Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
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Die Autoren sind sehr dankbar, RJ Sommer und X Wang für die Unterstützung bei Mikroinjektion, sowie aufschlussreiche Kommentare von den anonymen Gutachtern. Diese Arbeit wird durch NIH SC2GM089602 unterstützt.

1. Transgenese: DNA-Präparation <ol><li> Dominant Co-Injektion Marker: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)] Die pRL3 Plasmid ist ein dominantes Co-Injektion Marker für visuell identifiziert erfolgreiche Transformation Veranstaltungen. Dieses Plasmid kodiert für eine dominante mutierte Allel (tu92) des PPA-prl-1-Gen eng mit der SQT-1 Kollagen-Gens in C. im Zusammenhang elegans und verwandelt den Wildtyp sinusförmige Bewegung in Uhrzeigersinn drehen Bewegungen entlang der Wurm den Körper Achse 1,5. Die transformierten Tier ist sehr ähnlich wie die beliebten dominanten Selektionsmarker rol-6 (su1006) in C eingesetzt elegans in den vergangenen 20 Jahren. </li><li> Ziel Reporter-Transgen: PPA-EGL-4P:: gfp Ein Gen von Interesse kann transkriptionell oder translatorisch zu einem GFP kodierende Sequenz 9 verbunden werden. In dieser Studie, die PPA-EGL-4promoter:: gfp (EGL-4, cGMP-abhängigen Proteinkinase) was verwendet werden, um festzustellen, ob ein 2 kb-Fragment vor dem Start der Übersetzung kann GFP-Expression in P. verleihen pacificus PS312. Dieses GFP-Vektor enthält eine GFP kodierende Region mit modifiziertem Introns und der Mehrzweck-PPA-rpl-23 3 &#39;UTR Terminator 5 freundlicherweise von Xiaoyue Wang und Ralf J. Sommer (Max-Planck-Institut, Tübingen, Deutschland, EU) zur Verfügung gestellt. </li><li> Genomic DNA: PS312 Die Zugabe von Wildtyp P. pacificus PS312 genomische DNA ist erforderlich, um stabile Transgenexpression Erbe zu erhalten, insbesondere von transgenen F 1 Tiere, um ihre F 2 Nachkommen 5. Es ist noch nicht sicher, ob die genomische DNA bildet komplexe extrachromosomale Arrays mit den beiden Transgene (die Co-Injektion Marker PRL-3 und der PPA-EGL-4P:: gfp-Reporter), ähnlich denen in stabilen F 2 transgenen Linien beobachtet C. elegans 3. Um jedoch die Anforderung haben die genomische DNA und Transgene zu identica Aktienl Zusammenhalt Überhänge stark darauf hin, die Bildung von komplexen extra-chromosomale Arrays der Wirtszellen für die richtige DNA-Übertragung (gDNA hergestellt unter Verwendung von Sigma G1N10 Kit) erkennen kann. </li><li> DNA-Spaltung Restriktionsenzyme werden verwendet, um die PPA-EGL-4p linearisieren:: GFP-Vektor-DNA und klebrig Überhänge mit den Co-Injektion Marker pRL3 und PS312 gDNA zu produzieren. Mix durch Antippen, nicht vortexen. Inkubieren für eine Stunde bei 37 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> PstI (10 U / ul) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4P:: gfp </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10x Puffer </td&gt; <td> 10 pl </td></tr><tr><td> SalI (10 U / ul) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> 10x Puffer </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> Pst I und Sal I (10 U / ul) </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Mixture für Restriktionsenzymverdau. <ol start="5"><li> DNA-Fällung und Vorbereitung <ol><li> Add 01.10 Natriumacetat (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) und 2,5-fache des Volumens von 100% Ethanol zum verdaut Produkt, fügen Sie 20 ng / ul von Glykogen, um zu sehen Pellet leichter. </li><li> Zentrifuge bei14.000 rpm für 15 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand durch Kippen langsam dem Zentrifugenröhrchen auf den Kopf und dann darauf tippen auf ein Tissue-Papier, um sicherzustellen, dass die Pellets sicher ist in der unteren Ecke des Rohres und frei von Ethanol. </li><li> 1 ml 75% Ethanol. </li><li> Unmittelbar bei 14.000 rpm Spin 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand durch langsames Kippen der Zentrifugenröhrchen auf den Kopf und dann darauf tippen auf ein Tissue-Papier darauf achten, dass das Pellet es in der unteren Ecke des Rohres sicher und frei von Ethanol. </li><li> Dry Pellet im Vakuum Zentrifuge bei 14.000 rpm für 5 Minuten bei 25-30 ° C, bis es trocken und völlig frei von Ethanol. </li><li> Add 30 ul TE oder sterilem dH 2 O und lassen über Nacht bei 4 ° C vor dem Mischen kurz mit einem Vortex. </li><li> Tabelle 2 beschreibt, wie die Injektion Mischung aus jedem gereinigten DNA zur Injektion zu schaffen. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. Nach dem Auftauen die Mischung inspritzung, Spin-down der Röhre bei 14.000 rpm für 5 Minuten, um Schmutzpartikel, dass die Injektionsnadel verstopfen können zu befreien. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Genetisches Material </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4P:: gfp (SalI) </td><td> &gt; 5 ng / ul (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 (PstI + SalI) </td><td> &gt; 60 ng / ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 30 mu l </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. PPA-prl-1 Injektion Mischung 2. RNA-Interferenz: In vitro doppelsträngige RNA-Synthese <ol><li> Verwenden PCR das Gen von Interesse zu verstärken. RHL091 5&#39;-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 &#39;(BamHI) und RHL092 5&#39;-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 &#39;(PstI-Stelle) wurden verwendet, um eine 464 bp genomischen Fragment (Position 3-466) aus dem pRL3 Vektor, der die PPA-prl-1 (tu92) Allel zu verstärken. </li><li> Digest des PCR-Produkts mit BamHI und PstI. </li><li> Ligieren des Fragments an BamHI / PstI pL4440 RNAi Fütterung Vektor 2 verdaut. </li><li> Transformieren Sie die eingefügten Vektors in kompetente Zellen wachsen und sie auf Ampicillin LB-Medium-Platten (50 ug / ml). </li><li> Wählen Sie den erfolgreich eingeführten Vektors mittels PCR unter Verwendung der T7-Primer. </li><li> Verwenden Sie die T7 flankiert PCR-Produkt mit dem prl-1-Gen auf doppelsträngige RNA-dsRNA zu machen) mit der BLOCK-IT RNAi-Synthese-Kit (Invitrogen). </li><li> Die dsRNA-Konzentration ist am besten, wenn&gt; 200 ng / ul, bis zu 1 ug / ul zur Injektion. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. Nach dem Auftauen der Mischung zur Injektion, Spin-down der Röhre bei 14.000 rpm für 5 Minuten auf der Schmutzpartikel, dass die injectio verstopfen kann losn Nadel. </li></ol> 3. Mikroinjektion: Protokoll für die Injektion von Transgenen und / oder dsRNA <ol><li> Injektionsnadeln <ol><li> Stellen Sie die Narishige Nadel-Abzieher (Modell #: PC-10) Temperatur: <ol><li> Schalten Sie unten Knopf auf &quot;No.2 Heater&quot;. </li><li> Drehen Sie den &quot;No.2 Heater Adj.&quot; Knopf bis Panel liest 55,0-60,0 ° C für konische Nadelspitze mit unterschiedlichen Längen. </li></ol></li><li> Drehen Sie den unteren Knopf zurück zu &quot;Schritt 1&quot; (Pulls Nadel in einem Schritt). </li><li> Laden Nadel in die Kammer und stellen Sie sicher, dass es sicher ist. </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; (rote Taste) und erlauben Nadel mit allen Gewichten (dies sollte zwei identischen Nadeln in entgegengesetzte Richtungen zu machen) gezogen werden. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Kammer und speichern in einer Kunststoff-Platte Kultur anstelle von Play-Doh gesichert, dass Staub auf den Nadeln zu verhindern. </li></ol></li><li> Montage-Pads <ol><li> In einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, machen Sie eine 2% Edle Agar solution durch Zugabe von 0,02 g Noble-Agar zu 1 ml H 2 O. Der Agar kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Jahr. </li><li> Nach gründlichem Mischen und Schmelzen Agar in einem Heizblock auf&gt; 88 ° C. </li><li> Mit einer 1 ml Mikropipette einen Tropfen Flüssigkeit 2% Edle Agar in die Mitte der Glasplatte (Fisher, 12 bis 544-F). </li><li> Flatten, indem eine andere Glasplatte auf der Oberseite des Tropfens. </li><li> Wiederholen Sie die &quot;Drop Step&quot;, bis es eine Schicht von fünf Objektträger aus Glas. </li><li> Nehmen Sie jede Glasplatte, indem Sie den Glasträger sich gegenseitig. </li><li> Dry abflachen Agar-Pad auf Glasträger in einem Vakuumofen bei 70 ° C für 4 Stunden bis über Nacht (oder über Nacht bei Raumtemperatur). </li><li> Machen Sie mehrere Injection Pads und speichern für zukünftige Verwendung. </li></ol></li><li> Mikroinjektion in zwittrigen Gonaden </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> Abbildung 1. Eine schematische Zeichnung des P. pacificus anatschaft. Die klare kernhaltigen Zellen sind weibliche Keimzellen (Eizellen) und die grau unterlegten Teil ist der Darm. Nur eine distale vordere Gonaden wird angezeigt, aber bemerken die beiden distalen Gonaden einander kreuzen dorsal nahe Mitte Körper. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bilder der Mikroinjektion. (A) Die Injektion Nadelspitze im Fokus mit der rechten Linie der Kapillare gezogen Stück. Durch leichtes Berühren der Spitze der Nadel, um die Kante, sollte die Nadelspitze zu brechen unter Beibehaltung einer scharfen Spitze. (B) Die Nadel-Einsätze in den oberen Gonade knapp über den Darm Krümmung für die erste Injektion. (C) Die Nadel-Einsätze in den unteren Gonaden knapp unterhalb der gut Krümmung für die zweite Injektion. <ol start="3"><li><ol><li> Achten Sie darauf, den Kontrast und die DIC Scheren Einstellung ist ideal für das Betrachten des Hermaphroditen Keimdrüsen. </li><li> Laden 1,0-2,0 ul der Injektion Mischung in die gezogenKapillarnadel. </li><li> Stecken Sie die Nadel in die Mikroinjektion Manipulator, Manometer der Stickstoff-Tank sollte, um ideale Bedingungen (10-20 psi für 0,5-1 sec) eingestellt werden. </li><li> Break the Nadelspitze durch Berühren leicht auf Rand einer dünn gezogen Kapillare auf einer Folie (Abbildung 2A) platziert. <ol><li> Needle Leistungsschalter slide: der dünnste Teil einer Kapillare gezogen platziert auf einem Glasträger in einem Tropfen Öl </li></ol></li><li> Sobald die Nadel gebrochen ist, kann vorhanden sein, um eine Ruhelage, während Sie Ihre Wurm holen, um das Pad (P. pacificus eine 5 Minuten-Fenster für die Injektion, bevor sie trocken-out und sterben). </li><li> Mit einem Teller voller J4-jungen erwachsenen Würmer, pour genug Paraffinöl (schwer), nur alle die Würmer in OP50 Bakterienrasen. </li><li> Wählen Sie ein Wurm und legen Sie es auf die Injektion Pad. </li><li> Legen Sie die Objektträger aus Glas mit dem Wurm unter dem Mikroskop; Position des Wurms Gonade in Richtung der Nadel und der Vulva weg von der Notwendigkeitle (Abb. 2B, 2C). </li><li> Senken Sie die Nadel in die Position des Mikroskops zu sehen. </li><li> Position der Spitze Gonade und die Nadel in die gleiche Bildebene (Abbildung 2B). </li><li> Poke der Wurm sanft und Pumpe in der Injektion Mischung; ooctyes Trennung in Richtung der distalen Spitze deuten auf eine erfolgreiche Injektion (Um Transgen oder dsRNA Lieferung zu optimieren, sollten Sie bei der Injektion sehen eine Welle der Expansion in den Keimdrüsen, die bis nahe an das distale ist weiterhin tip). </li><li> Positionieren Sie die Nadel auf die untere Gonade und wiederholen Injektion injizieren, aber da diese Gonade unter dem Bauch der Verbreitung der Eizellen nicht sieht, und ist somit schwieriger zu erreichen (Abbildung 2C). </li><li> Normal aussehenden Wurm deutet auf eine erfolgreiche Injektion nach der Injektion; sollte es keine beschädigten Gonaden werden (ragt aus der Vulva oder tauchte in der Körperhöhle). </li><li> Stecken Sie die Nadel wieder in Ruhestellung. </li><li> Bereiten Sie den Wurm zu retten. </li><li> Fügen Sie einTropfen (0,5 ul) M9-Puffer auf das Pad, wo das injizierte Wurm platziert wird. </li><li> Mit einigen OP50 Bakterien auf Ihre Wahl, berühren Sie den Wurm mit dem OP50, und es sollte halten. Wir verwenden keine Mund pipettieren. </li><li> Setzen Sie den Wurm auf die Platte mit 50 ul Flecken OP50 ausgesät, können 2-4 Würmer auf solchen Platten gerettet werden. </li></ol></li><li> Post-Injektion Storage &amp; Screening für Transgenese <ol><li> Shop injiziert Würmer (P 0) bei 20 ° C für ca. 4 Tage, um Eier zu legen und aufwachsen F 1. </li><li> Screen-Würmer am vierten Tag für ausgewählte Phänotyp (Um-Bildschirm für Transgenese Suche nach rollende Tiere Ausdruck der PPA-prl-1 dominante Marker). </li><li> Wählen Sie einzelne unabhängige F 1 &#39;s Tiere mit dem beobachteten Phänotyp zu neuen ausgesät Platte und lagern bei 25 ° C; dieser Temperatur fördert die Bildung von stabilen Linien von F 1&#39; s. </li><li> Einzel-F 2 aus unabhängigen F 1-Linien. Individuelle F 2 </sub&gt; Linien haben ähnliche Transgen Übertragungsraten. Wir erhalten häufig&gt; 15 F 2 Zeilen pro verwandelt F 1 Tier. </li><li> Shop nachfolgenden Generationen bei 25 ° C. </li><li> Die Übertragungsrate der Rollen bleibt in der Regel nach dem F 4-Generation konstant, so ist es zu dieser Zeit notwendig, um die Expression des Ziel-Transgen (PPA-EGL-4P:: gfp) ermitteln für jede einzelne Linie. GFP-Expression kann nicht mit dem Ausmaß der Penetranz der dominanten Rolle Phänotyp korrelieren. </li></ol></li><li> Post-Injektion Storage &amp; Screening für RNAi-Phänotypen <ol><li> Shop injiziert Würmer (P 0) bei 20 ° C für ca. 4 Tage zu verlegen und zu wachsen F 1. </li><li> Screen-F 1 Würmer am vierten Tag für ausgewählte Phänotyp (Um-Bildschirm für RNAi-Knockdown Phänotyp, suchen Sie nach penetrant Phänotypen, die mit dem Verlust der Ziel-Gen-Aktivität in Verbindung gebracht werden, kann in unserem Fall den Verlust des PPA-prl-1 Phänotyp). </li><li> Nach unserer Erfahrung ist die nicht-roller Knockdown Phänotyp in&gt; 97% der F 2 verloren. </li></ol></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: 1. Ergebnis der Transgenese <table border="1"><tbody><tr><td> Session </td><td> Injected P 0 </td><td> F 1 Rollers </td><td> % Transgenen F 2 </td><td> Durchschnittliche% Transmission nach F 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Linie 1) 0% (Linie 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (Linie 3) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Linie 4) 0% </td><td> NA </td&gt; </tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Linie 5) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table> * Eine männliche Rolle, nicht überschreiten; NA: Nicht anwendbar . Tabelle 3 Ergebnisse der injizierten PS312 mit PPA-EGL-4P:: gfp (Sal I verdaut), pRL3 (Rolle) (Pst I verdaut) und gDNA PS312 (PstI und SalI verdaut). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> Abbildung 3 (A) Wildtyp (B, C) ​​eine stabile F 4 pRL3; PPA-EGL-4p.:: Gfp transgene Linie zeigt den Kopf Neuron GFP-Expression. 2. Ergebnis der RNA-Interferenz <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> Abbildung 4. RNA injiziert prl-1-Mutantenzeigen komplette Knockdown von &quot;rollenden&quot; Fortbewegung. (A) prl-1 Rolle gain-of-function-Mutante tu92. (B) prl-1-Mutanten weisen eine normale Wildtyp-Haltung und Bewegung &quot;abgerissen&quot;. (C) injiziert prl-1 (unten) hat auch mehr Körper als prl-1-Mutante (oben). (D) Die mehr Körper injiziert prl-1 (unten) ist auch mehr als der Wildtyp PS312 (oben). Je länger Körper Phänotyp wurde auch in den rol-5 (SQT-1) RNAi Knockdown von C beobachtet elegans N2 (Daten nicht gezeigt). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rollen </td><td> Nicht-roll </td></tr><tr><td> Ein prl-1 dsRNA (200 ng / ul) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B prl-1 dsRNA (1000 ng / ul) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Steuerung </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. </strong&gt; Zusammenfassung der PPA-prl-1 dsRNA Injektionen. (A) [dsRNA] = 200 ng / ul; (B) [dsRNA] = 1000 ng / ul. P = 0,0019 und 0,041 von Exact-Test nach Fisher, zweiseitig, für 200 und 1000 ng / ul Injektionen, jeweils.

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

P. pacificus Populationen sind in enger Zusammenarbeit mit verschiedenen Skarabäus Arten weltweit gefunden und ist ein Modell, Nematoden der Mitte zwischen frei lebenden und Nematoden. Die Stärke des P. pacificus als ein Modell Organismus lag in der Integration seiner genetischen und physikalischen Karten, die positionelle Zuordnung von Mutanten aus unvoreingenommene freuen genetischen Screens isoliert zu fördern (dh nicht nur für Kandidatengene zuvor in C. elegans charakterisiert...

<table border="1"><tbody><tr><th> Produkt: </th><th> Catalog #: </th><th> Lieferant: </th></tr><tr><td> DMI3000 Injection Mikroskop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Mikroinjektor Manipulator (Direct Drive) </td><td> Narashige BC-3 Kugelgelenk </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> Needle Puller </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> Mikroinjektor ™ All-Digital Multi-Druck-System </td><td> Narashige Minj-D </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> GeneElute ™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Cloning Jet-Set </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET Plasmid Miniprep Kit </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Concentrator ™ </td><td> D4005 </td><td> Zymo Forschung </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® Transcription Kit </td><td> K3500-01 &amp; K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Edle </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher Wissenschaftlich </td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas (1,5 bis 0,16 bis 0,19 mm dick, Größe: 50 x 45mm) </td><td> 12 bis 554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Glaskapillaren (Filament) </td><td> 615000 </td><td> AM-Systeme </td></tr><tr><td> Paraffinöl (Heavy) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

Zwar ist es immer günstiger für neue Modell-Organismen vollständig sequenzierten Genomen zu erhalten, weitere eingehende Genfunktion und Expressionsanalysen durch RNA-Interferenz und stabile Transgenese beschränkt bleiben in vielen Arten aufgrund der besonderen Anatomie und molekulare Zellbiologie des Organismus. Zum Beispiel haben außerhalb der Krone Gruppe Caenorhabditis dass Caenorhabditis elegans 3, stabil übertragen transgenen Linien in nicht-Caenorhabditis Arten gehören nicht in dieses scheinbare Stamm (Nematoda) berichtet worden, mit Ausnahme der Zwergfadenwurm 4 und Pristionchus pacificus 5. Zur Erleichterung der wachsenden Rolle von P. pacificus in das Studium der Entwicklung, Evolution und Verhalten 6-7, beschreiben wir hier die aktuellen Methoden zur Mikroinjektion zur Herstellung transgener Tiere und Gen-knock down von RNAi nutzen. Wie die Keimdrüsen <em&gt; C. elegans und die meisten anderen Nematoden, die Keimdrüsen von P. pacificus ist syncitial und in der Lage Einbeziehung DNA und RNA in die Oozyten, wenn sie durch direkte Mikroinjektion geliefert. Im Gegensatz zu C. elegans jedoch stabil transgene Erbschafts-und somatische Expression in P. pacificus erfordert die Zugabe von selbst genomischer DNA mit Restriktionsendonukleasen komplementär zu den Enden der Ziel-Transgenen und Koinjektions Marker 5 verdaut. Die Zugabe von Carrier genomische DNA ist vergleichbar mit der Forderung nach Transgenexpression in Zwergfadenwurm 4 und in den Keimzellen von C. elegans. Es ist jedoch nicht klar, ob die spezifischen Anforderungen für die Tiere eigene genomische DNA ist, weil P. pacificus soma ist sehr effizient zum Schweigen zu nicht-komplexe multi-copy-Gene oder extrachromosomale Arrays in P. pacificus benötigen genomischen Sequenzen für die ordnungsgemäße Montage Kinetochor während der Mitose. Die ventralen Migration des zweiarmigen (didelphic) Gonaden in Hermaphroditen erschwert die Fähigkeit, sowohl Gonaden in einzelnen Würmer 8 zu injizieren. Wir zeigen auch die Verwendung von Mikroinjektion den Zuschlag eine dominante Mutante (roller, tu92) durch die Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in den Keimdrüsen zu Non-Rolling F 1 Nachkommen zu erhalten. Im Gegensatz zu C. elegans, aber wie die meisten anderen Nematoden, P. pacificus PS312 ist nicht empfänglich für systemische RNAi über Fütterung und Tränkung und daher dsRNA müssen durch Mikroinjektion in die syncitial Gonaden angewendet werden. In dieser aktuellen Studie hoffen wir, die Mikroinjektion Prozess benötigt wird, um ein PPA-EGL-4 Promotor verwandeln beschreiben:: GFP-Reporter und Knockdown eine dominierende Rolle prl-1 (tu92)-Mutante in einer visuell informative Protokoll.

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In Modell-Organismen, kann Transgenese manipulieren Genfunktionen während RNAi kann Knockdown spezifische mRNA-Transkripte 1-2. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Techniken benötigt, um stabil zu übertragen DNA und vorübergehend doppelsträngige RNA in die necromenic Nematoden Einführung illustrieren<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Für ein Studium in der Evolution, Entwicklungs-und Verhaltensbiologie.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K Aufrufe.  California State University. In Modell-Organismen, kann Transgenese manipulieren Genfunktionen während RNAi kann Knockdown spezifische mRNA-Transkripte 1-2. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Techniken benötigt, um stabil zu übertragen DNA und vorübergehend doppelsträngige RNA in die necromenic Nematoden Einführung illustrieren Pristionchus pacificus Für ein Studium in der Evolution, Entwicklungs-und Verhaltensbiologie.

Serie: RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Forschung

Genetik

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

RNA-Interferenz in Wasserkäfern als leistungsstarkes Werkzeug zur Manipulation der Genexpression an bestimmten Entwicklungszeitpunkten

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Umwelt

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Biotechnik

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Immunologie und Infektion

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Biologie

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

RNAi in C. elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target gene. In the nematode, C. elegans, RNAi is particularly easy and effective because it can be delivered simply by feeding the worms bacteria that express double stranded RNA (dsRNA) that is complementary to a gene of interest. First, this video will introduce the concept of RNA interference and explain how it causes targeted gene knockdown. Then, we will demonstrate a protocol for using RNAi in C. elegans, which includes preparation of the bacteria and RNAi worm plates, culturing of the worms, and how to assess the effects of RNAi on the worms. RNAi is frequently used to perform reverse genetic screens in order to reveal which genes are important to carry out specific biological processes. Furthermore, automated reverse genetic screens allow for the efficient knockdown and analysis of a large collection of genes. Lastly, RNAi is often used to study the development of C. elegans. Since its discovery, scientists have used RNAi to make tremendous progress on the understanding of many biological phenomena.

RNA Interference RNAi in Caenorhabditis elegans

RNA-Interferenz in C. elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target ...

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

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Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,