Die Autoren danken Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) für seine Hilfe bei der CNC-Bearbeitung. Darüber hinaus möchten wir Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) für ihre Hilfe bei MATLAB-Programmierung, sowie Kate Beverage und Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) danken für die Unterstützung bei Camtasia. Sophie Burke und Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) vorgesehen zusätzliche Videomaterial. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R15 HL097332), die UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, die American Heart Association (undergraduate Forschungsstipendium an JZH) und Worcester Polytechnic Institute (Summer Undergraduate Research Fellowship an JZH und institutionelle finanziert Anschubfinanzierung für MWR).

1. Zellaussaat Formenbau Beginnen Sie mit dem Fräsen einer 1 / 2 &quot;dickes Stück aus Polycarbonat bis 15, mit rundem Boden, ringförmigen Vertiefungen mit einer Mittelsäule Durchmesser von 2 mm zu schaffen. Die gefrästen Kanäle sind 6 mm tief und 3,75 mm breit. Reinigen und trocknen Sie das Polycarbonat Schimmel entfernen Sie alle Kunststoff-Ablagerungen aus dem Mahlvorgang. Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) bei einem Verhältnis von 10:1 (w / w) von Base zu Härter, Degas, um alle Luftblasen zu entfernen, und gießen Sie auf das Polycarbonat Form. Degas wieder entfernen Sie alle verbleibenden Blasen und Heilung in den Ofen bei 60 ° C für 4 Stunden. Einmal ausgehärtet, entfernen Sie vorsichtig die PDMS-Vorlage durch langsames Abziehen es weg von der Polycarbonat, mit Wasser und Seife waschen, und Autoklaven. Auch Autoklaven eine Lösung von zwei Prozent Agarose (w / v) gelöst in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM). Legen Sie die PDMS-Vorlage auf eine ebene Fläche und füllen mit geschmolzenem aga<html> stieg um ersten Pipettierung Agarose in jedem der Mitte nach Schimmel, und dann Pipettieren in den Raum um ihn herum. Lassen Sie die Agarose sich verfestigen (ca. 15 Minuten), dann invertieren die Form der Agarose aus dem PDMS freizugeben. Cut über Agarose aus der ganzen jede der Vertiefungen und legen Sie die Agarose Bohrungen in 12-Well-Platten. 2. Zellkultur-und Ring-Aussaat Add Zellkulturmedien (DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin) um die Außenseite der Agarose Form, ohne die Oberseite der Formen. Legen Sie die Platten in den Inkubator und es ihnen ermöglichen, für ca. 15 Minuten ausgleichen, während Sie die Zellen herzustellen. Bei 90% Konfluenz trypsinize Rattenaorta glatten Muskelzellen (rSMCs) und resuspendieren in einer Konzentration von 5x10 6 Zellen / ml. Je 100 ul Zellsuspension in jede der ringförmigen Agarose Brunnen, mit kreisenden Bewegungen, um Zellen in jede Vertiefung gelten. content &quot;&gt; Stellen Sie sicher, Inkubator Regale sind Ebene, dann die Platten in den Inkubator und ihnen erlauben, sitzen 24 Stunden lang ungestört. Exchange Medium alle zwei Tage danach durch Ansaugen der Medien aus der ganzen gut, und re-Füllung in jede Vertiefung, bis die Agarose gut ist völlig untergetaucht. 3. Tissue Ring Ernte-und Dickenmessung Am Ende der Kultur, entfernen Sie den Ring aus der Agarose Form, indem Sie ihn über den Rand des Zentrums zu posten. Legen Sie den Ring in einer kleinen Petrischale mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), in der Mitte der Probe, und erwerben Sie ein Bild mit einer digitalen Imaging-System. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Programm für die Kantenerkennung und messen die Dicke des Rings in 4 Positionen (oben, unten, links und rechts) um seinen Umfang. Berechnen Sie die mittlere Dicke Wert (t) für jeden einzelnen Ring, und verwenden Sie diesen Wert auf die Querschnittsfläche berechnen(2π (t / 2) 2). 4. Mechanische Prüfung von Ringen Richten Sie die Zugprüfmaschine (Instron EPS 1000) in die horizontale Position. Bringen Sie eine 1N ± 1mN Wägezelle und benutzerdefinierte dünnen Draht Griffe (erstellt durch Biegen Edelstahlseile). Montieren Sie den Ring Probe auf den beiden dünnen Draht Griffe. Verlängern Sie die Griffe bis zu einem 5 mN Taralast auf die Probe aufgebracht wird. Geben Sie die Querschnittsfläche (berechnet aus Dickenmessungen) und notieren Sie die Messlänge. Pre-Zyklus der Ringe 8-mal zwischen den Taralast und 50 kPa Stress mit einer Geschwindigkeit von 10 mm / min. Nach dem achten pre-Zyklus, zum Scheitern zu ziehen bei 10 mm / min. Das Scheitern ist eine Abnahme der Kraft um 40% von einer Messung zur nächsten vermerkt. Für jeden Ring Probe messen die Zugfestigkeit (UTS) und Bruchdehnung und berechnen Sie den maximalen Tangente Modul (MTM) aus den gewonnenen Daten. 5. Tissue-Ring alssammlung zu fertigen Gewebe Rohre Benutzerdefinierte Rohrhalter aus Runde 5 cm Polycarbonat Scheiben mit rechteckigen Aussparungen (2 cm x 3 cm) bearbeitet. Drill Gewindebohrungen durch diese Scheiben zu ermöglichen zwei Halterungen miteinander verschraubt werden. Autoclave die benutzerdefinierte Gefäßhalter und dann Transfer zum Biosicherheitswerkbank und in eine leere Petrischale. Verwenden chirurgische Schere an den Enden von 1,9 mm Durchmesser Silikonschläuche in einem Winkel zur abgeschrägten Kanten zu schaffen geschnitten und anschließend autoklavieren Silikonschläuche. Während die Rohre sind autoklaviert wird, füllen eine Petrischale mit Medien. Entfernen Sie die Ringe von der Agarose Brunnen und legen Sie sie in der Petrischale mit den Medien. Ort autoklaviert Silikonschläuche in der gleichen Petrischale, um sie vor dem Gebrauch nass. Verwenden einer Pinzette, um eine abgeschrägte Ende einer Silikon-Schlauch in der Mitte einen Ring Platz und schieben Sie den Ring auf den Silikonschlauch. Wiederholen Sie die gewünschte Anzahl von rings. Schieben Sie die Ringe in Kontakt miteinander, indem Sie ihn sie nacheinander in beiden Richtungen entlang der Röhre. Diese Methode kann für Ringe nach nur einem Tag in Kultur geerntet werden. Sobald Ringe befestigt sind, richten Sie Silikonschläuche in der Polycarbonat-Halterungen ein und die beiden Teile der Halterung zusammen. Setzen Sie den Halter in eine 100 mm Petrischale und fügen 55 mL Medien. Börse Medien alle 3 Tage für die Dauer der Kultur. Zum Entfernen des Gewebes Rohre, lassen Sie die Silikonschläuche aus dem Polycarbonat Halter und Pinzette verwenden, um das Gewebe Rohre aus dem Silikon-Schlauch und in eine Petrischale mit PBS gefüllte Rutsche. 6. Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, aggregierte Zellen, Gewebe-Ringe mit einem inneren Durchmesser gleich dem Durchmesser der entsprechenden Form post innerhalb von 24 Stunden zu bilden. Die Kanten des Rings sind in der Regel in Erscheinung glatt und (wenn cultured auf einer ebenen Fläche), sind in der Dicke um den gesamten Umfang einheitlich. Das Gewebe Ringe sind einfach zu handhaben und kann aus ihren Brunnen für nachfolgende mechanische und histologische Analyse (siehe in Gwyther et al., 2011 8) entfernt werden. Tissue Ring Morphologie, Matrix Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften variieren je nach Anzahl und Art der Zellen ausgesät. Repräsentative Ergebnisse aus Gewebe Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat Bedingungen, und die Kultur der Länge hergestellt, sind in Tabelle 1 dargestellt. Zwei mm ID Ringe von 5x10 5 rSMCs erstellt zeigten eine höhere UTS als Ringe aus unserer bisher veröffentlichten 2 mm Ringe (aus 6.6x10 5 rSMCs) erstellt. 8 Ähnlich wie bei Ratten-Zellen, humanen glatten Muskelzellen (HSMC) leicht aggregiert, um Gewebe zu bilden Ringe, die eine große Menge von Kollagen nach nur 14 Tagen in Kultur (Daten nicht gezeigt) enthalten. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) auch aggregiert und bilden geschlossene Ringe, sondern lacked mechanische Festigkeit und brach während der ersten precycling Phasen der einachsigen Zugversuch. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Die Zellzahl </td><td> Dicke (mm) </td><td> Länge der Kultur (Tage) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Bruchdehnung (mm / mm) </td></tr><tr><td> rSMC Ringe </td><td> 6 </td><td> 660.000 </td><td> 0,94 ± 0,12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0,50 ± 0,08 </td></tr><tr><td> rSMC Ringe </td><td> 4 </td><td> 500.000 </td><td> 0,53 ± 0,02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0,88 ± 0,05 </td></tr><tr><td> HSMC Ringe </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,51 ± 0,05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0,92 ± 0,08 </td></tr><tr><td> hMSC Ringe </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,40 ± 0,07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Tabelle zeigt die Kultur Parameter und mechanischen Eigenschaften von 2 mm Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat-Konzentrationen und Kultur Dauer erzeugt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" /> Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung des Gewebes Ring Generierung. (B) Custom Polycarbonat Form mit gefrästen ringförmigen Vertiefungen. Zentrale Poststelle Durchmesser 2 mm. (C) PDMS-Vorlage, nachdem sie weg war aus dem Polycarbonat Form geschält. (D) Aggregierte Gewebe Ring in einer Agarose-Form mit einer 2 mm post kultiviert. (E) Zwei mm Durchmesser Gewebe Ring in PBS. Maßstabsbalken = 6 mm (B, C) und 2 mm (D, E). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" /> Abbildung 2. Representative Grundstück von Spannungs-Dehnungs-Kurve produced aus einachsigen Zugversuch.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Seit kurzem besteht ein verstärktes Interesse an zell-basierte oder &quot;Gerüst-less&quot; Tissue Engineering Methoden, um einige der Einschränkungen von Gerüst-basierte Tissue Engineering Ansätze Adresse. Da cell-derived Gewebe aus Zellen bestehen und die Matrix die sie produzieren, sie von Natur aus enthalten viel höheren Zelldichten, enthalten keine körperfremden Materialien und kann vollständig aus menschlichen Zellen und Proteine ​​hergestellt werden. Gefäßprothesen aus menschlichen Zellen hergestellt werden erhebliche mechanische Festigkeit in Abwesenheit von exogenen Gerüsten (zB Berstdruck 3400 mmHg im Vergleich zu 1600 mmHg für den menschlichen Stammvenen) 12 zu erreichen. Obwohl zellbasierten Gefäßgewebe verbesserte Zelldichte und mechanischer Festigkeit, die meisten aktuellen Herstellungsverfahren (z. B. &quot;Blatt-based engineering&quot; 3,4,12 oder &quot;bioprinting&quot; 5,13) weisen erfordern umfangreiche Kultur Zeiträume (&gt; 3 Monate) oder Spezialausrüstung für 3D-Gewebe Konstruktion. Die cell-derived Gewebe Ring method hier beschriebenen ermöglicht eine schnelle zelluläre self-assembly, robuste 3D-Gewebe-Konstrukte in kurzer Zeit und ohne den Einsatz von Spezialgeräten zu bilden. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, das wir entwickelt, um 2 mm Innendurchmesser Ratte glatten Muskulatur cell-derived Gewebe Ringe zu erstellen. Im vorliegenden Beispiel wurden Gewebeproben Ringe für 7 Tage (dann weitere 7 Tage zur Anellierung und tube formation kultiviert) kultiviert. Allerdings, 2 mm Ratte (und menschliche) glatten Muskelzellen Ringe können aus den Vertiefungen entfernt werden und sind kohäsive genug für das Handling (zB Übertragung auf Silikonschläuche) bereits einen Tag nach Zellaussaat. Darüber hinaus kann robuste Gewebe Ringe mit unterschiedlichen Innendurchmessern (2, 4 und 6 mm) mit dieser Methode durch einfache Änderung der post Durchmesser des ursprünglichen Polycarbonat Form erstellt werden. 8 Wir haben kürzlich auch die Polycarbonat-Formenbau modifiziert, um fünf 2 ermöglichen mm Aussaat Brunnen in einem einzigen Multi-Well-Agarose Kammer gegossen werden, dieverbraucht weniger PDMS und Agarose, und passt in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte (Daten nicht gezeigt). Änderungen in der post Durchmesser, die Breite der Aussaat gut, der Radius der Krümmung der abgerundeten Boden, kann die Anzahl der Aussaat Brunnen, oder die Tiefe der Aussaat Brunnen alle einfach durch Änderung der Angaben in der CAD-Datei für CNC geändert werden Bearbeitung der Polycarbonat-Form. Schließlich kann ein einziger Polycarbonat Form verwendet werden, um eine unbegrenzte Anzahl von PDMS-Vorlagen herzustellen, und jede PDMS Vorlage gereinigt werden kann, autoklaviert und wieder dutzende Male. Neben der Änderung der Größe des Gewebes Ringe haben wir Ringe aus vielen verschiedenen Zelltypen hergestellt, unter anderem: primären Ratten SMCs (Cell Applications, R354-05), primären humanen koronaren glatten Muskelzellen (Lonza, CC-2583), primäre humane Hautfibroblasten 11 (großzügige Schenkung von Dr. George Pins, WPI Abteilung für Biomedizinische Technik), Rattenlunge Fibroblasten (RFL-6, ATCC CCL-192) und mesenchymalen Stammzellen (Lonza, PT-2501). Jeder dieser Zelltypen Aggregate und Verträge rund um das Zentrum Beiträge von Gewebe Ringe bilden, obwohl die zelluläre Organisation, ECM Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften der Konstrukte variieren je nach Zelltyp. Die Aussaat Parameter für jeden Zelltyp muss empirisch auf der Grundlage der Größe der Zellen und ihre Fähigkeit zur Aggregation ermittelt werden. Während also dieses System zu schaffen, cell-derived Gewebe Ringe ist äußerst vielseitig, so kann das Protokoll müssen geringfügige Anpassungen für eine optimale Gewebsbildung mit verschiedenen Zelltypen. Tissue Ringgeometrie erleichtert das Be-und Beurteilung von Gewebe Materialeigenschaften von einachsigen Zugversuch, wie beschrieben. Es gibt auch erhebliche Präzedenzfall für die Nutzung der Blutgefäße Ringsegmente zu Gefäßkontraktion und physiologische Funktion zu messen. Vorläufige Studien deuten darauf hin, dass cell-derived Gewebe Ringe auf einem Draht Myographions Gerät zur Messung der pharmakologischen Ansprechbarkeit montiert werden undKontraktionskraft Generation (Daten nicht gezeigt). Insgesamt deutet die Fähigkeit, schnell herzustellen self-assembled Zelle Ringe für die histologische, mechanische, physiologische und biochemische Analyse ein leistungsfähiges neues Werkzeug, die nützlich sein für die Modellierung Gefäßgewebe Struktur und Funktion in Gesundheit und Krankheit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Catalog # </th></tr><tr><td> Polydimethylsiloxan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15 bis 017-CV </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Mediatech </td><td> 30 bis 002-CI </td></tr><tr><td> Digital Imaging-System </td><td> DVT Corporation </td><td> Modell 630 </td></tr><tr><td> Einachsige Prüfmaschine </td><td> Instron </td><td> ElectroPuls E1000 </td></tr><tr><td> Edge Detection Software </td><td> DVT Corporation </td><td> Rahmenprogramm 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering

Jedes Jahr unterziehen sich Hunderttausende von Patienten einer koronaren Bypass-Operation in den Vereinigten Staaten. 1 Etwa ein Drittel dieser Patienten haben keine geeignete autologe Spender Schiffe wegen Fortschreiten der Erkrankung oder frühere Ernte. Das Ziel der vaskulären Tissue Engineering ist es, eine geeignete Alternative Quelle für diese Bypass-Transplantate entwickeln. Darüber hinaus kann technisch Gefäßgewebe als wertvoll erweisen als lebende vaskulären Modelle auf Herz-Kreislauf Erkrankungen zu studieren. Mehrere viel versprechende Ansätze zur technischen Blutgefäßen erforscht worden sind, mit vielen neueren Studien mit Schwerpunkt auf der Entwicklung und Analyse von Zell-basierten Methoden. 2-5 Hier stellen wir eine Methode, um schnell selbst montieren Zellen in 3D-Gewebe Ringe, die in verwendet werden können vitro zu modellieren Gefäßgewebe. Um dies zu tun, sind Suspensionen von glatten Muskelzellen in Rundkolben ringförmigen Agarose Brunnen ausgesät. Die nicht-klebenden Eigenschaften der Agarose erlauben the-Zellen zu regeln, zu aggregieren und Vertrag um einen Stab in der Mitte des Brunnens zu einer zusammenhängenden Gewebe Ring bilden. 6,7 Diese Ringe können über mehrere Tage vor der Ernte für mechanische, physiologische, biochemische oder histologische Analyse kultiviert werden. Wir haben gezeigt, dass diese Zellen abgeleiteten Gewebe Ringe bei 100-500 kPa Zugfestigkeit 8, die den Wert für andere Gewebezüchtung vaskulären Konstrukte für ähnliche Laufzeiten (&lt;30 kPa) kultiviert berichtet übersteigt Ertrag. 9,10 Unsere Ergebnisse zeigen, dass stabile Zelle -derived Gefäßgewebe Ring Generation kann innerhalb kurzer Zeit erreicht werden kann, und bietet die Möglichkeit für direkte und quantitative Bewertung der Beiträge der Zellen und Zell-abgeleitete Matrix (CDM) zu Gefäßgewebe Struktur und Funktion.

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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine ​​für Gewebe Montage.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.7K Aufrufe.  Worcester Polytechnic Institute. Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine ​​für Gewebe Montage.

Serie: Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Forschung

Biotechnik

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...