CMOD Pack ermöglicht es Ihnen, Zellen mit sehr hoher Präzision zu mustern und sie in 2D oder 3D zu kultivieren. Dies eröffnet Möglichkeiten, Zell-Zell-Interaktionen und die Morphogenese von motorischen neuen Geweben zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für andere Labore leicht zu übernehmen ist und keinen Reinraum, keine spezielle Ausrüstung oder benutzerdefinierte synthetisierte Reagenzien erfordert.
Beginnen Sie, indem Sie kleine Tropfen des positiven Fotolacks mit einer Einwegpipette auf den Aldehydschieber fallen lassen. Drehen Sie den Schlitten mit 3000 U / min für 30 Sekunden mit dem Spin-Codierer und legen Sie ihn dann für 1,5 Minuten auf eine 100 Grad Celsius heiße Platte, um den Fotolack zu vernetzen. Entfernen Sie das Dia von der Heizplatte und legen Sie eine Fotomaske mit den gewünschten Merkmalen auf das Dia, beschweren Sie es mit einem Stück Glas und bedecken Sie das gesamte Setup in einer undurchsichtigen Box.
Belichten Sie das Setup zwei Minuten lang mit einer UV-Lampe, entwickeln Sie den Objektträger, indem Sie ihn für drei bis fünf Minuten in die Entwicklerlösung eintauchen, spülen Sie dann überschüssige Entwicklerlösung mit Wasser ab, trocknen Sie ihn unter einem Luft- oder Stickstoffstrom. Beobachten Sie dieses Licht unter einem Mikroskop, um den Erfolg der Fotolithographie zu bestätigen, und speichern Sie es im Dunkeln. Fügen Sie einen Tröpfchen aus 20 mikromolaren ameisenmodifizierten Oligoslösung auf jede fotogemusterte Region des Objektträgers und verteilen Sie das Tröpfchen vorsichtig über die gesamte Region, wobei Sie darauf achten, den Objektträger nicht zu zerkratzen, den Objektträger in einem 65 Grad Celsius warmen Ofen backen, bis die DNA-Lösung vollständig getrocknet ist, eine reduktive Aminierung durchführen, indem Sie den gebackenen Objektträger und eine 15 Zentimeter große Zellkulturschale in einem Abzug darauf legen eines Shakers.
Mischen Sie vorsichtig 100 Milligramm Natriumborhydrid in 40 Milliliter PBS und geben Sie es in die Schüssel. Schalten Sie dann den Shaker für 15 Minuten ein. Nach der Reaktion waschen Sie diesen Objektträger zweimal mit 0,1% Natriumdodecylsulfat, um nicht umgesetzte DNA zu entfernen.
Dann waschen Sie die Rutsche dreimal mit Wasser. Fahren Sie diese Rutsche unter dem Strom von Stickstoff oder Luft. Zum Schluss spülen Sie es mit Aceton ab, um den verbleibenden Fotolack zu entfernen.
Bereiten Sie eine universelle Anker- und Adapterlösung mit vier Mikromolaren vor, wie im Textmanuskript beschrieben, und bereiten Sie eine universelle Co-Ankerlösung mit 20 Mikromolaren in PBS vor. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, indem Sie das Zellpellet in einem Milliliter eiskaltem PBS oder serumfreien Medien wiederverwenden und eine bis 3 Millionen Zellen auf eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifugen-Röhrchenzentrifuge übertragen. Zentrifugiere bei 160 mal G für vier Minuten.
Resuspendieren Sie das erhaltene Zellpellet in 75 Mikroliter eiskalte PBS- oder serumfreie Medien und geben Sie 75 Mikroliter der für mikromolaren vorbereiteten universellen Anker- und Adapterlösung hinzu. Gründlich mischen und fünf Minuten auf Eis inkubieren, 15 Mikroliter der universellen Co-Anchor-Lösung in die Tube geben und gründlich mischen, dann die Probe für fünf Minuten auf Eis inkubieren. Um überschüssige Oligos aus der Zellsuspension zu entfernen, geben Sie einen Milliliter eiskaltes PBS oder serumfreie Medien in das Röhrchen und mischen Sie es mit einer Pipette.
Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 160 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male. Resuspendieren Sie die Zellen in Eis col PBS oder serumfreien Medien, um eine zelldichte Lösung von mindestens 25 Millionen Zellen pro Milliliter zu erzeugen, kippen Sie den Musterobjektträger leicht und geben Sie dann 25 Mikroliter dieser Zellsuspension in den Einlass jeder Flusszelle.
Entfernen Sie die PBS- und 1%ige BSA-Lösung aus dem Auslass, damit die Zellsuspension die PDMs-Durchflusszelle füllen kann. Auf Eis oder bei Raumtemperatur für 30 Sekunden inkubieren, fünf Mikroliter der Zellsuspension aus dem Auslass des Objektträgers absaugen und wieder in den Einlass geben. Wiederholen Sie dies 10 Mal pro Durchflusszelle.
Pipettieren Sie vorsichtig PBS oder serumfreie Medien in den Einlass jeder Durchflusszelle, um die überschüssigen Zellen auszuwaschen und die Zellsuspension aus dem Auslass zu sammeln. Wiederholen Sie dies zwei- bis viermal, bis keine überschüssigen Zellen mehr auf dem Objektträger verbleiben. Für die 3D-Kultur eine Hydrogel-Vorläuferlösung mit 2% DNAs herstellen und 50 Mikroliter davon in den Einlass jeder Durchflusszelle geben.
Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus dem Auslass ab und treiben Sie die Hydrogellösung in die Durchflusszelle. Inkubieren Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten, damit sich die Hydrogele absetzen und die DNA-basierte Adhäsion zwischen den Zellen und der Oberfläche spalten können. Fügen Sie 50 Mikroliter Hydrogel-Vorläufer zu einer Vertiefung eines Zwei-Well-Kammer-Objektträgers oder einer Sechs-Well-Platte hinzu.
Pipettieren Sie 10 Mikroliter PBS auf beiden Seiten jeder Durchflusszelle. Verteilen Sie es mit einer Rasierklinge oder einer Punktpinzette über die gesamte Länge der Durchflusszelle und heben Sie die Seiten der Durchflusszellen vorsichtig an, so dass das PBS unter das Hydrogel rauscht. Verschieben Sie die Durchflusszelle mithilfe einer Rasierklinge an den Rand der Folie, indem Sie die Folie umkehren, und stoßen Sie die Durchflusszelle von der Folie ab, sodass sie auf der Rasierklinge landet.
Nehmen Sie die Durchflusszelle mit einer gekrümmten Pinzette aus der Rasierklinge. Invertieren Sie die Flusszellen, so dass sich die Zellen auf der Unterseite befinden, und legen Sie sie auf den Tröpfchen der Hydrogel-Vorläuferlösung. Inkubieren Sie für mindestens 30 Minuten, so dass das Hydrogel, das die Musterzellen enthält, an die Hydrogelunterlage binden kann, was zur vollständigen Einbettung der Musterzellen führt.
Entfernen Sie die Durchflusszelle und tauchen Sie sie vollständig in Medien ein. Stupsen Sie die Durchflusszelle vorsichtig mit einer gekrümmten Pinzette an, bis sie abspringt und in das Medium schwebt, und entsorgen Sie sie dann. Die Quantifizierung der DNA-Spot-Adhäsion an CMO-markierten Zellen nimmt zu.
als Funktion der CMO-Konzentration wird als Mittelwert und Standardabweichung von drei Experimenten dargestellt. Die DNA-Muster sind in Magenta und die anhaftenden CMO markierten Zellen in Cyan in unterschiedlichen Konzentrationen von CMO dargestellt. Ein Vergleich von CMO-markierten Huvecs und LMO-markierten Huvecs, die an einem linearen DNA-Muster haften, ist hier gezeigt.
Einzelne MDCKs Muster VSC MOD Packung, und in Maitre Gel übertragen, konnten sich nach fünf Tagen Kultur vermehren und polarisieren. Mehrschichtige mehrzellige Aggregate wurden durch abwechselnde Zellschichten erzeugt, die mit komplementären CMOs markiert waren. Mehrere einzigartige Zellpopulationen können mit hoher Präzision und ohne Kreuzkontamination zusammen strukturiert werden.
Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, eine dichte Zellsuspension zu haben, während die Zellen zum Objektträger hinzugefügt werden, um die Möglichkeiten für die Zellen zu maximieren, an DNA-Flecken zu haften.
