, bis es eine pastöse Konsistenz erreicht. Das zerkleinerte Gewebe wird mit einem Skalpell in ein konisches Röhrchen mit 10 bis 30 Millilitern Kollagenaselösung überführt. Um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe gesammelt wird, pipettieren Sie einen Milliliter Kollagenaselösung auf die Gewebekulturplatte und zurück in das konische Röhrchen.
Legen Sie das konische Röhrchen in einen Tisch-Schüttelinkubator, bis das Gewebe fadenförmig wird und die Kollagenaselösung trüb wird. 50 Milliliter Lösung für fünf bis 10 Minuten bei 1.500 U / min herunterschleudern. Saugen Sie den Überstand ab und fügen Sie 12 Milliliter des Basalmediums hinzu und mischen Sie, indem Sie drei- bis viermal auf und ab pipettieren oder das Handgelenk vorsichtig drehen, während Sie das Röhrchen 15 Mal halten.
Drehen Sie erneut den Überstand ab, fügen Sie Basalmedium hinzu und mischen Sie durch Pipettieren oder Röhrchenrotation, wie zuvor gezeigt. Sobald sich die schwersten Gewebefragmente am Boden abgesetzt haben, sammeln Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette und geben Sie ihn in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie nach jeder Zentrifugation sicher, dass das Pellet zunehmend undurchsichtig wird.
Aliquot geeignete Suspension von Organoiden in Mikrozentrifugenröhrchen entsprechend der Organoiddichte im Verhältnis zur Menge an BECM pro Well. Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen 10 Minuten lang bei 300 G bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand aus den Röhrchen. Bewegen Sie die Röhrchen mit Organoidpellets auf Eis und geben Sie das entsprechende Volumen BECM in jedes Mikrozentrifugenröhrchen.
Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Organoide in BECM zu resuspendieren, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Pipettieren Sie die BECM-Schwebeorganoide langsam und vorsichtig auf die Beschichtungsoberfläche und füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit PBS, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Legen Sie die Platte für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, damit sich BECM verfestigen kann, und bedecken Sie sie dann mit der entsprechenden Medienmenge.
Um die Kollagenlösung herzustellen, kombinieren Sie 375 Mikroliter der 10-fachen Konzentration von DMEM, 100 Mikroliter eines normalen Natriumhydroxids und drei Milliliter Rattenschwanz-Kollagen-I-Lösung in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie die Mischung, achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden, und titrieren Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4 mit einer kleinen Menge Natriumhydroxid oder dem 10-fachen der DMEM-Konzentration nach Bedarf. Beschichten Sie den Boden der Vertiefungen mit der minimalen Menge an Kollagen, die erforderlich ist, um den Boden des Vertiefungss vollständig zu bedecken, indem Sie eine kleine Menge Kollagen auftragen und die Platte von einer Seite zur anderen schaukeln, um sie zu beschichten.
Lassen Sie die Kollagenunterlagen 30 Minuten bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius aushärten. Aliquotieren Sie die geeignete Suspension von Organoiden in Mikrozentrifugenröhrchen entsprechend der Organoiddichte im Verhältnis zur Menge an Kollagen pro Vertiefung. Lagern Sie die Kollagenlösung bei vier Grad Celsius und überwachen Sie die Polymerisation, indem Sie alle 10 Minuten unter dem Mikroskop auf Faserbildung prüfen.
Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand aus den Röhrchen. Bewegen Sie die organoiden Pellets auf Eis und geben Sie das entsprechende Volumen Kollagen in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um Organoide in Kollagen zu resuspendieren, und achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden.
Pipettieren Sie die Kollagen-suspendierten Organoide langsam und vorsichtig auf die Beschichtungsoberfläche. Die Immunfluoreszenzbilder von eingebetteten Organoiden entweder in der extrazellulären Matrix des Basals oder im Kollagen wurden erhalten, um die Ähnlichkeiten der Gewebezusammensetzung zwischen den Spezies zu untersuchen. Organoide, die in eine Kollagenmatrix eingebettet sind, können für einen Invasionstest verwendet und analysiert werden, indem die Ausdehnung von Ranken, die sich vom Organoid selbst verzweigen, entweder durch Membran-Tomatenmarkierung oder Phalloidin-Färbung von Aktin verfolgt wird.
Schließlich zeigen Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen von in Paraffin eingebetteten Organoiden, dass Organoide die gleiche Histologie von Brustkrebs beibehalten. Es ist wichtig, BECM und Kollagen beim Pipettieren von gelierten Kuppeln kalt zu halten, um eine vorzeitige Polymerisation zu vermeiden. Darüber hinaus führt eine längere Fixierung der Kuppeln in PFA zu einer gelierten Lösung, wenn eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt wird.
Organoide können auch in In-vitro- und In-vivo-Verfahren wie Arzneimittelscreenings und Mausmodelle von Metastasen verwendet werden. Diese Methoden können Einblicke in die therapeutische Sensitivität von Tumorgewebe, metastatische Eigenschaften und Immuninteraktionen geben.
