Die Autoren sind sehr dankbar, RJ Sommer und X Wang für die Unterstützung bei Mikroinjektion, sowie aufschlussreiche Kommentare von den anonymen Gutachtern. Diese Arbeit wird durch NIH SC2GM089602 unterstützt.

1. Transgenese: DNA-Präparation <ol><li> Dominant Co-Injektion Marker: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)] Die pRL3 Plasmid ist ein dominantes Co-Injektion Marker für visuell identifiziert erfolgreiche Transformation Veranstaltungen. Dieses Plasmid kodiert für eine dominante mutierte Allel (tu92) des PPA-prl-1-Gen eng mit der SQT-1 Kollagen-Gens in C. im Zusammenhang elegans und verwandelt den Wildtyp sinusförmige Bewegung in Uhrzeigersinn drehen Bewegungen entlang der Wurm den Körper Achse 1,5. Die transformierten Tier ist sehr ähnlich wie die beliebten dominanten Selektionsmarker rol-6 (su1006) in C eingesetzt elegans in den vergangenen 20 Jahren. </li><li> Ziel Reporter-Transgen: PPA-EGL-4P:: gfp Ein Gen von Interesse kann transkriptionell oder translatorisch zu einem GFP kodierende Sequenz 9 verbunden werden. In dieser Studie, die PPA-EGL-4promoter:: gfp (EGL-4, cGMP-abhängigen Proteinkinase) was verwendet werden, um festzustellen, ob ein 2 kb-Fragment vor dem Start der Übersetzung kann GFP-Expression in P. verleihen pacificus PS312. Dieses GFP-Vektor enthält eine GFP kodierende Region mit modifiziertem Introns und der Mehrzweck-PPA-rpl-23 3 &#39;UTR Terminator 5 freundlicherweise von Xiaoyue Wang und Ralf J. Sommer (Max-Planck-Institut, Tübingen, Deutschland, EU) zur Verfügung gestellt. </li><li> Genomic DNA: PS312 Die Zugabe von Wildtyp P. pacificus PS312 genomische DNA ist erforderlich, um stabile Transgenexpression Erbe zu erhalten, insbesondere von transgenen F 1 Tiere, um ihre F 2 Nachkommen 5. Es ist noch nicht sicher, ob die genomische DNA bildet komplexe extrachromosomale Arrays mit den beiden Transgene (die Co-Injektion Marker PRL-3 und der PPA-EGL-4P:: gfp-Reporter), ähnlich denen in stabilen F 2 transgenen Linien beobachtet C. elegans 3. Um jedoch die Anforderung haben die genomische DNA und Transgene zu identica Aktienl Zusammenhalt Überhänge stark darauf hin, die Bildung von komplexen extra-chromosomale Arrays der Wirtszellen für die richtige DNA-Übertragung (gDNA hergestellt unter Verwendung von Sigma G1N10 Kit) erkennen kann. </li><li> DNA-Spaltung Restriktionsenzyme werden verwendet, um die PPA-EGL-4p linearisieren:: GFP-Vektor-DNA und klebrig Überhänge mit den Co-Injektion Marker pRL3 und PS312 gDNA zu produzieren. Mix durch Antippen, nicht vortexen. Inkubieren für eine Stunde bei 37 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> PstI (10 U / ul) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4P:: gfp </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10x Puffer </td&gt; <td> 10 pl </td></tr><tr><td> SalI (10 U / ul) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> 10x Puffer </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> Pst I und Sal I (10 U / ul) </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Mixture für Restriktionsenzymverdau. <ol start="5"><li> DNA-Fällung und Vorbereitung <ol><li> Add 01.10 Natriumacetat (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) und 2,5-fache des Volumens von 100% Ethanol zum verdaut Produkt, fügen Sie 20 ng / ul von Glykogen, um zu sehen Pellet leichter. </li><li> Zentrifuge bei14.000 rpm für 15 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand durch Kippen langsam dem Zentrifugenröhrchen auf den Kopf und dann darauf tippen auf ein Tissue-Papier, um sicherzustellen, dass die Pellets sicher ist in der unteren Ecke des Rohres und frei von Ethanol. </li><li> 1 ml 75% Ethanol. </li><li> Unmittelbar bei 14.000 rpm Spin 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand durch langsames Kippen der Zentrifugenröhrchen auf den Kopf und dann darauf tippen auf ein Tissue-Papier darauf achten, dass das Pellet es in der unteren Ecke des Rohres sicher und frei von Ethanol. </li><li> Dry Pellet im Vakuum Zentrifuge bei 14.000 rpm für 5 Minuten bei 25-30 ° C, bis es trocken und völlig frei von Ethanol. </li><li> Add 30 ul TE oder sterilem dH 2 O und lassen über Nacht bei 4 ° C vor dem Mischen kurz mit einem Vortex. </li><li> Tabelle 2 beschreibt, wie die Injektion Mischung aus jedem gereinigten DNA zur Injektion zu schaffen. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. Nach dem Auftauen die Mischung inspritzung, Spin-down der Röhre bei 14.000 rpm für 5 Minuten, um Schmutzpartikel, dass die Injektionsnadel verstopfen können zu befreien. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Genetisches Material </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4P:: gfp (SalI) </td><td> &gt; 5 ng / ul (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 (PstI + SalI) </td><td> &gt; 60 ng / ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 30 mu l </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. PPA-prl-1 Injektion Mischung 2. RNA-Interferenz: In vitro doppelsträngige RNA-Synthese <ol><li> Verwenden PCR das Gen von Interesse zu verstärken. RHL091 5&#39;-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 &#39;(BamHI) und RHL092 5&#39;-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 &#39;(PstI-Stelle) wurden verwendet, um eine 464 bp genomischen Fragment (Position 3-466) aus dem pRL3 Vektor, der die PPA-prl-1 (tu92) Allel zu verstärken. </li><li> Digest des PCR-Produkts mit BamHI und PstI. </li><li> Ligieren des Fragments an BamHI / PstI pL4440 RNAi Fütterung Vektor 2 verdaut. </li><li> Transformieren Sie die eingefügten Vektors in kompetente Zellen wachsen und sie auf Ampicillin LB-Medium-Platten (50 ug / ml). </li><li> Wählen Sie den erfolgreich eingeführten Vektors mittels PCR unter Verwendung der T7-Primer. </li><li> Verwenden Sie die T7 flankiert PCR-Produkt mit dem prl-1-Gen auf doppelsträngige RNA-dsRNA zu machen) mit der BLOCK-IT RNAi-Synthese-Kit (Invitrogen). </li><li> Die dsRNA-Konzentration ist am besten, wenn&gt; 200 ng / ul, bis zu 1 ug / ul zur Injektion. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. Nach dem Auftauen der Mischung zur Injektion, Spin-down der Röhre bei 14.000 rpm für 5 Minuten auf der Schmutzpartikel, dass die injectio verstopfen kann losn Nadel. </li></ol> 3. Mikroinjektion: Protokoll für die Injektion von Transgenen und / oder dsRNA <ol><li> Injektionsnadeln <ol><li> Stellen Sie die Narishige Nadel-Abzieher (Modell #: PC-10) Temperatur: <ol><li> Schalten Sie unten Knopf auf &quot;No.2 Heater&quot;. </li><li> Drehen Sie den &quot;No.2 Heater Adj.&quot; Knopf bis Panel liest 55,0-60,0 ° C für konische Nadelspitze mit unterschiedlichen Längen. </li></ol></li><li> Drehen Sie den unteren Knopf zurück zu &quot;Schritt 1&quot; (Pulls Nadel in einem Schritt). </li><li> Laden Nadel in die Kammer und stellen Sie sicher, dass es sicher ist. </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; (rote Taste) und erlauben Nadel mit allen Gewichten (dies sollte zwei identischen Nadeln in entgegengesetzte Richtungen zu machen) gezogen werden. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Kammer und speichern in einer Kunststoff-Platte Kultur anstelle von Play-Doh gesichert, dass Staub auf den Nadeln zu verhindern. </li></ol></li><li> Montage-Pads <ol><li> In einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, machen Sie eine 2% Edle Agar solution durch Zugabe von 0,02 g Noble-Agar zu 1 ml H 2 O. Der Agar kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Jahr. </li><li> Nach gründlichem Mischen und Schmelzen Agar in einem Heizblock auf&gt; 88 ° C. </li><li> Mit einer 1 ml Mikropipette einen Tropfen Flüssigkeit 2% Edle Agar in die Mitte der Glasplatte (Fisher, 12 bis 544-F). </li><li> Flatten, indem eine andere Glasplatte auf der Oberseite des Tropfens. </li><li> Wiederholen Sie die &quot;Drop Step&quot;, bis es eine Schicht von fünf Objektträger aus Glas. </li><li> Nehmen Sie jede Glasplatte, indem Sie den Glasträger sich gegenseitig. </li><li> Dry abflachen Agar-Pad auf Glasträger in einem Vakuumofen bei 70 ° C für 4 Stunden bis über Nacht (oder über Nacht bei Raumtemperatur). </li><li> Machen Sie mehrere Injection Pads und speichern für zukünftige Verwendung. </li></ol></li><li> Mikroinjektion in zwittrigen Gonaden </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> Abbildung 1. Eine schematische Zeichnung des P. pacificus anatschaft. Die klare kernhaltigen Zellen sind weibliche Keimzellen (Eizellen) und die grau unterlegten Teil ist der Darm. Nur eine distale vordere Gonaden wird angezeigt, aber bemerken die beiden distalen Gonaden einander kreuzen dorsal nahe Mitte Körper. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bilder der Mikroinjektion. (A) Die Injektion Nadelspitze im Fokus mit der rechten Linie der Kapillare gezogen Stück. Durch leichtes Berühren der Spitze der Nadel, um die Kante, sollte die Nadelspitze zu brechen unter Beibehaltung einer scharfen Spitze. (B) Die Nadel-Einsätze in den oberen Gonade knapp über den Darm Krümmung für die erste Injektion. (C) Die Nadel-Einsätze in den unteren Gonaden knapp unterhalb der gut Krümmung für die zweite Injektion. <ol start="3"><li><ol><li> Achten Sie darauf, den Kontrast und die DIC Scheren Einstellung ist ideal für das Betrachten des Hermaphroditen Keimdrüsen. </li><li> Laden 1,0-2,0 ul der Injektion Mischung in die gezogenKapillarnadel. </li><li> Stecken Sie die Nadel in die Mikroinjektion Manipulator, Manometer der Stickstoff-Tank sollte, um ideale Bedingungen (10-20 psi für 0,5-1 sec) eingestellt werden. </li><li> Break the Nadelspitze durch Berühren leicht auf Rand einer dünn gezogen Kapillare auf einer Folie (Abbildung 2A) platziert. <ol><li> Needle Leistungsschalter slide: der dünnste Teil einer Kapillare gezogen platziert auf einem Glasträger in einem Tropfen Öl </li></ol></li><li> Sobald die Nadel gebrochen ist, kann vorhanden sein, um eine Ruhelage, während Sie Ihre Wurm holen, um das Pad (P. pacificus eine 5 Minuten-Fenster für die Injektion, bevor sie trocken-out und sterben). </li><li> Mit einem Teller voller J4-jungen erwachsenen Würmer, pour genug Paraffinöl (schwer), nur alle die Würmer in OP50 Bakterienrasen. </li><li> Wählen Sie ein Wurm und legen Sie es auf die Injektion Pad. </li><li> Legen Sie die Objektträger aus Glas mit dem Wurm unter dem Mikroskop; Position des Wurms Gonade in Richtung der Nadel und der Vulva weg von der Notwendigkeitle (Abb. 2B, 2C). </li><li> Senken Sie die Nadel in die Position des Mikroskops zu sehen. </li><li> Position der Spitze Gonade und die Nadel in die gleiche Bildebene (Abbildung 2B). </li><li> Poke der Wurm sanft und Pumpe in der Injektion Mischung; ooctyes Trennung in Richtung der distalen Spitze deuten auf eine erfolgreiche Injektion (Um Transgen oder dsRNA Lieferung zu optimieren, sollten Sie bei der Injektion sehen eine Welle der Expansion in den Keimdrüsen, die bis nahe an das distale ist weiterhin tip). </li><li> Positionieren Sie die Nadel auf die untere Gonade und wiederholen Injektion injizieren, aber da diese Gonade unter dem Bauch der Verbreitung der Eizellen nicht sieht, und ist somit schwieriger zu erreichen (Abbildung 2C). </li><li> Normal aussehenden Wurm deutet auf eine erfolgreiche Injektion nach der Injektion; sollte es keine beschädigten Gonaden werden (ragt aus der Vulva oder tauchte in der Körperhöhle). </li><li> Stecken Sie die Nadel wieder in Ruhestellung. </li><li> Bereiten Sie den Wurm zu retten. </li><li> Fügen Sie einTropfen (0,5 ul) M9-Puffer auf das Pad, wo das injizierte Wurm platziert wird. </li><li> Mit einigen OP50 Bakterien auf Ihre Wahl, berühren Sie den Wurm mit dem OP50, und es sollte halten. Wir verwenden keine Mund pipettieren. </li><li> Setzen Sie den Wurm auf die Platte mit 50 ul Flecken OP50 ausgesät, können 2-4 Würmer auf solchen Platten gerettet werden. </li></ol></li><li> Post-Injektion Storage &amp; Screening für Transgenese <ol><li> Shop injiziert Würmer (P 0) bei 20 ° C für ca. 4 Tage, um Eier zu legen und aufwachsen F 1. </li><li> Screen-Würmer am vierten Tag für ausgewählte Phänotyp (Um-Bildschirm für Transgenese Suche nach rollende Tiere Ausdruck der PPA-prl-1 dominante Marker). </li><li> Wählen Sie einzelne unabhängige F 1 &#39;s Tiere mit dem beobachteten Phänotyp zu neuen ausgesät Platte und lagern bei 25 ° C; dieser Temperatur fördert die Bildung von stabilen Linien von F 1&#39; s. </li><li> Einzel-F 2 aus unabhängigen F 1-Linien. Individuelle F 2 </sub&gt; Linien haben ähnliche Transgen Übertragungsraten. Wir erhalten häufig&gt; 15 F 2 Zeilen pro verwandelt F 1 Tier. </li><li> Shop nachfolgenden Generationen bei 25 ° C. </li><li> Die Übertragungsrate der Rollen bleibt in der Regel nach dem F 4-Generation konstant, so ist es zu dieser Zeit notwendig, um die Expression des Ziel-Transgen (PPA-EGL-4P:: gfp) ermitteln für jede einzelne Linie. GFP-Expression kann nicht mit dem Ausmaß der Penetranz der dominanten Rolle Phänotyp korrelieren. </li></ol></li><li> Post-Injektion Storage &amp; Screening für RNAi-Phänotypen <ol><li> Shop injiziert Würmer (P 0) bei 20 ° C für ca. 4 Tage zu verlegen und zu wachsen F 1. </li><li> Screen-F 1 Würmer am vierten Tag für ausgewählte Phänotyp (Um-Bildschirm für RNAi-Knockdown Phänotyp, suchen Sie nach penetrant Phänotypen, die mit dem Verlust der Ziel-Gen-Aktivität in Verbindung gebracht werden, kann in unserem Fall den Verlust des PPA-prl-1 Phänotyp). </li><li> Nach unserer Erfahrung ist die nicht-roller Knockdown Phänotyp in&gt; 97% der F 2 verloren. </li></ol></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: 1. Ergebnis der Transgenese <table border="1"><tbody><tr><td> Session </td><td> Injected P 0 </td><td> F 1 Rollers </td><td> % Transgenen F 2 </td><td> Durchschnittliche% Transmission nach F 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Linie 1) 0% (Linie 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (Linie 3) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Linie 4) 0% </td><td> NA </td&gt; </tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Linie 5) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table> * Eine männliche Rolle, nicht überschreiten; NA: Nicht anwendbar . Tabelle 3 Ergebnisse der injizierten PS312 mit PPA-EGL-4P:: gfp (Sal I verdaut), pRL3 (Rolle) (Pst I verdaut) und gDNA PS312 (PstI und SalI verdaut). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> Abbildung 3 (A) Wildtyp (B, C) ​​eine stabile F 4 pRL3; PPA-EGL-4p.:: Gfp transgene Linie zeigt den Kopf Neuron GFP-Expression. 2. Ergebnis der RNA-Interferenz <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> Abbildung 4. RNA injiziert prl-1-Mutantenzeigen komplette Knockdown von &quot;rollenden&quot; Fortbewegung. (A) prl-1 Rolle gain-of-function-Mutante tu92. (B) prl-1-Mutanten weisen eine normale Wildtyp-Haltung und Bewegung &quot;abgerissen&quot;. (C) injiziert prl-1 (unten) hat auch mehr Körper als prl-1-Mutante (oben). (D) Die mehr Körper injiziert prl-1 (unten) ist auch mehr als der Wildtyp PS312 (oben). Je länger Körper Phänotyp wurde auch in den rol-5 (SQT-1) RNAi Knockdown von C beobachtet elegans N2 (Daten nicht gezeigt). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rollen </td><td> Nicht-roll </td></tr><tr><td> Ein prl-1 dsRNA (200 ng / ul) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B prl-1 dsRNA (1000 ng / ul) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Steuerung </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. </strong&gt; Zusammenfassung der PPA-prl-1 dsRNA Injektionen. (A) [dsRNA] = 200 ng / ul; (B) [dsRNA] = 1000 ng / ul. P = 0,0019 und 0,041 von Exact-Test nach Fisher, zweiseitig, für 200 und 1000 ng / ul Injektionen, jeweils.

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

P. pacificus Populationen sind in enger Zusammenarbeit mit verschiedenen Skarabäus Arten weltweit gefunden und ist ein Modell, Nematoden der Mitte zwischen frei lebenden und Nematoden. Die Stärke des P. pacificus als ein Modell Organismus lag in der Integration seiner genetischen und physikalischen Karten, die positionelle Zuordnung von Mutanten aus unvoreingenommene freuen genetischen Screens isoliert zu fördern (dh nicht nur für Kandidatengene zuvor in C. elegans charakterisiert...

<table border="1"><tbody><tr><th> Produkt: </th><th> Catalog #: </th><th> Lieferant: </th></tr><tr><td> DMI3000 Injection Mikroskop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Mikroinjektor Manipulator (Direct Drive) </td><td> Narashige BC-3 Kugelgelenk </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> Needle Puller </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> Mikroinjektor ™ All-Digital Multi-Druck-System </td><td> Narashige Minj-D </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> GeneElute ™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Cloning Jet-Set </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET Plasmid Miniprep Kit </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Concentrator ™ </td><td> D4005 </td><td> Zymo Forschung </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® Transcription Kit </td><td> K3500-01 &amp; K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Edle </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher Wissenschaftlich </td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas (1,5 bis 0,16 bis 0,19 mm dick, Größe: 50 x 45mm) </td><td> 12 bis 554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Glaskapillaren (Filament) </td><td> 615000 </td><td> AM-Systeme </td></tr><tr><td> Paraffinöl (Heavy) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

Zwar ist es immer günstiger für neue Modell-Organismen vollständig sequenzierten Genomen zu erhalten, weitere eingehende Genfunktion und Expressionsanalysen durch RNA-Interferenz und stabile Transgenese beschränkt bleiben in vielen Arten aufgrund der besonderen Anatomie und molekulare Zellbiologie des Organismus. Zum Beispiel haben außerhalb der Krone Gruppe Caenorhabditis dass Caenorhabditis elegans 3, stabil übertragen transgenen Linien in nicht-Caenorhabditis Arten gehören nicht in dieses scheinbare Stamm (Nematoda) berichtet worden, mit Ausnahme der Zwergfadenwurm 4 und Pristionchus pacificus 5. Zur Erleichterung der wachsenden Rolle von P. pacificus in das Studium der Entwicklung, Evolution und Verhalten 6-7, beschreiben wir hier die aktuellen Methoden zur Mikroinjektion zur Herstellung transgener Tiere und Gen-knock down von RNAi nutzen. Wie die Keimdrüsen <em&gt; C. elegans und die meisten anderen Nematoden, die Keimdrüsen von P. pacificus ist syncitial und in der Lage Einbeziehung DNA und RNA in die Oozyten, wenn sie durch direkte Mikroinjektion geliefert. Im Gegensatz zu C. elegans jedoch stabil transgene Erbschafts-und somatische Expression in P. pacificus erfordert die Zugabe von selbst genomischer DNA mit Restriktionsendonukleasen komplementär zu den Enden der Ziel-Transgenen und Koinjektions Marker 5 verdaut. Die Zugabe von Carrier genomische DNA ist vergleichbar mit der Forderung nach Transgenexpression in Zwergfadenwurm 4 und in den Keimzellen von C. elegans. Es ist jedoch nicht klar, ob die spezifischen Anforderungen für die Tiere eigene genomische DNA ist, weil P. pacificus soma ist sehr effizient zum Schweigen zu nicht-komplexe multi-copy-Gene oder extrachromosomale Arrays in P. pacificus benötigen genomischen Sequenzen für die ordnungsgemäße Montage Kinetochor während der Mitose. Die ventralen Migration des zweiarmigen (didelphic) Gonaden in Hermaphroditen erschwert die Fähigkeit, sowohl Gonaden in einzelnen Würmer 8 zu injizieren. Wir zeigen auch die Verwendung von Mikroinjektion den Zuschlag eine dominante Mutante (roller, tu92) durch die Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in den Keimdrüsen zu Non-Rolling F 1 Nachkommen zu erhalten. Im Gegensatz zu C. elegans, aber wie die meisten anderen Nematoden, P. pacificus PS312 ist nicht empfänglich für systemische RNAi über Fütterung und Tränkung und daher dsRNA müssen durch Mikroinjektion in die syncitial Gonaden angewendet werden. In dieser aktuellen Studie hoffen wir, die Mikroinjektion Prozess benötigt wird, um ein PPA-EGL-4 Promotor verwandeln beschreiben:: GFP-Reporter und Knockdown eine dominierende Rolle prl-1 (tu92)-Mutante in einer visuell informative Protokoll.

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In Modell-Organismen, kann Transgenese manipulieren Genfunktionen während RNAi kann Knockdown spezifische mRNA-Transkripte 1-2. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Techniken benötigt, um stabil zu übertragen DNA und vorübergehend doppelsträngige RNA in die necromenic Nematoden Einführung illustrieren<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Für ein Studium in der Evolution, Entwicklungs-und Verhaltensbiologie.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

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Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K Aufrufe.  California State University. In Modell-Organismen, kann Transgenese manipulieren Genfunktionen während RNAi kann Knockdown spezifische mRNA-Transkripte 1-2. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Techniken benötigt, um stabil zu übertragen DNA und vorübergehend doppelsträngige RNA in die necromenic Nematoden Einführung illustrieren Pristionchus pacificus Für ein Studium in der Evolution, Entwicklungs-und Verhaltensbiologie.

Serie: RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

Lokalisierte RNAi und ektopische Genexpression in der Blutegel

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Bakterielle Lieferung von RNAi Effektoren: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...