Diese Arbeit wurde vom österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) gewähren P18820-B13 gefördert. Ethik-Anweisung: Die Studie wurde genehmigt (PLUS_Ethik_090514) von der Ethikkommission für Versuche am Menschen und / oder Tiere an der Universität Salzburg die Einhaltung der Helsinki Declaraction als im Jahr 1983 überarbeitet und alle teilnehmenden Patienten gaben ihr schriftliches Einverständnis.

1. Herstellung von Wirkstoff-Konjugate <ol><li> Lösen Sie 10 mg DF in 1 ml dH 2 O in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß. In die weitere Vorgehensweise verwenden 95 ul dieser DF-Lösung. Um Konjugat PP zu HSA auflösen 30,4 mg PP-Derivat (304 g / mol) in 500 ul 0,3 M Natronlauge (NaOH). </li><li> Add 430,6 ul dH 2 O und 100 ul 0,5 M 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES)-Puffer pH 6,5 bis 95 mu l aufgelöst DF. Add 33,1 ul dH 2 O und 140 pl 2 M MES-Puffer pH 2,9 bis der PP-Probe. </li><li> Add 57,5 ul einer frisch zubereiteten N-Ethyl-N &#39;- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC)-Stammlösung in dH 2 O mit einer Konzentration von 100 mg / ml, die DF Probe oder 10 ul EDC-Lösung aufgelöst der PP-Probe. Vortex die Proben für 1 Minute. </li><li> Add 16,9 ul der HSA-Lösung mit einer Konzentration von 118 mg / ml zu jeder Probe. </li><li> Inkubieren Sie die Proben für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 300 U / min. </li><li> Dialysieren die DF-und PP-Proben 3 mal gegen 2 l Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 für mehrere Stunden. Führen Sie alle Schritte Dialyse bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten bei 14.000 xg und den Überstand mit DF-oder PP-konjugierten HSA. </li><li> Überprüfen Überstand für Proteine, die von der Durchführung einer SDS-PAGE mit 12% Gele. Legen Sie über 12 ug HSA-Konjugat in einem Gel-Steckplatz. </li></ol> 2. Bestimmen Kopplung von Arzneistoff-Konjugate (Abbildung 2) <ol><li> Für die Analyse der Kopplung von DF und PP-Konjugate von HPSEC mit einem 100 mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 6,5, enthaltend 150 mM NaCl und 0,05% Natriumazid. Verwenden Sie einen 7,8 x 300 mm TSK-Gel-G2000 SWXL Spalte. </li><li> Führen Erfassung von Signalen unter Verwendung eines Online-gekoppelten RI-und UV-Detektor-System. </li><li> Bereiten Sie eine HSA-Standard-Probe mit einer Konzentration von 1 mg / ml in dH 2 O. Für Detektorkalibrierung Injektion von 50 ul HSA-Standard-Lösung. </li><li> Berechnen Sie die RI k RI und UV k UV für den Detektor. Verwenden Sie die Formeln Bereich RI = k RI * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] und Fläche UV = k UV * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] mit (dn / dc) HSA = 0,185 und (dA / dc) HSA = 0,518 5. </li><li> Bereiten DF-und PP-Derivat Standards für HPSEC, dass 5, 10 und 30 nmol Mengen beider Standards problemlos injiziert werden kann. </li><li> Berechnen Sie die Mittelwerte für (dn / dc) Drogen-und (dA / dc) Medikament für beide Standards. Für DF, a (dn / dc) von 0,235 ± 0,010 und eine (dA / dc) von 39,000 ± 0,493 ermittelt wurde. Für PP, a (dn / dc) von 0,328 ± 0,016 und eine (dA / dc) von 53,155 ± 2,464 ermittelt wurde. </li><li> Inject Arzneistoff-Konjugate auf HPSEC und bestimmen ihre RI-und UV-Peakflächen. </li><li> Berechnen Sie die Konzentration von DF, PP-Derivat, und HSA durch die Lösung der beiden Gleichungen Bereich RI = k RI * [(dn / dc) Medikament * c (drug) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] und Bereich UV = k UV * [(dA / dc) Medikament * c (drug) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] für die Unbekannten. </li></ol> 3. BAT mit Arzneistoff-Konjugate <ol><li> Bereiten sieben Durchflusszytometrie Fläschchen und beschriften Sie sie je nach ihrem Inhalt: ungefärbte Kontrolle, Negativ-Kontrolle, positive Kontrolle und Arzneistoff-Konjugate. </li><li> Je 50 ul der B-CCR-STB Stimulation-Puffer (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) in das Fläschchen für die ungefärbten und negative Kontrolle vorbehalten. Als positive Kontrolle, verwenden 50 ul einer anti-FcεRI Lösung durch die Flow2 CAST-Kit zur Verfügung gestellt. Fügen Sie die entsprechenden Mengen von Konjugat-Lösung, um die Fläschchen für die Arzneimittel-Konjugate durch die Schaffung einer 1:10 Verdünnungsreihe von 0,02 -20 pg / ml DF-Konjugat-und PP-Konjugat (Endkonzentrationen in einem Assay Volumen von 200 ul) vorbehalten. Diese Titration Experimente müssen durchgeführt werden, um die Konzentration der optimalen Basophilenaktivierung für jeden Patienten Probe zu bestimmen. </li><li> 100 l Stimulation-Puffer in jedes Röhrchen und 50 ul Patienten EDTA-Vollblut. Mischen Sie die Proben vorsichtig. </li><li> Je 20 ul Flow2 CAST Färbereagenz mit anti-CCR3 Antikörper mit Phycoerythrin (PE) und anti-CD63 Antikörper mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) in jedes Röhrchen beschriftet und nochmals mischen. Nicht Pipette Färbereagenz in den ungefärbten Probe! </li><li> Inkubieren Sie die Proben für 45 Minuten bei 37 ° C Wasserbad. </li><li> Stop-Reaktion auf Eis für 5 Minuten. </li><li> Lyse Erythrozyten durch Zugabe von 2,0 ml Flow2 CAST Lysereagenz in jedes Fläschchen und vortexen. Inkubieren Proben im Dunkeln für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Centrifuge Proben für 5 Minuten bei 500 xg und sorgfältig dekantieren. </li><li> Die Zellen in 500 ul Flow2 CAST Waschpuffer und speichere sie auf Eis, bis der Durchflusszytometrie. </li><li> Passen Sie das Durchflusszytometer die Spannung sINSTELLUNGEN für Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht (FSC, SSC), während dem Erwerb der ungefärbten Probe. </li><li> Tor der Zellen vorhersagen, wie Lymphozyten aus dem SSC-Plot FSC auf die SSC-PE Grundstück. Basophile sind durch eine PE-markiertem anti-CCR3 Antikörper als CCR3 hallo SSC lo und Tor sie in die FITC-PE Grundstück identifiziert. Die anti-CD63 Antikörper erkennen aktivierten Basophilen ist mit FITC markiert. </li><li> Stellen Sie die cut-off um maximal 2,5% der Basophilen als CD63 hallo in die Negativ-Kontrolle. Eine Probe gilt als positiv, wenn&gt; 5% Basophile CD63 hallo und die mittlere Fluoreszenz (MFI) der Probe durch die MFI der negativen Kontrolle unterteilt übersteigt 2 (Abbildung 3) sind für Basophilenaktivierung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Dieses Experiment wertet BAT als ein nützliches Hilfsmittel, um IgE-abhängige Arzneimittelüberempfindlichkeit erkennen. Protein-Konjugate von NSAR sind für die Aktivierung von Basophilen verwendet. Durch HPSEC mit RI-und UV-Detektion Aggregatzustand, Kopplungsgrad und effektive Rendite der Konjugate ermittelt. Wie Abbildung 4 zeigt, blieb 43,5% der DF-Konjugate monomeren mit einem Kopplungsgrad von 5,0 DF / HSA. Für die Aggregate eine Kupplung Grad von 9,5 ermittelt wurde. Die Propyphenazon Konjugat wurde gezeigt, dass von 68,5% Monomeren mit einem Kopplungsgrad von 21,2 bestehen. Die Kopplung Grad der Aggregate betrug 27,9. Insgesamt war das bestimmt Kopplungsgrad der DF-Konjugate 7,6 DF und der PP-Konjugate betrug 23,2. BAT mit Konjugaten unter optimierten Bedingungen (Konzentration der Konjugate, die Stimulation der Zeit) erlaubt Untersuchung von IgE-abhängige Reaktionen in NSAID Überempfindlichkeit durchgeführt. Wie in Abbildung 5 dargestellt, war nur der PP-Konjugat in der Lage, Auslöser Basophilenaktivierung visualisiert durch eine Hochregulation in CD63 Oberflächenexpression: 20,6% der Basophilen wurden aktiviert gekennzeichnet durch eine log-Verschiebung der Fluoreszenz-Intensität. Die MFI um den Faktor von 4,9 von 386 (negative Kontrolle), um 1893. Im Gegensatz dazu mit dem DF-Konjugat nur 3,1% der Basophilen wurden aktiviert, wurde die Schwelle von 5% cut-off. Auch die MFI erhöhte sich nur um den Faktor 1,1 (Grenzwert 2,0) von 197 (negative Kontrolle) auf 210. Assay Gültigkeit ist gegeben durch (i) &lt;5% Basophilenaktivierung in die Negativ-Kontrolle, (ii) ein Protokoll-Verschiebung der Fluoreszenzintensität eines basophil Subpopulation, und (iii)&gt; 50% aktivierten Basophilen (positive Kontrolle). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" /> Abbildung 1. Kopplung von DF und PP-Derivat zu HSA. Nach dem Auflösen der Drogen-, Wasser-, MES-Puffer und EDC (Kupplungsreagenzes) zugegeben. Die Proben werden für 1 Minute gevortext, bevor HSA, um das Medikament Lösungen pipettiert wird. Innerhalb von 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln die Medikamente kovalent an HSA. Monomere sowie Aggregate führen kann. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" /> Abbildung 2. Berechnung der Kopplung Grad. Erstens sind die Konstanten k und k RI UV bestimmt. Daher ist HSA-Standard mit bekannter Konzentration in die HPSEC System injiziert. (Dn / dc) und (dA / dc) der HSA sind Werte von 0,185 und 0,518 gegeben, bzw. 5. Die Peakflächen sind für die Berechnung der Konstanten verwendet. Zweitens, für jedes Medikament drei Standards injiziert werden, um Drogen-und Konzentrations-spezifischen RI-und UV-Bereiche zu ermitteln. Da die k RI und UV k Konstanten aus den oben genannten Schritte bekannt sind, kann der Wirkstoff-spezifischen (dn / dc) und (dA / dc)-Derivate berechnet werden. Drittens, Drogen-HSA-Konjugate sind in HPSEC injiziert. Die daraus resultierenden Peakflächen werden verwendet, um die Konzentration der Drogen-und HSA pro Peak durch Lösen der zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten zu berechnen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" /> Abbildung 3. Basophil Gating. Cells prognostiziert, wie Lymphozyten gated side scatter gegenüber Vorwärtsstreuung (SSC-FSC Plot) werden. Die Basophilen sind CCR3 hallo SSC lo aus der gated-Lymphozyten (SSC-CCR3-PE Grundstück) identifiziert. Basophile sind für die Aktivierung (CD63 hallo) in den CD63-FITC-CCR3-PE Plot analysiert. Die negative Kontrolle wird verwendet, um den Cut-off von maximal 2,5% Basophile übrigen CD63 hallo gesetzt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" /> Abbildung 4. Entschlossen Kopplung Grad der Arzneimittel-Konjugate. RI-und UV-Signale zeigen zwei Peaks, welche Aggregate (Elution bei niedrigen Retentionsvolumen) und Monomere (Elution bei hohen Retentionsvolumen) von Drogen-HSA-Konjugate. Prozentuale Anteile der Monomere und Aggregate (ermittelt aus RI-Signale) und deren Kopplung Grad (n = 1) dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" /> Abbildung 5. Basophil Activatizu testen. Die Ergebnisse der Drogen-Konjugat-aktivierten Proben, negativen Kontrollen und Positivkontrollen sind in CD63-FITC-CCR3-PE-Flächen (n = 1) dargestellt.

<ol>
	<li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone.">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li><li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+questions+in+Allergy:+1--drug+allergy/hypersensitivity.">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li><li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils,+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy.">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li><li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diclofenac+hypersensitivity:+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites.">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li><li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering,+absorbance,+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions.">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li><li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+tests+based+on+human+basophils:+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues.">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li><li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-assisted+allergy+diagnosis:+current+applications+and+future+perspectives.">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li><li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions:+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils.">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory &#38; Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li><li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

BAT ist eine gut etablierte, aber noch nicht routinemäßig Verfahren zur Diagnose von IgE-vermittelten allergischen Erkrankungen 6,7 verwendet. Für Arzneimittelüberempfindlichkeit jedoch ist seine Anwendbarkeit gefährdet als niedermolekulare Verbindungen nicht in der Lage sind zu vernetzen IgE-Rezeptoren, eine Voraussetzung für Basophilenaktivierung 8. Deshalb brauchen Drogen untersucht kovalent an geeigneten Carrier-Proteine ​​(zB HSA) gekoppelt werden. Wichtig ist, muss die Kupplung Grad (dh die Zahl der Wirkstoff-Moleküle pro Trägerprotein) kontrolliert werden, um immunologische Aktivität zu gewährleisten (dh IgE-Rezeptors Vernetzung) der Konjugate werden. Theoretisch sollten zwei Haptene pro Trägermolekül ausreichend für IgE-Rezeptors Vernetzung und nur fünf DF-Molekülen pro HSA haben gezeigt, dass Mediatorfreisetzung in einem zellbasierten Assay 4 Trigger. Beide Konjugate, PP-HSA und DF-HSA, ermittelt worden sind, um eine ausreichend hohe Kopplungsgrad (HPSEC) anzuzeigen und zu immunologisch aktiven und eignen sich Reagenzien für den Einsatz in BAT. Ein weiteres Problem könnte sein, dass Drogenmetaboliten eine Rolle spielen, als Metabolit anstelle der Eltern Medikament kann die Überempfindlichkeit verursachen. Im Falle von DF, hat diese Möglichkeit im Detail zuvor mit fünf großen Phase-I-Metaboliten und eine Verknüpfung der Variante 4 bewertet worden. Wichtige Faktoren für die Bewältigung der beschriebenen Technik zählen Qualität der Blutprobe (&lt;12 Stunden seit der Blutentnahme, die Anzahl der erkannten Basophilen&gt; 500) und Optimierung der Stimulation (Zeit, Dosis). Darüber hinaus Non-Responder, die nicht einmal mit der positiven Kontrolle (Antikörper gegen den IgE-Rezeptor gerichtet sind) zu identifizieren, die zu reagieren sogenannten. Deshalb haben Validierungskriterien zu einer Anti-FcεRI Antikörper als positive Kontrolle beinhalten. Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von Arzneistoff-Konjugate ist die Tatsache, dass sie ungiftig im Gegensatz zu reinen Drogen, wie für DF-HSA-Konjugat durch Co-Stimulation mit anti-FcεRI Antikörper in BAT 4 dargestellt erscheinen. Reine DF, dagegen zeigt zytotoxische Wirkung bei einer Konzentration von 1,25 mg / ml zu Problemen mit der Interpretierbarkeit der BAT 9. Im Allgemeinen ist das Testen für potentielle Zytotoxizität stark für jede neu produzierte Drogenkonjugat empfohlen. Hier haben wir das Potenzial der PP-HSA-Konjugat in BAT verwendet werden, um IgE-vermittelte Überempfindlichkeit zeigen, dargestellt. Im Gegensatz dazu ist DF Überempfindlichkeit nicht mit IgE durch den Mangel an Basophilenaktivierung in Reaktion auf DF-HSA-Konjugat nachgewiesen verbunden. Wichtig ist, dass im Falle der Unsicherheit bezüglich einer IgE-vermittelten Mechanismus haben Konjugate für die immunologische Aktivität in vitro Zell-basierten Testsystemen untersucht, wie es für DF 4 gezeigt. Mit dem beschriebenen Aufbau der Konjugation, niedermolekulare Wirkstoffe kovalent an geeigneten Protein-Träger-Molekülen eine Reihe von Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Arzneimittel, einschließlich Antibiotika, andere NSAIDs, radiocontrast Medien, Muskelrelaxantien, Anästhetika, etc. können für eine Beteiligung einer IgE-vermittelten untersucht werden Mechanismus. Daher kann BAT als Ergänzung zu den bestehenden Verfahren für die Diagnose (Hauttest, orale Provokation Test) dienen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / device </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7,8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL Spalte </td><td> Tosoh Bioscience </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Diclofenac-Natrium-Salz </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA-Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 CAST Kit </td><td> Bühlmann Laboratories </td><td> FK-CCR </td><td> Effektive 14. Juni 2011 Flow2 CAST-Kit ist jetzt Durchfluss CAST </td></tr><tr><td> HP1100 HPLC-System </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Humanem Serumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Laborzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-Ethyl-N&#39;-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid Hydrochlorid (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBS-Tabletten </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propyphenazon derivative </td><td> Department of Molecular Biology, University of Salzburg, Österreich </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Shaker </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumhydrogencarbonat </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Natronlauge </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumphosphat </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Triple-Detektor-Array </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> Persönliche BioVortex V-1 plus </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Wasserbad 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basophil activation test for investigation of ige-mediated mechanisms in drug hypersensitivity

Überempfindlichkeitsreaktionen gegen nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) wie Propyphenazon (PP) und Diclofenac (DF) kann sich als Typ I-wie allergische Reaktionen 1. In der klinischen Praxis ist die Diagnose von Arzneimittelüberempfindlichkeit hauptsächlich durch Anamnese durchgeführt, wie Hauttests ist nicht zuverlässig und mündliche Provokationstestung trägt lebensbedrohliche Risiken für den Patienten 2. Daher ist ein Beweis für eine zugrunde liegende IgE-vermittelten Pathomechanismus schwer zu bekommen. Hier präsentieren wir ein in vitro-Methode für die Verwendung von menschlichen Basophilen von Drogen-überempfindlichen Patienten, die allergische Reaktion Effektorzellen in vivo nachahmt abgeleitet werden. Als Basophilen von Drogen-allergischen Patienten IgE-Moleküle spezifisch für die Täter Drogen zu tragen, werden sie auf IgE-Rezeptor aktiviert Vernetzung und Freisetzung allergischer Effektormoleküle. Die Aktivierung von Basophilen kann durch die Bestimmung der Hochregulation von CD63 Oberflächenexpression mittels Durchflusszytometrie 3 überwacht werden. Im Falle von niedermolekularen Medikamenten, sind Konjugate entwickelt, um IgE-Rezeptors Vernetzung auf Basophilen zu ermöglichen. Wie in Abbildung 1, zwei Vertretern der NSAIDs dargestellt, PP und DF, kovalent an humanes Serumalbumin (HSA) über eine Carboxylgruppe reagiert mit der primären Aminogruppe von Lysin-Reste gebunden. DF trägt eine intrinsische Carboxylgruppe und kann somit direkt 4 verwendet werden, während eine Carboxylgruppe enthaltende Derivat des PP musste organochemically vor der Studie 1 synthetisiert werden. Die Kopplung Grad der niedermolekularen Verbindungen auf dem Protein-Träger-Molekül und ihrer räumlichen Verteilung ist wichtig, um die Vernetzung von zwei IgE-Rezeptor-Moleküle zu gewährleisten. Die hier beschriebene Protokoll gilt Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie (HPSEC) mit einer sequentiellen Brechungsindex (RI) und Ultraviolett (UV)-Detektionssystem für die Bestimmung der Kopplungsgrad ausgestattet. Da die beschriebene Methodik für andere Medikamente angewendet werden kann, trägt die Basophilenaktivierungstest (BAT) das Potenzial für die Bestimmung von IgE-vermittelten Mechanismen in Arzneimittelüberempfindlichkeit verwendet werden. Hier stellen wir fest, PP Hypersensibilität als IgE-vermittelten und DF Überempfindlichkeit wie BAT nicht IgE-vermittelt.

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity at JoVE.com

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Basophilenaktivierungstest ist ein starkes Werkzeug für den Nachweis von IgE-abhängige Allergien<em&gt; In-vitro-</em&gt;. Hier ist ein optimiertes Protokoll für Basophilenaktivierungstest zur Arzneimittelüberempfindlichkeit untersuchen. Eine Methode für die effiziente Produktion von kovalenten Drogen-Protein-Konjugate und ihre physikalisch-chemischen Charakterisierung beschrieben wird.

Basophilenaktivierungstest für die Untersuchung von IgE-vermittelten Mechanismen in Drug Überempfindlichkeit

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

basophil-activation-test-for-investigation-ige-mediated-mechanisms

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

Adverse Drug Effects and Chemical Toxicity

SCIENTISTS IN ACTION

33.3K Aufrufe.  University of Salzburg. Basophilenaktivierungstest ist ein starkes Werkzeug für den Nachweis von IgE-abhängige Allergien In-vitro-. Hier ist ein optimiertes Protokoll für Basophilenaktivierungstest zur Arzneimittelüberempfindlichkeit untersuchen. Eine Methode für die effiziente Produktion von kovalenten Drogen-Protein-Konjugate und ihre physikalisch-chemischen Charakterisierung beschrieben wird.

Serie: Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ Assay für Antigen-spezifische Verordnung

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.