Der Assay stellt ein wichtiges Forschungsinstrument dar, um die Degranulationen von Basophilen zu simulieren, die durch die Vernetzung von IgE und Allergenen der Patienten induziert werden. So kann der Assay verwendet werden, um allergische Reaktionen vom Typ 1 nachzuahmen. Der Assay ist robust, reproduzierbar und anpassbar.
Darüber hinaus ist es hochempfindlich, da es mit kleinen Mengen rekombinanter oder gereinigter Allergene oder sogar mit komplexen Allergenextrakten durchgeführt werden kann. Die Methode wird verwendet, um Allergien zu diagnostizieren, da sie die Reaktivität des IgE der Patienten auf Allergene analysiert. Auch diese Methode eignet sich zur Analyse der Kreuzreaktivität und zur Überwachung der Wirksamkeit der AIT-Behandlung.
Beginnen Sie mit der Ernte von Ag8-Zellen aus dem Zellkulturkolben und übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugationsröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für fünf Minuten, bei 250 mal g bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Zellpellet auf eine Endkonzentration von etwa einmal 10 bis zu den sechsten Zellen, pro Milliliter in humanisiertem RBL-Zellmedium.
Humane Seren eins bis 10 in Ag8-Zellsuspension für die endgültige Serumverdünnung von ein bis 20 im Assay verdünnen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und fünf bis 7% Kohlendioxid inkubieren. Wenn die humanisierten RBL-Zellen eine Konfluenz von 50 bis 90% erreichen, saugen Sie das Medium vorsichtig aus einem T-75-Zellkulturkolben ab, ohne die anhaftenden humanisierten RBL-Zellen zu berühren. Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 10 Milliliter DPBS auf die gegenüberliegende Seite des Kolbens und nicht direkt auf die Zellen geben.
Saugen Sie DPBS an, fügen Sie fünf Milliliter vorgewärmtes einmal erwärmtes Trypsin-EDTA zur Zellablösung hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu lösen. Die Zellsuspension wird in ein 15-Millimeter-Zentrifugationsröhrchen gegeben und das Röhrchen mit humanisiertem RBL-Zellmedium oder DPBS gefüllt, um das Trypsin-EDTA zu verdünnen.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter humanisiertem RBL-Zellmedium für die Zellzählung. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, verdünnen Sie die Zellen in humanisiertem RBL-Zellmedium, um eine Endkonzentration von zweimal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter zu erhalten.
Fügen Sie 50 Mikroliter humanisierte RBL-Zellsuspension pro Vertiefung hinzu, was einem Mal 10 bis fünf Zellen pro Vertiefung in einer sterilen 96-Well-Platte entspricht. Zentrifugieren Sie die vorinkubierte Ag8-Serumsuspension und übertragen Sie 50 Mikroliter der zentrifugierten Ag8-Serumsuspension in jede Vertiefung, die humanisierte RBL-Zellen enthält, ohne das Ag8-Zellpellet zu stören. Verwenden Sie sensibilisierte unstimulierte Zellen ohne Antigen als keine Antigenkontrolle zur Anzeige des unteren Signalplateaus oder Hintergrunds und sensibilisieren Sie nicht den Hintergrund und die maximale Lysekontrolle.
Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und fünf bis 7% Kohlendioxid. Saugen Sie das Seren, das das Zellmedium enthält, invertieren und klopfen Sie die Platte auf das saugfähige Papier, um die Platte zum Waschen humanisierter RBL-Zellen zu entleeren. Waschen Sie die Zellen dreimal, indem Sie 200 Mikroliter Tyrodes Puffer pro Vertiefung hinzufügen, und inkubieren Sie sie für etwa 30 Sekunden pro Waschgang für die ersten beiden Waschungen.
Nachdem Sie Tyrodes Puffer zum dritten Mal hinzugefügt haben, saugen Sie den Puffer ab und lassen Sie die Lösung in den Vertiefungen, bis sie bereit ist, die Antigenverdünnung hinzuzufügen. Übertragen Sie 100 Mikroliter Antigenlösung in jede Vertiefung, die die vorsensibilisierten humanisierten RBL-Zellen enthält, aber stimulieren Sie nicht die maximale Lyse und nicht sensibilisierte Hintergrundzellen mit Antigen. Fügen Sie 100 Mikroliter Tyrodes Puffer in die maximalen Lysekontrollbrunnen, nicht sensibilisierten Hintergrundkontrollbrunnen und sensibilisierten No-Antigen-Wells hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und fünf bis 7% Kohlendioxid. Behandeln Sie die maximalen Lysekontrollbrunnen mit 10 Mikrolitern von 10% Triton X-100 pro Vertiefung und mischen Sie richtig, um die Zellen vollständig für eine 100% ige Freisetzung von Beta-Hexosaminidase zu lysieren. Fügen Sie 50 Mikroliter Substratlösung in eine neue unverbindliche 96-Well-Platte ein.
Übertragen Sie 50 Mikroliter Überstand aus den Vertiefungen humanisierter RBL-Zellen, die Platte enthalten, in die neue Platte, die die Substratlösung enthält, und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die Umwandlung des fluorogenen Substrats zu ermöglichen. Fügen Sie 100 Mikroliter Stopplösung pro Vertiefung hinzu und messen Sie die Fluoreszenz wie im Textmanuskript beschrieben. Die glockenförmige Kurve, die im Beta-Hexosaminidase-Aktivitätsassay erhalten wurde, zeigt die monovalente Besetzung von Antigenepitopen von Immunglobulin E aufgrund des Allergenüberschusses an, der die Vernetzung des Allergens Immunglobulin E bei hohen Antigenkonzentrationen hemmt.
Die für die halbmaximale Mediatorfreisetzung notwendige Antigenkonzentration wurde mit Hilfe der linearen Regressionsanalyse berechnet. Der Zelllebensfähigkeitstest wurde durchgeführt, um die zytotoxischen Wirkungen auszuschließen, die entweder aus dem sensibilisierenden Serum oder dem zur Stimulation verwendeten Antigen abgeleitet wurden. Fünf verschiedene menschliche Seren wurden für den Beta-Hexosaminidase-Aktivitätstest verwendet, und vier von fünf Seren, die von birkenpollenallergiepatienten abgeleitet wurden, sprachen auf die Bet v 1-Stimulation an, was zeigt, dass Bet v 1 ein starkes Allergen ist, das für immunglobulin E-vermittelte allergische Symptome verantwortlich ist.
Die Kreuzreaktivität von Immunglobulin E auf homologe Allergene wurde untersucht. Die Reaktion auf Bet v 1 wurde bei beiden Patienten gefunden, aber Patient zwei sprach auch auf Cor a 1 an. Das bet v 1 homologe Nahrungsmittelallergen, das auf höhere Cor a 1 kreuzreaktive Immunglobulin-E-Spiegel bei Patient zwei hinweist.
Die hypoallergene Natur der mutierten Varianten der Allergene wurde bewertet und mit ihrem Wildtyp-Gegenstück verglichen. Die Freisetzungskurve der Bet v 1-fachen Variante verschob sich in Richtung einer höheren Antigenkonzentration im Vergleich zum Wildtyp-Allergen, was zu einer signifikant höheren Antigenkonzentration führte, um die halbmaximale Freisetzung zu provozieren, was die Mutante weniger allergisch und damit zu einem Kandidaten für eine allergenspezifische Immuntherapie macht. Vergessen Sie nicht, die Waschlösungen auf den Zellen zu lassen, bis Sie die Antigenverdünnung anwenden, um ein Austrocknen der Zellen zu vermeiden, da dies sonst zu einer schlechten Leistung des Assays führen würde.
Der Assay kann für viele verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Standardisierung von allergenen Produkten, basierend auf ihrer biologischen Aktivität, wie z. B. Hautpricktestlösungen oder Extrakte, die für allergenspezifische Immuntherapien verwendet werden.
