Os autores são muito gratos ao RJ Sommer e Wang X para obter ajuda com microinjeção, bem como comentários perspicaz dos revisores anônimos. Este trabalho é apoiado por NIH conceder SC2GM089602.

1. Transgenia: preparação DNA <ol><li> Marcador co-injeção dominante: pRL3 [Ppa-prl-1 (tu92)] O plasmídeo pRL3 é um marcador co-injeção dominante para visualmente identificar eventos de transformação bem sucedida. Este plasmídeo codifica para um alelo dominante mutante (tu92) do gene PPA-prl-1 intimamente relacionado com o sqt-1 gene de colágeno em C. elegans e transforma a locomoção do tipo selvagem sinusoidal em movimentos de torção no sentido horário ao longo do corpo do worm eixo 1,5. O animal transformada é muito parecido com o marcador de seleção popular dominante rol-6 (su1006) usado em C. elegans, nos últimos 20 anos. </li><li> Alvo repórter transgene: Ppa-egl-4p:: gfp Um gene de interesse pode ser ligado ou transcricionalmente traducionalmente a uma seqüência de codificação GFP 9. Neste estudo, o PPA-egl 4promoter:: gfp (egl-4, da proteína quinase dependente cGMP) was usado para determinar se um fragmento de 2 kb a montante do início da tradução pode conferir expressão GFP em P. pacificus PS312. Este vector GFP contém uma região com GFP codificação modificado introns e do polivalente Ppa-rpl-23 3 &#39;UTR terminator 5 gentilmente cedidas por Xiaoyue Wang e J. Ralf Sommer (Max-Planck Institute, Tuebingen, Alemanha, UE). </li><li> DNA genômico: PS312 A adição de tipo selvagem P. pacificus DNA genômico PS312 é necessário para obter a herança do transgene estável, particularmente a partir de transgênicos F 1 animais para sua progênie F 2 5. Não é ainda certo se o DNA genômico formas complexas matrizes extras cromossômicas com os dois transgenes (o marcador co-injeção PRL-3 e do PPA-egl-4p:: reporter GFP) semelhantes aos observados no estáveis ​​F 2 linhagens transgênicas em C. elegans 3. No entanto, a exigência de ter o DNA genômico e transgenes para compartilhar identicaoverhangs l coesa sugere fortemente a formação de complexos extra-cromossômicas arrays as células hospedeiras pode reconhecer para a transmissão de DNA adequada (gDNA preparados usando Sigma G1N10 kit). </li><li> Digestão do DNA Enzimas de restrição são usadas para linearizar o PPA-egl-4p:: gfp DNA do vetor e para produzir saliências sticky compatível com o co-injeção e marcador pRL3 PS312 gDNA. Mix tocando, não vórtex. Incubar durante uma hora a 37 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 mg </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> PstI (10 U mL /) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 L </td></tr><tr><td> Ppa-egl-4p:: gfp </td><td> 4 mg </td></tr><tr><td> Tampão 10x </td&gt; <td> 10 ml </td></tr><tr><td> SalI (10 U mL /) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> gDNA PS312 </td><td> 10 mg </td></tr><tr><td> Tampão 10x </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Pst I e Sal I (10 U mL /) </td><td> 8 mL </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 l </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Mistura de enzima de restrição Digest. <ol start="5"><li> DNA de precipitação e de preparação <ol><li> Adicionar acetato de sódio 1:10 (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) e 2,5 vezes o volume de etanol a 100% para o produto digerido, adicionar 20 ng / mL de glicogênio para ver pellet mais fácil. </li><li> Centrifugar a14.000 rpm por 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante por tombamento lentamente o tubo de centrífuga cabeça para baixo e em seguida, tocando-o em um lenço de papel, certificando-se que o pellet é segura no canto inferior do tubo e livre de etanol. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol 75%. </li><li> Imediatamente giram em 14.000 rpm por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante por lentamente derrubar o tubo de centrifugação de cabeça para baixo e tocando-o em um lenço de papel certificando-se que o pellet-la segura no canto inferior do tubo e livre de etanol. </li><li> Seca sedimento em centrífuga a vácuo a 14.000 rpm por 5 minutos a 25-30 ° C, até secar e completamente livre de etanol. </li><li> Adicionar 30 mL de TE, ou dH 2 O estéril e deixe durante a noite a 4 ° C antes brevemente mistura com um vórtice. </li><li> A Tabela 2 descreve como criar a mistura de injeção de cada DNA purificado para injeção. </li><li> Armazenar a -20 ° C. Após o descongelamento da mistura noprojecção, spin para baixo o tubo a 14.000 rpm por 5 minutos para livrar partículas detritos que possam entupir a agulha de injeção. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Material genético </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> Ppa-egl-4p:: gfp (SalI) </td><td> &gt; 5 ng / mL (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / mL </td></tr><tr><td> gDNA PS312 (+ PstI SalI) </td><td> &gt; 60 ng / mL </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 30 mL </td></tr></tbody></table> Mistura Tabela 2. Ppa-prl-1 injeção 2. Interferência de RNA: In vitro dupla síntese de RNA fita <ol><li> Use PCR para amplificar o gene de interesse. RHL091 5&#39;-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 &#39;(Site BamHI) e RHL092 5&#39;-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 &#39;(site PstI) foram usados ​​para amplificar um fragmento de 464 bp do genoma (posição 3-466) a partir do vetor contendo o pRL3 Ppa-prl-1 (tu92) alelo. </li><li> Digerir o produto de PCR com BamHI e PstI. </li><li> Ligadura o fragmento a BamHI / PstI digerida pL4440 alimentação RNAi vector 2. </li><li> Transformar o vector inserido em células competentes e cultivá-las em placas de LB media Ampicilina (50 mg / ml). </li><li> Selecione o vetor inserido com sucesso por PCR usando os primers T7. </li><li> Use o T7 ladeado produto da PCR contendo o prl-1 gene para fazer double-stranded RNA dsRNA), utilizando o BLOCO-IT RNAi síntese kit (Invitrogen). </li><li> A concentração dsRNA é melhor se&gt; 200 ng / mL, até 1 mg / mL para injeção. </li><li> Armazenar a -20 ° C. Após o descongelamento da mistura para injeção, girar o tubo a 14.000 rpm por 5 minutos para se livrar de partículas de detritos que possam entupir as injectioagulha n. </li></ol> 3. Microinjeção: Protocolo para a injeção de transgenes e / ou dsRNA <ol><li> Agulhas de injecção <ol><li> Definir o Narishige agulha extrator (modelo #: PC-10) de temperatura: <ol><li> Gire o botão de baixo para &quot;Aquecedor No.2&quot;. </li><li> Transformar o &quot;Adj Aquecedor No.2&quot;. botão até painel lê 55,0-60,0 ° C para a ponta da agulha cônicos de diferentes comprimentos. </li></ol></li><li> Gire o botão inferior de volta para a &quot;Etapa 1&quot; (Puxa a agulha em uma única etapa). </li><li> Força na agulha para dentro da câmara e verifique se ele é seguro. </li><li> Pressione o botão &quot;Iniciar&quot; (botão vermelho) e permitir agulha para ser puxado com todos os pesos (isso deve fazer duas agulhas idênticas em sentidos opostos). </li><li> Remova a agulha da câmara e guarde em uma placa de cultura de plástico seguros no lugar de Play-Doh para impedir que a poeira se acumula nas agulhas. </li></ol></li><li> Pads de montagem <ol><li> Em um tubo de centrífuga de 1,5 ml, fazer uma solutio Agar 2% Noblen, adicionando 0,02 g de Agar Noble para 1 ml de H 2 O. O agar pode ser armazenado a 4 ° C por até um ano. </li><li> Misturar bem e derreter agar em um bloco de aquecimento definida como&gt; 88 ° C. </li><li> Usando uma micropipeta de 1 ml, coloque uma gota de Agar 2% líquidos Noble para o meio da lâmina de vidro (Fisher, 12-544-F). </li><li> Flatten colocando outra lâmina de vidro em cima da queda. </li><li> Repita &quot;Step Drop&quot; até que haja uma camada de cinco vidro-slide. </li><li> Retire cada lâmina de vidro, deslizando o vidro desliza para fora uns dos outros. </li><li> Seca achatar pad ágar em lâminas de vidro em um forno a vácuo a 70 ° C por 4 horas durante a noite (ou à temperatura ambiente durante a noite). </li><li> Fazer almofadas de injeção múltipla e armazenar para uso futuro. </li></ol></li><li> Microinjeção em gônadas hermafroditas </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> Figura 1. Um desenho esquemático do P. pacificus anatnomia. As células nucleadas claras são células germinativas femininas (ovócitos) ea parte em cinza é o intestino. Apenas uma das gônadas distal anterior é mostrado, mas observe os dois gônadas distal cruzam dorsalmente perto mid-corpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens da microinjeção. (A) A ponta da agulha de injeção está em foco com a linha mais à direita da peça puxado capilar. Ao se tocar levemente a ponta da agulha para essa vantagem, a ponta da agulha deve quebrar, mantendo uma ponta afiada. (B) As inserções de agulhas no topo das gônadas logo acima da curvatura do intestino para a primeira injeção. (C) As inserções de agulhas para o fundo das gônadas logo abaixo da curvatura do intestino para a segunda injeção. <ol start="3"><li><ol><li> Certifique-se o contraste ea definição de corte DIC é ideal para visualizar as gônadas hermafroditas. </li><li> Carga 1,0-2,0 mL da mistura de injecção na puxadacapilar agulha. </li><li> Coloque a agulha no manipulador de microinjeção; medidores de pressão do tanque de nitrogênio deve ser ajustado para as condições ideais (10-20 psi para 0,5-1 seg). </li><li> Quebrar a ponta da agulha, tocando-a levemente a ponta de um tubo capilar fina puxada colocadas em uma lâmina (figura 2A). <ol><li> Agulha deslize breaker: a parte mais fina de um capilar puxado colocado sobre uma lâmina de vidro em uma gota de óleo </li></ol></li><li> Uma vez que a agulha está quebrada pode ser efectuado a uma posição de marcha lenta, enquanto você escolhe seu worm para o bloco (P. pacificus tem uma janela de 5 minutos para a injeção antes que seque-out e morrer). </li><li> Usando um prato cheio de vermes adultos jovens-J4, despeje óleo de parafina suficiente (pesado) apenas para cobrir todos os vermes na OP50 gramado bacteriana. </li><li> Escolha um verme e colocá-lo no bloco de injeção. </li><li> Coloque a lâmina de vidro com o worm no microscópio; gônadas posição do worm na direção da agulha e da vulva longe da necessidadele (Figura 2B, 2C). </li><li> Inferior a agulha para a posição da visão do microscópio. </li><li> Posição do top das gônadas ea agulha no mesmo plano focal (Figura 2B). </li><li> Poke o worm delicadamente e bomba na mistura da injeção; ooctyes separando para a ponta distal indicam uma injeção de sucesso (Para otimizar o transgene ou entrega dsRNA, você deve ver após a injecção de uma onda de expansão na gônada que continua até que seja próximo ao distal ponta). </li><li> Reposicionar a agulha para injetar a menor das gônadas e injeção de repetição, mas uma vez que esta gônada é gut sob a disseminação dos oócitos não vai ser visto e é, portanto, mais difícil de alcançar (Figura 2C). </li><li> Verme aparência normal indica uma injeção bem sucedida após a injeção, não deve haver qualquer gônadas danificado (salientes para fora da vulva ou estalou dentro da cavidade do corpo). </li><li> Coloque a agulha na posição de marcha lenta. </li><li> Prepare-se para resgatar o worm. </li><li> Adicionar umqueda (0,5 L) de tampão M9 sobre o bloco onde o verme injetado é colocado. </li><li> Usando algumas OP50 bactérias em sua escolha, toque o worm com o OP50, e ele deve ficar. Nós não usamos pipeta boca. </li><li> Coloque o worm na placa semeada com 50 pontos mL de OP50, 2-4 worms podem ser resgatados em placas desse tipo. </li></ol></li><li> Pós-injeção de armazenamento e triagem para Transgénese <ol><li> Loja injetado worms (P 0) a 20 ° C para a 4 dias para desovar e crescer F 1. </li><li> Worms tela no quarto dia de fenótipo selecionado (Para tela de busca por transgenia, para os animais rolando expressando o PPA-prl-1 marcador dominante). </li><li> Escolha único independente F 1 &#39;s animais com o fenótipo observado a nova placa de sementes e armazenamento a 25 ° C; esta temperatura favorece a formação de linhas estáveis ​​de F 1&#39; s. </li><li> F única de dois independentes F 1 linhas. Individuais F 2 </sub&gt; Linhas de ter taxas de transmissão semelhantes transgene. Nós muitas vezes obter&gt; 15 F 2 linhas por transformada F 1 animal. </li><li> Loja gerações posteriores a 25 ° C. </li><li> A taxa de transmissão de rolos normalmente permanece constante após a geração F 4, portanto, é necessária neste momento para determinar o nível de expressão do transgene alvo (PPA-egl-4p:: gfp) para cada linha individual. Expressão GFP pode não se correlacionar com o grau de penetrância do fenótipo rolo dominante. </li></ol></li><li> Pós-injeção de armazenamento e triagem de fenótipos RNAi <ol><li> Loja injetado worms (P 0) a 20 ° C para a 4 dias para leigos e crescer F 1. </li><li> Tela de um worms F no quarto dia de fenótipo selecionado (Para tela para RNAi fenótipo knockdown, procure fenótipos penetrante que pode estar associada com perda de atividade dos genes-alvo, no nosso caso a perda do PPA-prl-1 fenótipo). </li><li> Em nossa experiência, o fenótipo knockdown não-roller é perdida em&gt; 97% da F 2. </li></ol></li></ol> 4. Resultados representativos: 1. Resultado da Transgénese <table border="1"><tbody><tr><td> Sessão </td><td> Injetado P 0 </td><td> F 1 Rollers </td><td> F 2% transgênica </td><td> Transmissão% em média depois de F 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Linha 1) 0% (Linha 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (Linha 3) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Linha 4) 0% </td><td> NA </td&gt; </tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Linha 5) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table> * Rolo de um macho que não cruz; NA: Não aplicável . Tabela 3 Resultados do PS312 injetados com Ppa-egl-4p:: gfp (Sal eu digerida), pRL3 (rolo) (Pst I digerida), e gDNA PS312 (PstI e SalI digerida). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> Figura 3 (A) do tipo selvagem (B, C) ​​A estabilidade F 4 pRL3; Ppa-egl-4p:.: Gfp linhagem transgênica mostrando cabeça neurônio expressão GFP. 2. Resultado da interferência de RNA <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> Figura 4. RNA injetado PRL-1 mutantesmostrar knockdown completa de locomoção &quot;rolling&quot;. (A) PRL-1 rolo de ganho de função-mutante tu92. (B) &quot;derrubou&quot; PRL-1 mutante exibem postura do tipo selvagem normal e locomoção. (C) Injected PRL-1 (baixo) também tem mais corpo do que prl-1 mutante (em cima). (D) O corpo de mais injetados PRL-1 (baixo) também é maior do que o PS312 tipo selvagem (em cima). O fenótipo mais corpo também foi observado no rol-5 (sqt-1) knockdown de RNAi C. elegans N2 (dados não mostrados). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rolo </td><td> não-roll </td></tr><tr><td> A PRL-1 dsRNA (200 ng / mL) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> Prl B-1 dsRNA (1000 ng / mL) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> controle </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabela 4. </strong&gt; Resumo das Ppa-prl-1 dsRNA injeções. (A) [dsRNA] = 200 ng / mL; (B) [dsRNA] = 1000 ng / mL. P = 0,0019 e 0,041 pelo teste exato de Fisher, bicaudal, para 200 e 1000 ng injeções / mL, respectivamente.

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Populações de P. pacificus são encontrados em estreita associação com espécies de escaravelho vários besouro todo o mundo e é um modelo intermediário entre o nematóide de vida livre e nematóides parasitas. A força do P. pacificus como um organismo modelo emergente reside na integração de seus mapas genéticos e físicos que promovem o mapeamento posicional de mutantes isolados de telas imparcial frente genética (ou seja, não apenas por genes candidatos previamente caracterizada...

<table border="1"><tbody><tr><th> Produto: </th><th> Catalogo: </th><th> Fornecedor: </th></tr><tr><td> DMI3000 microscópio Injection </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinjetor manipulador (acionamento direto) </td><td> Narashige conjunta BC-3 bolas </td><td> Tritech Research </td></tr><tr><td> Agulha Puller </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Research </td></tr><tr><td> Microinjetor ™ All-Digital Sistema Multi-pressão </td><td> Narashige Minj-D </td><td> Tritech Research </td></tr><tr><td> GeneElute ™ Genomic DNA de mamíferos Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Clonagem Jet kit </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plasmídeo Miniprep kit </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Concentrador ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO Research </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO kit de transcrição ® </td><td> K3500-01 &amp; K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Agar Difco ™ Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher cientificamente </td></tr><tr><td> De vidro para microscópio cobrem (1,5 - 0,16 a 0,19 milímetros de espessura; Tamanho: 50 x 45mm) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Capilares de vidro (filamento) </td><td> 615000 </td><td> Sistemas AM </td></tr><tr><td> Óleo de parafina (Pesado) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

Embora seja cada vez mais acessíveis para os organismos modelo emergente para obter genomas completamente seqüenciados, ainda mais em profundidade a função do gene e análises de expressão por RNA de interferência e transgênese estáveis ​​permanecem limitados em muitas espécies, devido à anatomia e biologia celular molecular do organismo. Por exemplo, fora do grupo de Caenorhabditis coroa que inclui Caenorhabditis elegans 3, transmitidas de maneira estável em linhagens transgênicas não Caenorhabditis espécies não foram relatados neste filo especiosa (Nematoda), com exceção de Strongyloides stercoralis 4 e pacificus Pristionchus 5. Para facilitar a expansão do papel dos P. pacificus no estudo do desenvolvimento, evolução e comportamento 07/06, descrevemos aqui os métodos atuais de usar microinjeção para a tomada de animais transgênicos e gene knock down por RNAi. Como as gônadas de <em&gt; C. elegans e mais outros nematóides, as gônadas de P. pacificus é sincicial e capaz de incorporar DNA e RNA para os oócitos, quando entregue por microinjeção direta. Ao contrário de C. elegans no entanto, a herança transgene estável e expressão somática em P. pacificus requer a adição de DNA genômico digerido com endonucleases auto complementares até os confins da transgenes alvo e marcadores coinjection 5. A adição de DNA genômico transportadora é similar à exigência de expressão do transgene em Strongyloides stercoralis 4 e nas células germinativas de C. elegans. No entanto, não está claro se o requisito específico para o DNA dos animais genômica própria é porque P. pacificus soma é muito eficiente para o silenciamento não-complexo multi-cópia genes ou que arrays extracromossómicos em P. pacificus requerem seqüências genômicas para a montagem cinetocoro adequada durante a mitose. A migração ventral do (dois braçosdidelfo) em gônadas hermafroditas complica ainda mais a capacidade de injetar tanto em gônadas worms individuais 8. Nós também demonstrar o uso de microinjeção para knockdown um mutante dominante (rolo, tu92) injetando double-stranded RNA (dsRNA) para as gônadas para obter não rolando F uma progênie. Ao contrário de C. elegans, mas como a maioria dos outros nematóides, P. pacificus PS312 não é receptivo a RNAi sistêmica através de alimentação e de imersão e, portanto, dsRNA deve ser administrado por microinjeção para as gônadas sincicial. No presente estudo, esperamos para descrever o processo de microinjeção necessárias para transformar um promotor Ppa-egl-4:: GFP repórter de fusão e knockdown um rolo dominante PRL-1 (tu92) mutante em um protocolo visualmente informativo.

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Em organismos modelo, transgenia pode manipular as funções dos genes, enquanto RNAi pode knockdown transcrições de mRNA específicas 1-2. Este protocolo visa ilustrar as técnicas necessárias para introduzir DNA transmitidas de maneira estável e transitórios RNA de filamento duplo para o nematóide necromenic<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Para estudos em biologia evolutiva, de desenvolvimento e comportamentais.

RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

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Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K visualizações.  California State University. Em organismos modelo, transgenia pode manipular as funções dos genes, enquanto RNAi pode knockdown transcrições de mRNA específicas 1-2. Este protocolo visa ilustrar as técnicas necessárias para introduzir DNA transmitidas de maneira estável e transitórios RNA de filamento duplo para o nematóide necromenic Pristionchus pacificus Para estudos em biologia evolutiva, de desenvolvimento e comportamentais.

Vídeo: RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genética

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Ambiente

Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, morphology, and behavior drastically from aquatic larvae to terrestrial/aerial adults without pupal stage. Odonata adults have a well-developed color vision and show a remarkable diversity in body colors and patterns across sexes, stages, and species. While many ecological and behavioral studies on Odonata have been conducted, molecular genetic studies have been scarce mainly due to the difficulty in applying gene functional analysis to Odonata. For instance, RNA interference (RNAi) is less effective in the Odonata, as reported in the Lepidoptera. To overcome this problem, we successfully established an RNAi method combined with in vivo electroporation. Here we provide a detailed protocol including a video of the electroporation-mediated RNAi method as follows: preparation of larvae, species identification, preparation of dsRNA/siRNA solution and injection needles, ice-cold anesthesia of larvae, dsRNA/siRNA injection, in vivo electroporation, and individual rearing until adult emergence. The electroporation-mediated RNAi method is applicable to both damselflies (suborder Zygoptera) and dragonflies (suborder Anisoptera). In this protocol, we present the methods for the blue-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) as an example of damselfly species and the pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) as another example of dragonfly species. As representative examples, we show the results of RNAi targeting the melanin synthesis gene multicopper oxidase 2. This RNAi method will facilitate understanding of various gene functions involved in metamorphosis, morphogenesis, color pattern formation, and other biological features of Odonata. Moreover, this protocol may be generally applicable to non-model organisms in which RNAi is less effective in gene suppression due to the inefficiency and low penetrance.

We provide a detailed protocol for electroporation-mediated RNA interference in insects of the order Odonata (dragonflies and damselflies) using the blue-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) and the pied skimmer dragonfly (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Método de interferência de RNA mediado por eletroporação em Odonata

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, ...

Biologia do Desenvolvimento

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Microinjeção de cigarrinha de milho, Peregrinus maidis, Embriões para edição do genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Bioengenharia

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Um Método para microinjeção de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Biologia

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus

Resumo

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Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,