저자는 microinjection뿐만 아니라 익명의 검토에서 통찰력의 의견과 도움을 RJ 서머와 X 왕 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 NIH 부여 SC2GM089602에 의해 지원됩니다.

1. Transgenesis : DNA의 준비 <ol><li> 지배적인 공동 사출 표시 : pRL3 [PPA - prl - 1 (tu92)] pRL3 플라스미드 시각 성공적으로 변환 이벤트를 식별을위한 지배적인 공동 분사 마커입니다. 이 플라스미드는 밀접 C.에있는 sqt - 1 콜라겐 유전자와 관련된 PPA - prl - 1 유전자의 돌연변이 allele 지배 (tu92)에 대한 인코딩 elegans와 벌레의 몸은 축 1.5을 따라 시계 방향으로 왜곡 움직임에 wildtype sinusoidal 운동을 변환합니다. 변형 동물은 C.에 사용되는 인기있는 지배적인 선택 마커 rol - 6 (su1006)과 매우 유사 지난 20 년 동안 elegans. </li><li> 대상 기자 transgene : PPA - egl - 4P : : GFP 관심 유전자는 순서 9 코딩 GFP에 transcriptionally 또는 translationally 연결될 수 있습니다. 본 연구에서는 PPA - egl - 4promoter : GFP (egl - 4, cGMP 의존 단백질 키나제)이 사용되었습니다번역의 시작 상류 2 이하 단편은 P.의 GFP 발현을 부여 할 수있다면 D는 확인하기 pacificus PS312. 이 GFP 벡터 수정된와 GFP 코딩 영역이 포함되어 있습니다 introns 및 다목적 PPA - RPL - 23 친절 Xiaoyue 왕과 랄프 J. 서머 (최대 - 플랑크 연구소, Tuebingen, 독일, EU)에서 제공하는 3 &#39;UTR 터미네이터 5. </li><li> 게놈 DNA : PS312 wildtype P.의 추가 pacificus PS312의 게놈의 DNA는 특히 자신의 F이 자손 5 유전자 변형 F 한 동물에서 안정적인 transgene 상속을 얻기 위해 필요합니다. 안정 F 2 유전자 변형 라인에서 관찰 비슷한 : 게놈 DNA가 두 transgenes (GFP 기자 : 공동 분사 마커 pRL - 3과 PPA - egl - 4P)로 복잡한 추가 염색체 배열을 형성하는 경우는 아직 확실하지 않습니다 C. elegans 3. 그러나, 요구 사항은 동일한 cohesi를 공유할 수있는 게놈 DNA와 transgenes을적 overhangs 강력 호스트 세포가 적절한 DNA 전송 (gDNA는 시그마 G1N10 키트를 사용 준비)를 인식할 수 복잡한 추가 - 염색체 배열의 형성을 제안합니다. </li><li> DNA의 소화 : GFP 벡터 DNA와 공동 분사 마커 pRL3과 PS312 gDNA와 호환 끈적끈적한 overhangs를 생성하려면 다음과 같이 제한 효소는 PPA - egl - 4P을 linearize하는 데 사용됩니다. vortexing하지, 도청으로 섞는다. 37 한 시간 동안 품어 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 μg </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> PstI (10 U / μl) </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> 총 : </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> PPA - egl - 4P : : GFP </td><td> 4 μg </td></tr><tr><td> 10X 버퍼 </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> SalI (10 U / μl) </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> 총 : </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> gDNA PS312 </td><td> 10 μg </td></tr><tr><td> 10X 버퍼 </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> PST I 및 샐 I (10 U / μl) </td><td> μl 8 </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> 총 : </td><td> 100 μl </td></tr></tbody></table> 표 1. 제한 효소 다이제스트를위한 혼합. <ol start="5"><li> DNA의 석출 및 준비 <ol><li> 1시 10분 아세트산 나트륨 (3 M NaCOOCH 3 산도 5.2)와 소화에 제품에 100 % 에탄올의 2.5X 볼륨을 추가, 펠렛을 쉽게 볼 수 20 NG / 글리코겐의 μl를 추가합니다. </li><li> 4 15 분 동안 14,000 rpm으로 원심 ° C. </li><li> 티피로 뜨는을 가만히 따르다천천히 NG 원심 튜브 거꾸로 후, 티슈에 감청 펠렛은 튜브의 하단 모서리에 안전 있는지와 에탄올 무료 제작. </li><li> 75 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li><li> 즉시 4 5 분간 14,000 rpm으로 회전 ° C. </li><li> 천천히 거꾸로 원심 튜브를 팁 다음 펠렛은 튜브의 하단 모서리에 안전 있는지와 에탄올 무료 만드는 조직 종이에 그것을 감청하여 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 25-30에서 5 분간 14,000 rpm으로 진공 원심 분리기에 드라이 펠렛 ° C, 건조하고 에탄올의 완전 무료까지. </li><li> TE 또는 멸균 DH 2 O 30 μl를 추가하고 ° C 믹싱 잠시 전에 와동 4에서 하룻밤 둡니다. </li><li> 표 2는 분사 각 정화 DNA에서 사출 혼합물을 만드는 방법을 설명합니다. </li><li> -20 ° C.에 저장 주사에 대한 혼합물을 해동 후, 수 파편 입자를 제거하기 위해 5 분간 14,000 rpm으로 튜브를 다운 스핀주사 바늘을 방해할. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 유전 물질 </td><td> 집중 </td></tr><tr><td> PPA - egl - 4P : GFP (SalI) </td><td> &gt; 5 μl / NG (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 NG / μl </td></tr><tr><td> gDNA PS312 (PstI + SalI) </td><td> &gt; 60 NG / μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> 총 : </td><td> 30 μl </td></tr></tbody></table> 표 2. PPA - prl - 1 사출 혼합물 2. RNA 간섭 : 체외 더블 좌초 RNA 합성에 <ol><li> 관심의 유전자를 증폭하기 위해 PCR을 사용합니다. RHL091 5&#39; - agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC - 3 &#39;(BamHI 사이트) 및 5&#39; - RHL092 tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG - 3&#39;(PstI 사이트)가 464 BP의 게놈의 파편을 증폭하는 데 사용되었다PPA - prl - 1 (tu92) allele을 포함하고있는 pRL3 벡터에서 ment (위치 3-466). </li><li> BamHI과 PstI로 PCR 제품을 다이제스트. </li><li> BamHI / PstI pL4440 RNAi 수유 벡터 2 소화하기 위해 조각을 Ligate. </li><li> 관할 세포에 삽입된 벡터를 변환하고 암피실린 LB 미디어 플레이트 (50 μg / ML)에 그들을 성장. </li><li> T7 primers를 사용하여 PCR하여 성공적으로 삽입 벡터를 선택합니다. </li><li> BLOCK - IT RNAi 합성 키트 (Invitrogen)를 사용)를 두 번 좌초 RNA dsRNA를 만들기 위해 prl - 1 유전자를 포함하는 PCR 제품을 어귀 T7을 사용합니다. </li><li> 경우 dsRNA 농도는 가장 최대 1 μg / μl 주입에 대한&gt; 200 NG / μl. </li><li> -20 ° C.에 저장 주사에 대한 혼합물을 해동 후 주사 바늘을 방해할 수 파편 입자를 제거하기 위해 5 분간 14,000 rpm으로 튜브를 다운 스핀. </li></ol> 3. Microinjection : transgenes 및 / 또는 dsRNA의 주입을위한 프로토콜 <ol><li> 주입 바늘 <ol><li> 온도 : Narishige 바늘 풀러를 (PC - 10 모델 #) 설정 <ol><li> 에 아래 손잡이를 돌려 &quot;2 번 히터.&quot; </li><li> &quot;제 2의 히터 형용사를.&quot;회전 패널 때까지 손잡이는 55.0-60.0을 읽고 ° C 길이를 변화의 테이퍼 니들 팁하십시오. </li></ol></li><li> (한 번에 주사를 했었어요) &quot;1 단계&quot;로 다시 아래쪽 손잡이를 돌립니다. </li><li> 의회에 바늘을로드하고 안전한지 확인하십시오. </li><li> &#39;시작&#39;버튼 (빨간 버튼)을 누르면 바늘이 모든 가중치 (이것은 반대 방향으로 두 개의 동일한 바늘을 만들어야합니다)를 뽑아 될 수 있습니다. </li><li> 바늘에 축적에서 먼지를 방지하기 위해 플레이 - Doh로 장소에 안전하게 플라스틱 문화 접시에있는 챔버와 가게에서 바늘을 제거합니다. </li></ol></li><li> 마운트 패드 <ol><li> 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에서 H 2 O. 1 ML에 귀족 한천의 0.02 g를 추가하여 2 % 한천 귀족의 솔루션을 한천은 ° C 년간 최대 4에 저장할 수 있습니다. </li><li> 철저하게 믹스 앤&gt; 88 ° C.로 설정된 열 블록에 한천을 녹여 </li><li> 1 ML micropipette 사용 (피셔, 12-544 - F) 유리 슬라이드의 중간에 액체 2퍼센트 귀족 한천의 드롭을 배치. </li><li> 드롭 위에 또 다른 유리 슬라이드를 삽입하여 평평하게. </li><li> 다섯 유리 슬라이드의 레이어가있을 때까지 &quot;드롭 단계&quot;를 반복합니다. </li><li> 유리 슬라이딩하여 각 유리 슬라이드를 제거하는 것은 서로 떨어져 슬라이드. </li><li> 70 진공 오븐에 유리 슬라이드에 한천 패드를 평평하게 건조 ° 하루 4 시간 동안 C (또는 실온에서 하룻밤). </li><li> 나중에 사용하기 위해 다중 사출 패드하고 저장하십시오. </li></ol></li><li> hermaphroditic 생식선에 Microinjection </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> 그림 1. P.의 구조 도면 pacificus의 해부학. 맑은 nucleated 세포가 여성의 배아 세포 (oocytes)과 회색 음영 부분의 대장입니다. 오직 한 말초 앞쪽에 생식선이 표시됩니다하지만 두 말초 생식선 중순 시체 근처 dorsally 서로 교차 확인할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> 그림 2. microinjection의 이미지. (A) 주사 바늘 끝이 가져온 모세관 조각의 맨 오른쪽 라인 초점을 맞추고 있습니다. 여전히 날카로운 지점을 유지하면서 가볍게 그 가장자리에 바늘의 팁을 감동으로 바늘 끝은 휴식한다. (B) 상단에 바늘 삽입은 첫 번째 주사에 대한 창자의 곡률 위에 생식선. (C) 아래로 바늘을 삽입 두 번째 주사에 딱 내장 곡률 아래 생식선. <ol start="3"><li><ol><li> 명암과 전단 DIC 설정 남녀 추니 생식선을 볼 이상적입니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 뽑아 모세관 바늘로 주입 혼합물의 1.0-2.0 μl를로드합니다. </li><li> microinjection의 조작하는 사람에 바늘을 장소, 질소 탱크의 압력 게이지가 이상적인 조건을 설정해야합니다 (10-20 PSI0.5-1 초)을. </li><li> 슬라이드 (그림 2A)에 위치 얇게 뽑아 모세관 튜브의 가장자리에 약간 그것을 만져 바늘 끝을 깰. <ol><li> 니들 차단기 슬라이드 : 가져온 기름 한 방울의 유리 슬라이드에 배치 모세관의 얇은 부분 </li></ol></li><li> 바늘이 부러되면 (P. pacificus들은 드라이 아웃하기 전에 주사를위한 5 분 창을 가지고 다이) 패드로 벌레를 선택하는 동안 그것은 유휴 위치에 자리 수 있습니다. </li><li> J4 - 젊은 성인 웜 가득 접시를 사용하여 OP50 세균 잔디에있는 모든 벌레를 커버 단지 충분한 파라핀 오일을 (무거운) 부어. </li><li> 벌레를 선택하고 사출 패드에 놓으십시오. </li><li> 위치 바늘과 거리 바늘 (그림 2B, 2C)에서 산문의 방향으로 벌레의 생식선, 현미경에 웜에 유리 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 현미경보기의 위치에 바늘을 낮춥니다. </li><li> 같은 초점 평면 (그림 2B)에서 최고의 생식선과 바늘을 위치.</li><li> 부드럽게 벌레를 찌를와 사출 혼합물의 펌프, 말초 팁으로 분리 ooctyes은 (transgene 또는 dsRNA 전달을 최적화하기 위해 성공적인 주입을 나타냅니다, 당신은 주사시 이것은 말초 가까이 때까지 계속 생식선의 확장의 물결을 볼 수 팁). </li><li> 아래 생식선과 반복 주사로 주입 바늘을 조정,이 생식선은 oocytes의 확산을 볼 수 없습니다 용기를 아래에 있으며 (그림 2C) 달성 따라서 더 어렵습니다 그러나 때문이다. </li><li> 일반 찾고 웜은 주사 후 성공적으로 주사를 나타냅니다, (산문에서 밖으로 튀어나온 또는 신체 캐비티 내부 쫌) 손상 생식선 없을 것입니다. </li><li> 유휴 위치에 바늘을 돌려 놓습니다. </li><li> 벌레를 구출하기 위해 준비합니다. </li><li> 주입된 벌레가 위치 패드에 M9 버퍼의 한 방울 (0.5 μl)를 추가합니다. </li><li> 귀하의 선택에 몇 가지 OP50 박테리아를 사용하여 OP50과 벌레를 터치하고, 그것은 스틱해야합니다. WE는 입을 피펫을 사용하지 마십시오. </li><li> OP50 50 μl 명소와 씨앗을 접시에 벌레를 놓으십시오, 2-4 웜는 같은 접시에 구조될 수 있습니다. </li></ol></li><li> Transgenesis에 대한 사후 분사 스토리지 및 심사 <ol><li> 상점 20시 (P 0) 벌레를 주입 ° C 알을 낳기와 F 1 자라 ~ 4 일 동안. </li><li> 선택한 표현형 (PPA - prl - 1 지배적인 마커를 표현 압연 동물 transgenesis, 검색 화면)에 대한 네 번째 날에 화면 웜. </li><li> 하나의 독립 F 1 선택 &#39;25 새로운 씨앗 판 및 저장하기 위해 관찰과 표현형의 동물 ° C,이 온도가 F 1에서 안정적인 라인의 형성 격려&#39;s을 (를) </li><li> 독립 F 1 라인에서 싱글 F 2. 개별 F 2 라인은 비슷 transgene 전송 속도 있습니다. 우리는 종종&gt; 15 얻을 변형 F 한 동물 당 F 2 라인. </li><li> 25 ° C.에 후속 세대를 저장 </li><html><li> 각 라인에 대한 : 롤러의 전송 속도는 대개 따라서 그것은 대상 transgene의 표현 수준을 (GFP : PPA - egl - 4P) 결정하기 위해이 시간에 필요합니다, F 4 세대 이후 지속적으로 남아 있습니다. GFP 표현은 지배 롤러 표현형의 penetrance의 범위와 연관되지 않을 수 있습니다. </li></ol></li><li> RNAi의 phenotypes에 대한 사후 분사 스토리지 및 심사 <ol><li> 상점 20시 (P 0) 벌레를 주입 ° C 누워 F 1 성장할 ~ 4 일 동안. </li><li> 화면 F 선택한 표현형 (RNAi의 최저의 표현형, PPA - prl - 1 표현형의 손실의 경우, 대상 유전자 활동의 손실과 관련있을 수 있습니다 penetrant phenotypes에 대한 검색 화면)에 대한 네번째 일 1 웜. </li><li> 우리의 경험에서가 아닌 롤러 최저의 표현형은 F 2&gt; 97%에서 손실됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 대표 결과 : <html> Transgenesis의 P &quot;&gt; 1. 결과 <table border="1"><tbody><tr><td> 세션 </td><td> P 0 주입된 </td><td> F 1 롤러 </td><td> % F 유전자 변형이 </td><td> F 2 이후 평균 % 전송 </td></tr><tr><td> 일 </td><td> 60 </td><td> 이 </td><td> (1 호선) 0 % (라인 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (3 행) 0 % </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 일 </td><td> (4 호선) 0 % </td><td> NA </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 일 </td><td> (5 호선) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table>내용 &quot;&gt; 크로스 않았 * 남자 롤러, NA : 해당 사항 없음 : GFP (SAL 나는 소화), pRL3 (롤러) (PST 나는 소화) 및 gDNA PS312 (PstI 및 SalI이 소화). PPA - egl - 4P로 주입 PS312의 표 3 결과. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> 그림 3 (A) wildtype (B, C) ​​안정 F 4 pRL3, PPA - egl - 4P :. : 머리 신경 세포 GFP 발현을 보여주는 GFP 유전자 변형 라인. 2. RNA 간섭의 결과 <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> 그림 4. RNA는 prl - 1 돌연변이가 &quot;롤링&quot;운동의 완전한 분해를 보여줍니다. (A) prl - 1 롤러 이득의 기능 돌연변이 tu92을 주입. (B) prl - 1 돌연변이 전시 정상 wildtype의 자세와 운동 &quot;을 무너 뜨 렸어.&quot; (C) prl - 1 (바닥)도이 이상 B 약이라고 속이고보다 ody prl - 1 돌연변이 (위). (D) 주입 prl - 1 (하단)의 긴 본문 wildtype PS312 (위) 이상도있다. 더 이상 신체 표현형 또한 rol - 5 C.의 (sqt - 1) RNAi의 최저에서 관찰되었다 elegans N2 (데이터가 표시되지 않음). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 롤 </td><td> 비 롤 </td></tr><tr><td> prl - 1 dsRNA (200 μl / NG) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B prl - 1 dsRNA (μl / NG 1000) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> 제어 </td><td> 20 </td><td> 이 </td></tr></tbody></table> 표 4. PPA - prl - 1 dsRNA 주사의 요약. (A) [dsRNA] = 200 μl / NG, (B) [dsRNA] = 1000 μl / NG. P = 각각 200 1000 μl / NG 주사에 대한 두 개의 꼬리 피셔의 정확한 테스트,,,에 의해 0.0019 및 0.041.

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	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

P. pacificus의 인구는 전세계 다양한 풍뎅이 딱정벌레의 종들과 긴밀한 연관에서 발견 무료 생활 기생 nematodes 사이의 중간 모델 선충류집니다. P.의 강도 새로운 모델 유기체로 pacificus은 불편 앞으로 유전 화면에서 격리 돌연변이의 위치 매핑을 증진의 유전자와 물리적지도의 통합에 누우면 (즉,뿐만 아니라 이전에 C. elegans의 특징 후보 유전자에 대한) 6,10. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 제품 : </th><th> 카탈로그 # : </th><th> 공급 : </th></tr><tr><td> DMI3000 사출 현미경 </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinjector를 조작하는 사람 (직접 운전) </td><td> Narashige BC - 3 볼 조인트 </td><td> Tritech 연구 </td></tr><tr><td> 니들 풀러 </td><td> Narashige PC - 10 </td><td> Tritech 연구 </td></tr><tr><td> MicroInjector ™ 모든 - 디지털 다중 압력 시스템 </td><td> Narashige MINJ - D </td><td> Tritech 연구 </td></tr><tr><td> GeneElute ™ 포유류의 게놈 DNA Miniprep 키트 </td><td> G1N70 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> pJet 복제 제트 키트 </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET 플라스미드 Miniprep 키트 </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA 클린 ​​&amp; 농축기 ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO 연구 </td></tr><tr><td> BLOCK - IT ™는 RNAi TOPO ®의 전사 키트 </td><td> K3500 - 01 및 K3650 - 0일 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ 한천 귀족 </td><td> DF0142 - 15-2 </td><td> 피셔 Scientifi </td></tr><tr><td> 현미경 덮개 유리 (1.5-0.16에 0.19mm 두께, 크기 : 50 X 45mm) </td><td> 12-554 - F </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> 유리 모세관 (필라멘트) </td><td> 615,000 </td><td> AM 시스템 </td></tr><tr><td> 파라핀 오일 (중공업) </td><td> O122 - 1 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386 - 500 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> 나이 HPO 4 </td><td> AC20651 - 5000 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80 - 500 </td><td> 피셔 과학 </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

그것은 RNA 간섭하고 안정적​​인 transgenesis에 의해 유전자의 기능과 표현 분석 - 깊이에서 추가, 완전히 합성 genomes를 얻을 특정 해부와 유기체의 분자 세포 생물학으로 인해 많은 종류에 제한 남아 있습니다.하는 새로운 모델 생물에 대해 점점 더 저렴한 있지만 예를 들어, 안정되지 않은 Caenorhabditis 종의 유전자 변형 라인을 전송 Caenorhabditis elegans 3 포함 왕관 그룹 Caenorhabditis 외부 Strongyloides stercoralis 4 Pristionchus pacificus 5를 제외하고,이 그럴듯한 문 (Nematoda)에보고되지 않았습니다. P.의 역할 확대를 촉진하기 위해 개발, 진화, 그리고 행동 6-7의 연구 pacificus, 우리는 여기에 유전자 변형 동물과 gene RNAi에 의해 아래로 노크를 만드는 microinjection을 사용하는 현재의 방법을 설명합니다. 의 생식​​선과 마찬가지로 <em&gt; C. elegans와 대부분의 다른 nematodes, P.의 생식선 pacificus은 syncitial 직접 microinjection에 의해 전달되는 oocytes에 DNA와 RNA를 통합이 가능합니다. C. 달리 P.의 elegans 그러나 안정 transgene 상속 및 체세포 표현 pacificus은 대상 transgenes 및 coinjection 마커 5 끝까지 보완 endonucleases와 소화 자기 게놈의 DNA를 추가할 필요합니다. 캐리어 게놈의 DNA의 Strongyloides stercoralis 또한 4와 C의 배아 세포에서 transgene 표현에 대한 요구 사항과 비슷합니다 elegans. 동물들의 자신의 게놈의 DNA에 대한 특정 요구 사항이있는 경우 그러나, 그것은 명확하지 않기 때문에 P. pacificus 소마이 아닌 복잡한 다중 복사 유전자를 입을 또는 매우 효율적입니다 P.에 extrachromosomal 배열 pacificus은 유사 분열하는 동안 적절한 kinetochore 조립에 대한 게놈 시퀀스가 필요합니다. 두 무장 (의 복부 마이 그 레이션광고에 나온것에 didelphic) 생식선 추가 개별 웜 8 양쪽 생식선을 삽입하는 능력을 복잡. 우리는 또한 최저의 비 롤링 F 1 자손을 얻기 위해 생식선에 두 번 좌초 RNA (dsRNA)를 주사하여 지배적인 돌연변이 (롤러, tu92)에 microinjection의 사용을 보여줍니다. C. 달리 elegans지만, 대부분의 다른 nematodes처럼, P. pacificus PS312은 먹이와 몸으로 따라서 dsRNA가 syncitial 생식선에 microinjection에 의해 관리되어야합니다 통해 체계적 RNAi에 수용하지 않습니다. 현재이 연구에서 우리는 PPA - egl - 4 모터를 변환하는 데 필요한 microinjection 과정을 설명하도록하겠습니다 : : GFP에 융합 기자와 최저의 지배 롤러 prl - 1 (tu92) 시각 정보를 프로토콜에 돌연변이.

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi는 특정 mRNA의 성적 1-2 최저 수있을 때 모델 생물에서 transgenesis는 유전자 기능을 조작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 necromenic 선충류에 안정적으로 전송 DNA와 과도를 두 번 좌초 RNA를 소개하는 데 필요한 기술을 설명하는 것을 목표로<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; 진화 발달, 행동 생물학의 연구.

RNAi는 Necromenic 선충류의 Microinjection에 의해 유전자 최저 및 Transgenesis을 중재 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K 조회수.  California State University. RNAi는 특정 mRNA의 성적 1-2 최저 수있을 때 모델 생물에서 transgenesis는 유전자 기능을 조작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 necromenic 선충류에 안정적으로 전송 DNA와 과도를 두 번 좌초 RNA를 소개하는 데 필요한 기술을 설명하는 것을 목표로 Pristionchus pacificus 진화 발달, 행동 생물학의 연구.

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Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

현지화된 RNAi과 약용 거머리의 이소성 유전자 발현

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

연구

생물학

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

RNAi Effectors의 세균성 배송 : Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...