Dieses Projekt wurde durch von NIH / NCI Grantnummer R00 CA127357 und der University of Kansas Cancer Center Endowment finanziert.

1. Isolierung und Gewinnung von Spender Kollagen aus C57BL/6J-Mäuse <ol><li> Sacrifice reifen normalen weiblichen C57BL/6J-Mäuse mit zugelassenen IACUC Methoden. </li><li> Ernten Sie die Schwänze und saugen in 70% Ethanol für 45 Minuten, um Gewebe zu sterilisieren. Trocknen Sie die Schwänze mit Seidenpapier, in Alufolie wickeln. Bewahren Sie die Schwänze in -20 ° C bis zum Gebrauch. </li><li> Legen Sie die Schwänze in einer sterilen Umgebung wie einer Sterilbank. Mit einer Schere, spaltete sich die Haut an der Schwanzwurzel und lösen sich von der Rute. Entfernen Sie 0,5 bis 1 cm von beiden Enden des Schwanzes und teilen die restlichen Schwanz in drei oder vier Stücke. Präparieren Sie die Sehnen aus dem Schwanz und trennen Sie die Sehnen in einzelne Fasern mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge. </li><li> Übertragen Sie die Sehnenfasern in einen sterilen Behälter und waschen mit sterilem destilliertem Wasser. Transfer-Sehnen vom Schwanz von 5-7 Mäusen zu einer 50 ml konische Röhrchen mit 35 ml sterilem deionisiertem Wasser mit 50 Einheiten / ml Penicillin Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin und 0,034 N Essigsäure verdünnt aus einer Stammlösung von Eisessig (17 N). Legen Sie auf Wippe bei 4 ° C für eine Woche zu extrahieren das Kollagen. </li><li> Spin down Schutt in einer Tischzentrifuge bei 3000 g für 15 Minuten. Überstand, ca. 30 ml auf zwei Polycarbonat-Röhren für die Beckman 50,2 Ti Rotor und Spin bei 35.000 g (ca. 17000 UpM) angepasst für 1 Stunde. </li><li> Das Volumen des Überstandes müssen gesenkt werden, um eine Konzentration von 1-2 mg / ml zu erreichen. Übertragen Sie den Überstand auf eine Ultracel 50 k Amicon Filtrationseinheit und Spin in einer Tischzentrifuge bei 3000 rpm für 15 bei 4 ° C. Das Filtrat in einen sterilen konischen Rohr und speichern. Wiederholen Sie die Zentrifugation bis das Volumen auf 5-6 ml reduziert wird. </li><li> Lesen Sie die Protein-Konzentration. Wir verwenden eine Standard-Bradford (Biorad) mit BSA-Standards (Biorad) und unverdünnten Proben. Messen Sie eine Probe Ihres Filtrat, als negative Kontrolle. </li><li> Weitere für die Reinheit der Extraktion überprüfen, indem die Lösung eine Probe von gereinigtem Kollagen auf einem 6% SDS-Polyacrylamidgel, 10 Bahnen, 1,5 mm Geldicke. Bereiten 20 ug der Probe in 30 ul 1x SDS-PAGE-Ladepuffer mit 63 mM Tris HCl 10% Glycerin, 2% SDS 0,0025% Bromphenolblau in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Bereiten Sie eine äquivalente Menge an Protein aus Rattenschwanz Kollagen Typ I als positive Kontrolle. Darüber hinaus bereiten eine Reihe von BSA-Standards mit 2,5, 5, 10, 20 ug in PBS und 1X Ladepuffer verdünnt. Kochen Sie die Proben bei 95 ° C für 5 Minuten. </li><li> Lassen Sie die Proben kühl und kurz Mikrofuge (maximale Geschwindigkeit für 10 Sekunden) auf Spin-Down Kondensation. </li><li> Laden Sie die Proben Proben zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker. Legen Sie zum Beispiel 5 ul Kaleidoscope Biorad-Protein-Standard. Elektrophorese bei 150 Volt für etwa 1 Stunde oder bis der Farbstoff vor Erreichen der unteren. </li><li> Entfernen Sie das Gel und Flecken in Coomassie-Blau-Puffer. Bereiten Sie diesen Puffer durch Mischen von 2 g Coomassie-Blau, 75 ml Eisessig, 500 ml Ethanol in einem Gesamtvolumen von 1000 ml mit de-ionisiertem Wasser. Auch bereitet die gleiche Menge an entfärben Puffer mit dem Rezept nur ohne Coomassie-Blau-Reagenz. Decken Sie die Gel mit einem ausreichenden Volumen für Coomassie-Blau und Ort auf einer Wippe. </li><li> Rock sanft für 1 Stunde bei RT und dekantieren Sie den Fleck. Ersetzen Sie die Entfärbung Lösung, wenn es dunkel blau wird. Detain das Gel über Nacht oder bis die einzelnen Bands sind auf dem Gel gelöst. Suchen Sie zwei Kollagenpfropfen Bands (Molekulargewichte = 90 kDa und 130 kDa) und beachten Sie die Stärke der Banden gegen die Normen und Kontrollen. Bild des Gels mit einem Gel-doc-System, falls erforderlich. </li></ol> 2. Isolierung und Kultivierung von Spender Mammakarzinom-Zellen und Fibroblasten, die aus normalen und PyVmT C57BL/6J-Mäuse <ol><li> Sacrifice Alter abgestimmt weiblichen normal oder PyVmT transgenen Mäusen nach 10 Wochen alt sind, wenn die Tumore deutlich und greifbar in PyVmT transgenen Mäusen mit zugelassenen IACUC Methoden sind. </li><li> Setzen Sie die Maus auf dem Rücken auf einer flachen Oberfläche und Immobilisierung der Gliedmaßen mit Klebeband Kleber. </li><li> Machen Sie ein umgedrehtes T Einschnitt zwischen den Brustwarzen der Brust-und Leistengegend Brustdrüse und ziehen Sie den Hautlappen zurück in die Milchdrüsen aussetzen. Entfernen Sie die Brust Gewebe und Hackfleisch in kleine Stücke mit chirurgischer Schere. </li><li> Es werden 100 ml einer enzymatischen Verdauung Cocktail enthält: 200 mg Trypsin, 500 mg Kollagenase, 4 mg DNAse, 100.000 Einheiten Hyaluronidase in sterile PBS und Antibiotika über Nacht auf Eis und anschließend für 3 h bei 37 ° C. </li><li> 10 ml PBS mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) zu jeder Probe und Zentrifuge Zellpellet in einer Tischzentrifuge bei 1500 rpm für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Vorsichtig absaugen Überstand und Zellpellet in 5-7 ml PBS/10% FBS. Wiederholen Sie den Spin und waschen zwei weitere Male. </li><li> Zellpellet in 10 ml DMEM mit 10% FBS mit 50 Einheiten / ml Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin auf 10 cm Schalen mit Kollagen Typ I. Zur Beschichtung Platten mit Kollagen beschichtet, verdünnt das Kollagen 1 ml (mit Lager 1,5 mg / ml) in 39 ml 0,02 N Essigsäure in sterilem destilliertem Wasser oder PBS verdünnt. Pipettieren Sie 5 ml Kollagen funktionierende Lösung auf 10 cm-Platten. Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 10 Minuten lang. Absaugen überschüssige Kollagen. Parafilm ungenutzte Platten und lagern bei 4 ° C für eine Woche. </li><li> Ändern Sie die Medien von 2 bis 3 Mal pro Woche. Erfolgreiche Verdauung von Geweben wird durch das Vorhandensein von epithelialen Herden von spindelförmigen Fibroblasten Zellen umgeben charakterisiert werden. </li><li> Trennen Sie die Fibroblasten und Epithelzellen durch selektive tryspinization. Saugen Sie das Medium und die Zellen mit PBS einmal. Pipettieren von 1 ml 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA auf Zellen und bei Raumtemperatur inkubieren. Fibroblasten sind eher lose anhaftenden als Epithelzellen. Prüfen Sie, ob Fibroblasten Ablösung unter dem Mikroskop nach 2 Minuten; Zellen sollten in Suspension schwimmende oder aufgerundet, während epithelialen Herden sollte noch an der Oberfläche einzuhalten. </li><li> Leicht auf den Teller, die Fibroblasten und sanft Pipette 10 ml serum-haltigem Medium in der Schale lösen, die Fibroblasten zu entfernen. </li><li> Pipettieren Sie die Medien mit Fibroblasten in einer 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge, wie in Schritt 5 beschrieben). Replate diese Zellen auf Kollagen beschichtet 10 cm Geschirr und wiederholen Sie den Vorgang, bis selektive Trypsinierung Fibroblasten und Epithelzellen völlig getrennt sind. </li><li> Überprüfen Sie für die Zell-Reinheit von Immunfluoreszenzfärbung für epitheliale Marker wie CK14 und CK18 und Fibroblasten Marker wie alpha smooth muscle actin (α-SMA). </li></ol> 3. Immunfluoreszenzfärbung von kultivierten Zellen <ol><li> Legen Sie Deckgläschen in 6 cm Schalen. Sterilisieren durch UV-Bestrahlung für 5 bis 10 Minuten in einer Sterilbank. </li><li> Coat das Deckglas mit 1-2 ml der Arbeitszeit Lager Kollagen-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Absaugen über. </li><li> Trypsinize und Platte 200.000 Epithelzellen oder Fibroblasten pro Probe. Fügen Sie 3-5 ml der komplette Medien-und inkubieren für 24 Stunden. </li><li> Saugen Sie die Medien, waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren in eiskaltem Methanol bei -20 ° C für 7 Minuten. </li><li> Wash-Zellen mit PBS zweimal, um Ethanol und Block mit 1-2 ml PBS mit 1% FBS für 1 Stunde bei RT zu entfernen. </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die Deckgläser und in einem großen flachen Behälter mit Parafilm oder andere hydrophobe Oberfläche bedeckt. </li><li> Verdünnen Sie die folgenden primären Antikörper 1:100 in Blocking-Lösung: anti-smooth muscle actin (α-SMA, Anti-CK14 (Epithelgrundfläche Marker), anti-CK18 (Luminalepithelkompartiment Marker). </li><li> Je 100 ul von Antikörpern direkt auf die Deckgläschen für 1 Stunde bei RT. Inkubieren einer separaten Deckglas von Zellen in Blocking-Lösung; diese Probe wird als sekundärer Antikörper Kontrolle dienen. </li><li> Absaugen Antikörper und Pipette 1 ml PBS direkt auf dem Deckglas zu waschen. Absaugen und wiederholen Sie 3-5 mal. </li><li> Verdünnen Sie die folgenden Sekundärantikörper in Blocking-Lösung: Anti-Maus-Alexa 488 bei 1:100, anti-Maus bei 1 biotinylierten: 500,-Anti-Maus-Alexa-568. </li><li> Wickeln Sie den Behälter mit dem Deckgläschen in Alufolie. Je 100 ul der entsprechenden Sekundär-Antikörper direkt auf den Deckgläschen: α-sma mit Anti-Maus-Alexa 568, CK 14 Färbung mit Anti-Maus-biotinylierten und CK18 mit Anti-Maus-Alexa 488. Umschlag der Container, die Proben von sichtbarem Licht zu schützen. </li><li> Absaugen Antikörper und waschen mit PBS, wie in Schritt 9). Lassen Sie die Proben in PBS, mit Ausnahme von CK14 Färbung. </li><li> Verdünnen Streptavidin konjugiert mit Alexa 568 1:500 in PBS. Inkubieren Sie die CK14 gefärbten Proben mit strepatividin-Alexa 568 für 30 Minuten bei RT im Dunkeln. Wash in PBS, wie in Schritt 9) </li><li> Verdünnen Sie DAPI 1: 500 in PBS. Saugen Sie das PBS aus den Proben und Inkubation mit DAPI für 10 Minuten RT im Dunkeln. </li><li> Spülen Proben mit PBS. Je 100 ul der Prolong anti-fade Reagenz auf Glas-Objektträger, schalten Sie das Deckglas über, so dass die Zellen sind mit Blick auf den Glasträger. Kippen Sie das Deckglas zu einem Winkel vorsichtig Kontakt mit den Montage-Medien. </li><li> Bild der Proben mit einem Immunfluoreszenz-Mikroskop. Halten Sie die Proben im Dunkeln auf die Immunfluoreszenz-Signal, das dauert ca. 2 Wochen schützt. </li></ol> 4. Herstellung von Kollagen eingebetteten Zellen für die Transplantation <ol><li> Zum Einbetten von Zellen in Kollagen, ist es notwendig, den pH-Wert des Kollagens niedriger, um die Polymerisation durch Mischen des Kollagens mit einer Einstellung Lösung zu erreichen. Bereiten Sie die Einstellung Lösung durch Mischen von 100 ml 10X Earl Balanced Salt Solution (EBSS) mit 2,45 g NaHCO3, 7,5 ml 1 M NaOH und 42,5 ml sterilem destilliertem Wasser. Weitere sterilisieren mit einer Flasche top 0,22 Mikron-Filter-Einheit an eine sterile Flasche. </li> &lt;li&gt; Mix das Kollagen (stock Konzentration 1 mg / ml) mit der Einstellung Lösung bei einem Ausgangs-4: 1-Verhältnis. Für eine Transplantat-Mix 100 ul von Kollagen mit 25 ul Einstellung Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen. Vortex kurz oder Pipette die Probe nach oben und unten, um die Probe gründlich zu mischen. </li><li> Add Kollagen oder Einstellung Lösung bei 5-10 ul-Schritten und gründlich mischen, bis das Phenol roten Farbstoff in das Gemisch Änderungen an einem leicht rosa bis orange Farbe, was auf einen neutralen pH-Wert. Eine gelbe Farbe zeigt sauren pH-Wert während dunkelrosa spiegelt basischen pH-Wert. Halten Sie die Mischung auf Eis, um die Polymerisation zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie die Fibroblasten und Epithelzellen von der Platte durch Trypsinierung. Zuerst saugen die Medien-und abwaschen mit 5 ml PBS. Pipettieren von 1 ml 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA in HBSS pro Platte. Inkubieren Fibroblasten bei RT für 2-5 Minuten. Inkubieren Epithelzellen bei 37 ° C für 2-6 Minuten. Tippen Sie auf die Platten vorsichtig, um die Zellen zu lösen. Überprüfen Sie für die Ablösung mit einem microscope.Quench das Trypsin durch Pipettieren 9 ml Vollmedium auf der Platte und den Transfer der Zellen in ein steriles 15 ml konischen Rohr. </li><li> Nehmen Sie 50 ul und zählen Sie die Zellen durch Zählkammer. Beachten Sie das Gesamtvolumen der Zellen in jeder Röhre (ca. 10 ml). </li><li> Pellet die Zellen bei 1500 rpm für 5 min bei RT. Saugen Sie das Zellpellet und Zellen bis zu einer Konzentration von 100.000 Zellen/100 ul. Zum Beispiel, resuspendieren 500.000 Zellen in einem Gesamtvolumen von 500 ul komplette Medien. </li><li> Mix 250.000 Stromazellen (250 ul) und 100.000 Tumorzellen (100 ul) in ein separates Röhrchen. Microfuge 10 Sek. 1000 rpm, Überstand entfernen durch Pipettieren. Dann werden 50 ul der eingestellten Kollagenlösung zu den Zellen. Pipet rauf und runter, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Pipettieren von 50 ul in einem sterilen 6 cm Gewebekulturplatte bilden eine kreisförmige Tropfen. Inkubieren des Transplantats bei 37 ° C für 10 Minuten zur Polymerisation. </li><li> Vorsichtig mit 5 ml komplette Medien in der Platte durch Kippen der Platte in einem Winkel und langsam Pipettieren die Medien von einer Seite der Platte. Neigen Sie den Teller herum, bis die Medien über das Transplantat. </li><li> Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37 ° C. Transplant sofort. </li></ol> 5. Orthoptische Transplantation von Kollagen eingebetteten Zellen in C57BL/6J-Mäuse <ol><li> Fertigen Sie ein dünner Glasstab für die Transplantation. Hitze ein Glas Pasteur-Pipette mit einem Bunsenbrenner. Mit einer Pinzette, strecken das Ende der Pipette heraus auf 2-3 mm Dicke. Abkühlen lassen, und sterilisieren von 70% Ethanol. </li><li> Sterilisieren Sie die folgenden chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren und 70% Ethanol: feine chirurgische Schere, stumpf chirurgische Scheren, Pinzetten stumpf, dünne Pinzette, Wund-Clips, Wunde Grundnahrungsmittel </li><li> Anesthetize Maus mit mit 2-3% Isofluran mit einem Isofluran Aufräumen Maschine. Die durchschnittliche O 2 Durchfluss verwendet wird 1 L / min durch die Nase Kegel. </li><li> Legen Sie die Maus auf den Rücken und unbeweglich die Gliedmaßen mit Klebestreifen oder sonstigem Kleber. Entfernen Sie die Haare mit chemischen Haarentferner wie Nair. Sterilisieren der Bauch mit Baumwolle swabbing alternativ zwischen 70% Ethanol und betadine in einem Ziel-artig. </li><li> Halten Sie ein Teil der Haut durch die Brustdrüse mit einer stumpfen Zange mit einer Hand. Mit der anderen Hand, um mit stumpfen chirurgische Scheren eines umgedrehten T-Einschnitt zwischen den # 9 und # 10 Brustwarzen oder # 4 und # 5 Brustwarzen der Leistengegend Milchdrüsen zu machen, um die Milchdrüsen aussetzen. </li><li> Machen Sie eine Tasche Schnitt unter den Lymphknoten oder mammaria mit kleinen chirurgischen Frühjahr Schere. </li><li> Entfernen Sie die Kollagen-Transplantat aus dem Gewebe Kulturschale mit einer Pinzette. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Kollagen Transplantats durch vorsichtiges Tupfen auf einem sterilen Tuch und schieben Sie die Kollagen-Transplantat vollständig in die Tasche mit einem dünnen Glasstab. </li><li> Suture die Hautlappen mit # 2 gut resorbierbare Fäden oder Wunde Heftklammern. </li><li> Lassen Sie die Maus in den Käfig zu erholen. </li><li> Überwachen Sie die Mäuse zweimal wöchentlich auf ein Minimum, Abtasten von Tumoren. Sacrifice die Mäuse, wenn die Tumore 1 cm im Durchmesser erreichen. Ernte Gewebe für die Analyse. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Isolierung und Extraktion von Kollagen aus C57BL/6J-Mäuse Diese Verfahren wurden von 1 angepasst. Extraktion von Kollagen-Protein 5 bis 7 Mäuseschwänzen ergibt ca. 1-1,5 mg / ml in einem 6 ml Endvolumen oder 6 bis 9 mg Protein. Durch coommassie Flecken, Streifen entsprechend 90 kDa und 130 kDa sind in den Gassen mit Mustern aus Mäuseschwänzen extrahiert geladen erkannt, was die Anwesenheit von Kollagen Typ I und Pro-Kollagen (Abbildung 1). Isolierung und Kultivierung von Mammakarzinom-Zellen und Fibroblasten, die aus normalen und PyVmT C57BL/6J-Mäuse. Die Verfahren wurden aus 2 angepasst. PyVmT Karzinom-Zellen und Fibroblasten können durch Unterschiede in der Morphologie der Zellen und die Expression von bestimmten epithelialen und mesenchymalen mar unterschieden werdenKERS. PyVmT Karzinom-Zellen werden durch Kopfsteinpflaster Form und co-express CK18, ein Luminalepithelkompartiment Marker und CK14, eine basale epitheliale Marker, aber nicht ausdrücken, α-sma (Abbildung 2) identifiziert. Mammary Fibroblasten sind größere Zellen mit einem spindelförmigen Phänotyp und exprimieren große Mengen von α-sma aber nicht ausdrücken CK14 oder CK 18 (Abbildung 2). Diese Daten zeigen mehr als 95% Reinheit der Zellen für Fibroblasten und Epithelzellen mit dem beschriebenen Verfahren. Orthoptische Transplantation von Kollagen eingebetteten Zellen in C57BL/6J-Mäuse Diese Verfahren wurden von 3, 4 angepasst. Transplantation Empfänger Mäuse werden getötet, wenn die Tumore in beiden experimentellen Gruppe 1,0 cm im Durchmesser, oder etwa 60 Tagen zu erreichen. Während die Transplantation von Zellen allein PyVmT Ergebnisse in tastbaren Tumoren nach 30 bis 40 Tagen erreicht eine mittlere Tumormasse von 0,335 Gramm auf 60 Tage, was darauf hinweist Ko-Transplantation von PyVmT Karzinomzellen mit Mamma-Fibroblasten führt zu einer mittleren Tumormasse von 0,630 Gramm, Weiterentwicklung des Tumorwachstums von Fibroblasten (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Coomassie-Färbung Analyse von Kollagen Typ I-Extraktion aus Mäuseschwänzen. BSA (~ 66 kDa) ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Gewerbliche Rattenschwanz Collagen (20 ug Protein) und gereinigtes Maus Schwanz Kollagen (20 ug Protein) sind durch den Kasten (~ 130 kDa, ~ 90 kDa Proteine) angegeben. Std = Molekulargewicht Standard. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Immunfluoreszenzfärbung von Spender PyVmT Mammakarzinom-Zellen und Fibroblasten. Panels a und b PyVmT Mammakarzinomzellen immungefärbt auf Antikörper gegen CK14 und CK18. Panel-c stellt Fibroblasten mit Antikörpern gegen α-sma gefärbt. Bilder mit DAPI-Overlay bei 20-facher Vergrößerung dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Mammatumor Entwicklung in C57BL/6J-Mäuse in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Fibroblasten. Brusttumore wurden von Mäusen mit PyVmT Karzinom-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von Mamma-Fibroblasten transplantiert geerntet und gewogen. Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts. N = 6 pro Gruppe.

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transplantability+of+tumor-associated+stromal+cells.">Differential transplantability of tumor-associated stromal cells.</a> Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).</li></ol>

Tierversuche: Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die IACUC Ausschuss an der University of Kansas Medical Center eingerichtet durchgeführt.

Die funktionalen Beitrag von Fibroblasten in der Tumorprogression ist durch die Transplantation Modellen nachgewiesen, in denen Karzinome assoziiert Fibroblasten mit gutartigen Brustepithelzellen führt zu einem erhöhten Tumorwachstum und Invasivität 5 Co-transplantiert. Herkömmliche Ansätze der Transplantation haben die Verwendung von SCID oder Nacktmäusen, die Zusammenarbeit der Transplantation stromalen und epithelialen Zellen aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen Maus oder verschiedene Art...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> C57BL/6N Mäusen </td><td> Harlan </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> MMTV-PyVmT transgenen Mäusen </td><td> Jackson Laboratorien </td><td> 002374 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Fischer </td><td> SH3039603PR </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> VWR </td><td> 10000113873 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Fischer </td><td> MT-30 bis 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin </td><td> Fischer </td><td> BP2645-20 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Filtrationssäulen Ultracel 50k </td><td> Millipore </td><td> UFC905008 </td><td></td></tr><tr><td> Rohre für Beckman TI Rotor </td><td> Beckman </td><td> 355618 </td><td></td></tr><tr><td> Rattenschwanz Collagen </td><td> Fischer </td><td> CB 40236 </td><td></td></tr><tr><td> 10x EBSS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7510-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin 1X, 0,25% in HBSS w / o Calcium und Magnesium </td><td> Fischer </td><td> MT-25 bis 050-CI </td><td></td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> Fischer </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Coomasie blau </td><td> Fischer </td><td> BP101 25 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T3924-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> Sigma AldrichC0130-50 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hyalronidase </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3884 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Kaleidoscope Protein Standard </td><td> Biorad </td><td> 1610375 </td><td></td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Fischer </td><td> 12545-78 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 101400-042 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentin Antikörper S-20 </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-7558 </td><td></td></tr><tr><td> α-smooth muscle actin Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab5694 </td><td></td></tr><tr><td> CK14-Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> sc-53253 </td><td></td></tr><tr><td> CK18-Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab668 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-biotinylierten </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA9200 </td><td> Distributed durch Fisher </td></tr><tr><td> Anti-Maus-Alexa-568 </td><td> Invitrogen </td><td> A10037 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-Alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-Alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11226 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td><td></td></tr><tr><td> Verlängern Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P-36930 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 91400-12 </td><td></td></tr><tr><td> Feine Feder Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Blunt Zange </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11002-12 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 feinen Pinzette </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Gut Chromsäure Naht </td><td> Fischer </td><td> NC9326254 </td><td></td></tr><tr><td> Glas Pasteur-Pipette </td><td> Fischer </td><td> 22-042-815 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Fischer </td><td> A406P 4 </td><td></td></tr><tr><td> betadine </td><td> Fischer </td><td> NC9386574 </td><td></td></tr><tr><td> Wound-Clips </td><td> Fischer </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Wound Grundnahrungsmittel </td><td> Fischer </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr></tbody></table>

mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in c57bl/6j mice

Der Einfluss der Stroma-Zellen, einschließlich Fibroblasten auf Mamma-Tumorprogression wurde auch durch den Einsatz von Maus-Modellen dokumentiert, insbesondere durch die Transplantation von Stromazellen und Epithelzellen in der Brustdrüse von Mäusen. Aktuelle Transplantation Modelle oft mit dem Einsatz von immungeschwächten Mäusen aufgrund der unterschiedlichen genetischen Hintergründen von Stromazellen und Epithelzellen. Extrazelluläre Matrices werden oft verwendet, um die zwei verschiedenen Zelltypen für die konsequente Zell-Zell-Interaktionen eingebettet, sondern mit dem Einsatz von Matrigel oder Rattenschwanz Collagen, die immunogene Substrate sind. Das Fehlen von funktionellen T-Zellen aus Mäusen Immunsystem verhindert eine genaue Berechnung der Stromazellen auf Mamma Tumorprogression in vivo, mit wichtigen Auswirkungen auf die Entwicklung von Medikamenten und Wirksamkeit. Darüber hinaus sind immungeschwächte Mäuse teuer, schwer zu züchten und bedürfen einer besonderen Pflege Bedingungen. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir einen Ansatz zur orthotop transplantierten Stromazellen und Epithelzellen in Mäuse aus dem gleichen genetischen Hintergrund, um konsistente Tumorbildung induzieren entwickelt. Dieses System beinhaltet die Ernte normal, Karzinom assoziiert Fibroblasten, PyVmT Mammakarzinom-Zellen und Kollagen vom Spender C57BL/6J-Mäuse. Die Zellen werden dann in Kollagen eingebettet und transplantiert in der Leistengegend Milchdrüsen der weiblichen C57BL/6J-Mäuse. Die Transplantation von Zellen allein PyVmT Form tastbaren Tumoren 30-40 Tage nach der Transplantation. Endpoint-Analyse nach 60 Tagen zeigt, dass Ko-Transplantation mit Fibroblasten erhöht Brusttumor Wachstum im Vergleich zu PyVmT Zellen transplantiert allein. Während Zellen und Matrix aus C57BL/6J-Mäuse in diesen Studien verwendet wurden, kann die Isolierung von Zellen und Matrix und Transplantation Ansatz Mäuse aus verschiedenen genetischen Hintergründen demonstriert Vielseitigkeit angewendet werden. Zusammenfassend kann dieses System verwendet, um molekulare Wechselwirkungen zwischen Stromazellen und Epithelzellen zu untersuchen, und überwindet kritische Einschränkungen bei immungeschwächten Mausmodellen.

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

In diesem Bericht zeigen wir ein System zur Isolierung und Kultur Spenderzellen von der Maus Brustdrüse und orthotop Transplantation dieser Zellen in Empfängermäuse zu Stromatumoren analysieren: epitheliale Interaktionen während Mammatumor Entwicklung.

Mammary Transplantation von Stromazellen und Carcinoma Cells in C57BL/6J-Mäuse

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

mammary-transplantation-stromal-cells-carcinoma-cells-c57bl6j

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K Aufrufe.  University of Kansas Medical Center. In diesem Bericht zeigen wir ein System zur Isolierung und Kultur Spenderzellen von der Maus Brustdrüse und orthotop Transplantation dieser Zellen in Empfängermäuse zu Stromatumoren analysieren: epitheliale Interaktionen während Mammatumor Entwicklung.

Serie: Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Forschung

Medizin

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Menschliche Arteria mammaria interna (IMA) Transplantation und Stenting: A Human Model um die Entwicklung von In-Stent Restenose Studie

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies this model by avoiding challenging suture anastomoses of small vessels thereby reducing warm ischemia time. In comparison to abdominal graft implantation the cervical model is less invasive and the implanted graft is easily accessible for further follow-up examinations. Anastomoses are performed by pulling the ascending aorta of the graft over the cuff with the recipient&#8217;s common carotid artery and by pulling the main pulmonary artery over the cuff with the external jugular vein. Selection of appropriate cuff size and complete mobilization of the vessels are important for successful revascularization. Ischemia-reperfusion (I/R) injury can be minimized by perfusing the graft with a cardioplegic solution and by hypothermia. In this article, we provide technical details for a simplified and improved cuff technique, which should allow surgeons with basic microsurgical skills to perform the procedure with a high success rate.

The cuff technique shortens and facilitates the model of heterotopic cervical heart transplantation in mice by avoiding technically challenging suture anastomoses of small vessels. The technical details shown in this video paper should allow researches to establish this model in their laboratories.

Heterotope Cervical Herztransplantation bei Mäusen

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...