Diese Arbeit wurde vom National Institute on Drug Abuse (NIDA) Zuschuss R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC) und NIDA Ausbildungsförderung T32 DA017637 (MVB) unterstützt.

1. Virus-und Lagervorbereitung <ol><li> Die Verwendung von replikationsinkompetent AAV-Vektoren für die Bereitstellung von Opsin-Gene auf Gehirn von Nagetieren ist für Biosafety Level 1 (BSL-1) zugelassen und erfordert einen angemessenen Schutz und Umgang mit Verfahren wie in der US-Regierung Publikation, in Mikrobiologie und biologische Sicherheit Biomedical Laboratories, an skizzierten die Centers for Disease Control Website bei ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> Um wiederholte Frost-Tau-Zyklen, Pipetten Virus aus Herstellers Fläschchen in kleineren Arbeits Aliquots in der Klasse II Biosicherheitswerkbank und an einem -80 ° C Gefrierschrank vermeiden. </li><li> Vor stereotaktische Injektion, ermöglichen ein Aliquot auf Eis aufgetaut und dann kurz Spin-Down mit einer Tischzentrifuge. </li><li> Langsam Verfüllung einer Hamilton-Glasspritze und Nadel mit einer kleinen Menge Silikonöl oder Mineralöl.Stellen Sie sicher, gibt es keine sichtbaren Luftblasen in der Spritze Barrel. Legen Sie die Spritze in einen Mikroinjektor Pumpe und befestigen Sie die Pumpe direkt auf die vertikale stereotaktischen Arm (dh stereotaktischen Manipulator). </li><li> Senken Sie den stereotaktischen Arm, bis die Spitze der Nadel den Boden des Virus aliquoten Rohr berührt. Verwenden Sie den Regler für die Mikroinjektor Pumpe, um das gewünschte Volumen an Virus (1,5 ul für eine 1 ul Injektion) zurücktreten. </li><li> Alle Materialien und Oberflächen, die in Kontakt mit dem Virus zu kommen, sollte mit einem Desinfektionsmittel wie Chlor Bleichmittel (10%) dekontaminiert werden. </li></ol> 2. Chirurgie und Virus Injection <ol><li> Betäuben Tier mit einem Gemisch aus Ketamin (Ratte, 125 mg / kg, ip) - Xylazin (Ratte, 10 mg / kg, ip) Cocktail. Um die Wirksamkeit der Narkose zu messen, prüfen, ob ein Reflex auf einer Zehe Prise und geben zusätzliche Dosen von Ketamin, wenn nötig. Mit Standard-aseptischen Operationsmethoden, legen Tier in einen stereotaktischen Apparat (David Kopf InInstrumente). </li><li> Machen Sie einen Mittelschnitt durch die Haut auf der Oberseite des Tierschädel mit kleinen chirurgischen Schere oder Skalpell. Trennen Sie vorsichtig Bindegewebe und reinigen Sie die Oberseite des Schädels mit einer kleinen Knochenschaber. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres Ebene, so dass die z-Koordinaten für Bregma und Lambda gleich sind. Bestimmen Sie die Koordinaten für die stereotaktische Zielgehirnbereich aus einer Hirnatlas wie The Rat Brain in Stereotaktische Koordinaten (George Paxinos und Charles Watson, Academic Press, 2007) oder Gehirn der Maus in Stereotaktische Koordinaten (BJ Keith Franklin und George Paxinos, Academic Press , 2007). Markieren Sie die Stelle der Injektion soll mit einem chirurgischen Stift. </li><li> Vorsichtig dünn die Schädel über dem Zielgebiet mit einer Handbohrmaschine und aufhören, wenn der Bohrer den Boden des Schädels erreicht. Mit ein Paar extra feinen Pinzette, entfernen Sie die Knochen ausgedünnt, um die Dura freizulegen. </li><li> Positionieren Sie die Spritzennadel über das Ziel sindein und senken Sie die Nadel bis zum dura berührt und diesen Punkt zu berechnen, die z-Koordinate. Ganz langsam senken Sie die Injektionsnadel in das Gehirn, bis die richtige Position erreicht ist z. In diesem Protokoll prälimbischen Bereich des medialen präfrontalen Kortex (2,7 mm anterior zum Bregma, ± 0,5 mm lateral zur Mittellinie und -2.2 mm von Dura) oder der Rücken subiculum (-6.0 mm anterior zum Bregma, 3,0 mm lateral ± zur Mittellinie bzw. -2,0 mm von Dura) in einem erwachsenen Sprague Dawley Ratten (ca. 275 g) ausgerichtet. </li><li> Injizieren Virus bei einer Rate von 0,1 ul / min. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist 10 Minuten warten, bevor Zurückziehen der Nadel, um einen Rückfluß des Virus auf der Gehirnoberfläche zu vermeiden. </li><li> Verwenden Sie eine Naht nähen mit Kanüle, um die Haut zu versiegeln und Antibiotika gelten für die Wunde. </li><li> Der Zeitverlauf der ChR2 NpHR und funktionelle Expression von AAV-Vektoren in Abhängigkeit von der Versuchsplanung und virale Titer variieren. Für dieses Experiment in vivo </em&gt; Aufnahmen wurden 18-21 Tage nach der Injektion durchgeführt. </li></ol> 3. Licht Lieferung und In-vivo-Erfassung von ChR2 oder NpHR-exprimierenden Neuronen <ol><li> Bringen Sie eine Wolframelektrode (~ 1-1,5 MOhm, Mikrosonden) auf eine Glaskapillare (Fisher Scientific) mit Superkleber. </li><li> Verwenden Sie eine Faser Stripping Tool (Thorlabs), um das blanke Ende eines Multimode-Lichtwellenleiter (200 um Kerndurchmesser, Thorlabs) und sauber Faserspitze mit Ethanol aus. Sehr leicht punkten Faserspitze mit einem keilförmigen Diamantmesser (Thorlabs) und entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Faser (zB mit feinen Pinzette). Die Faser sollte leicht in die Partitur zu spalten. </li><li> Verbinden des FC Ende der Faser an den PC-Anschluss an den Ausgangsanschluss eines 200 mW einzelnen Diodenlaser ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) mit der gewünschten Wellenlänge. Stellen Sie sicher, dass geeignete Schutzbrille wird zu allen Zeiten bei der Arbeit mit Lasern getragen. </li><li> Messen Sie die laser Intensität an der Spitze der optischen Faser mit einem optischen Leistungsmesser ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Für die in vivo-Aufnahmen kann die Lichtintensität so wenig wie 20 bis 100 mW / mm 2 zuverlässig wecken ChR2-oder NpHR-vermittelte Aktivierung oder Silencing bzw. neuronaler Aktivität. </li><li> Setzen Sie das optische Faser in die Kapillare. Positionieren Sie die Faserspitze etwa 500 um über der Spitze der Wolframelektrode und binden einen dünnen Faden zweimal an wenigen Stellen in der Nähe der Spitze, so dass die Elektrode und die Faser gerade sind. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Spitze der Elektrode und dem nächsten Knoten ist lang genug zum Einsetzen an die Zielregion. </li><li> Bereiten Sie das Tier wie in den Schritten 2.1 und 2.2. Verwenden Sie die Anfangs Kraniotomie als Leitfaden für eine neue, saubere kleine Fenster in den Schädel für die Positionierung des Optrode (machen <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Machen Sie einen kleinen Schnitt an der dura mit einer feinen Nadel. </li><li> Die Optrode vorsichtig absenken durch den Schädel und Fenster in das Gehirn auf die transduzierten Region mit einem Mikromanipulator (Narishige). Dann vorab die Optrode langsam in 10-50 um Schritte, bis die Entstehung eines auf Licht reagierenden Zelle. </li><li> Eine kundenspezifische Software-Benutzerschnittstelle (Neurolux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) in LabVIEW (National Instruments) geschrieben wird verwendet, um die einzelnen Diodenlaser zu steuern und zu visualisieren und aufzeichnen laufenden neuronalen Aktivität. Aufgezeichneten Signale werden mit einem EXAMP-20K (Kation Scientific) Verstärker Bandpass gefiltert (0,3-8 kHz) und National Instruments Analog-Digital-Karte (NI USB-6009) eingefangen. Die Neurolux Pro Benutzeroberfläche ermöglicht die Wahl der Analogeingänge (wählen Sie zwei Kanäle für die neuronale und TTL-Signal) und Digitalausgang. Der Benutzer kann die Abtastrate (20 kHz), die Baseline-Phase (Pre-Licht) und Post-Lichtperiode zu definieren. Der Benutzer kann die TTL-Laser stimulati definierenauf Impulsbreite, Frequenz und Stimulationsdauer (wenn Frequenz 20 Hz und Stimulationsdauer beträgt 500 ms, 10 Laserpulse mit definierter Impulsbreite geliefert werden). Der Benutzer kann auch Dauerlicht Lieferung wählen (z. B. Abbildung 1). Für wiederholte Aufnahmen kann der Benutzer auch die Anzahl der Pulszüge, und das Intervall zwischen den Zügen zu definieren. Daten können mit oder ohne Aufzeichnung auf der Festplatte erfasst werden. </li><li> Nach der Aufnahme werden die Tiere mit der Ketamin / Xylazin betäubt und Cocktail transkardial mit physiologischer Kochsalzlösung und Paraformaldehyd (4%), um Optrode Platzierung und Opsin-Expression zu verifizieren durchblutet. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Eine Vielzahl von Techniken sind für genetisch-Targeting mikrobiellen Opsin-Gene auf diskrete Hirnregionen bei Nagetieren zur Verfügung. Virale Gentransfer eine relativ kostengünstige und schnelle Ansatz für die Vermittlung und ChR2 NpHR Ausdruck mit Zelltyp-Spezifität. AAV-Vektor-Systeme sind eine häufige Wahl für den Einsatz in optogenetische Experimente aufgrund der hohen Produktions Titer, die während der Lagerung, seinen Mangel an Pathogenität, und seine Fähigkeit, langfristige Genexpression 10 zu erzeugen stabil bleiben. Viele der Opsin-Konstrukte mit Zelltyp-spezifische Promotoren sind in einer Vielzahl von AAV-Serotypen von Vektor-Kerneinrichtungen wie der Universität von Pennsylvania (im Handel erhältlich <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) oder der Universität of North Carolina in Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Ein Nachteil bei der AAV-Technologie ist diebegrenzte Verpackungskapazität (~ 4,7 kb), die eine Beschränkung der Transgen-Kassette Größe, die für die zellspezifische Targeting eingesetzt werden können platziert. Als Alternative, lentivirale Vektoren, die eine größere Verpackungskapazität haben, können Opsin Targeting unter der Kontrolle von Promotorsequenzen größer aufzunehmen. Die Verwendung eines Optrode ermöglicht eine zuverlässige Erkennung von elektrophysiologischen Signalen in Kombination mit zeitlich präzise Licht Lieferung. Wie oben beschrieben, jedoch ausreichende Sorgfalt bei der Konstruktion erforderlich ist. Da die optische Faser gespalten ist zerbrechlich, kann binden den Faden zu fest bewirken, dass die Faser zu brechen. Obwohl der Optrode für mehrere Aufnahmen benutzt werden, sollte die Elektrode und die optische Faser vor dem Einsetzen gereinigt werden (oder manuell, im Fall der optischen Faser blanke Ende gespalten), da die Impedanz der Elektrode und der Qualität des abgegebenen Lichts wird abgebaut bei wiederholter Anwendung. Während electrophysiological Aufnahmen ist es wichtig, dass der Optrode langsam vorgeschoben werden. Das hier verwendete Optrode hat etwa 350 um Dicke (Wolfram-Elektrode: 125 um; Kern der Glasfaser: 200 um) und schnelle Absenken könnte die Bewegung von Hirngewebe führen. Lichtinduzierte Artefakte könnte auch mit besonderem Aufnahme-und Lichtabgabe-Set-ups 11-12 betrachtet werden. Obwohl wir fanden keinen lichtinduzierten Artefakt in unserer experimentellen Zustand können Aufnahmen außerhalb der transduzierten Gehirnbereich potentiell als Kontrolle für Licht Artefakte verwendet werden. Eine weitere Überlegung bei der Aufnahme ist die erforderliche Lichtintensität zur Beobachtung von Veränderungen in ChR2-oder-exprimierenden Neuronen NpHR, vor allem für Langzeitaufnahmen. Starke Laserintensität und langLaserBeleuchtung kann in der Gewebeschädigung und / oder eine verminderte Reaktion auf nachfolgende gelieferten Licht 12-13 führen. Für Verhaltensexperimente für ELIMINIERU die Verwendung eines viralen Vektors Steuer erforderlichg eine Wirkung aufgrund der Wärme von der Faser geliefert. Bei vielen der im Handel erhältlichen optogenetischen Konstrukte sind komplementäre Steuerkonstrukte, in denen das Opsin-Gen-Sequenz entfernt wurde. Man beachte, dass gentechnisch ChR2-Varianten mit verbesserten Eigenschaften und die Kinetik wurden zusammen mit anderen Silencing opsins, die für bestimmte experimentelle Fragestellungen 14-15 besser geeignet sein können, entwickelt werden. Zum Beispiel kann eine neue Variante ChR2 durch gezielte Mutagenese etabliert, die als &quot;cheta&quot; können High-Fidelity-Spiking-Neuronen bei Frequenzen (bis zu mindestens 200 Hz) oberhalb der ursprünglichen ChR2 14 anzutreiben. Die Kombination von in vivo Lichtabgabe und gleichzeitige Aufnahme von neuronalen Antworten ist ein entscheidender Schritt bei der Schaffung kausalen Beziehungen zwischen gemusterten Aktivität in genetisch gezielt Zellpopulationen und entsprechende Zeit-locked Verhaltens Veranstaltungen. Die Verfahren und hardware hier skizzierte einen einfachen Ansatz für die Umsetzung Optogenetik für in vivo-Kopf-Aufnahmen in festen Nagetiere.

Die Fähigkeit, einen bestimmten Zelltyp innerhalb eines neuronalen Schaltkreis in einem zeitlich präzise Mode aktivieren oder zum Schweigen zu bringen ist entscheidend für das Verständnis, wie neuronale Schaltkreise verarbeiten verschiedene Arten von Informationen Emotion und Kognition zugrunde liegen. Experimentelle Kontrolle über intakte neuronale Aktivität hat loss-/gain-of-function Werkzeuge (z. B. elektrische Stimulation, pharmakologische Modulation, Läsion), die keine beschäftigte die selektiv zur Bekämpfung spezifischer Populationen von Neuronen, entweder auf einem zeitlichen oder räumlichen Skala erforderlich. Direkt Bewältigung dieser technischen Herausforderungen ist die Entwicklung und Anwendung von genetisch codierbar lichtempfindlichen Werkzeuge Neurowissenschaftlern ermöglicht, die elektrische Aktivität des ausgewählten Zelltypen während der gut definierten Verhaltens Ereignisse. Viele dieser lichtempfindlichen Proteine ​​sind mikrobiellen Ursprungs, mit dem Licht-gesteuerten Kationenkanal, Channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, und der lichtgetriebenen Chloridpumpe, halorhodopsin (NpHR) 2,3, weit verbreitet. Ein großer Vorteil der Optogenetik ist die Fähigkeit, genetisch zielspezifische Zellpopulationen in heterogenen Hirnregionen und die Technik wurde erfolgreich in einer Reihe von Modellorganismen (wirbellose Tiere zu nicht-menschlichen Primaten) 6.4 angewendet. Es wurden viele optogenetische transgenen Tieren erzeugt und sind im Handel erhältlich 7,8 jedoch Schaffung transgener Linien können arbeitsintensiv und kostspielig ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll für viral vermittelte Abgabe von ChR2 und NpHR Gene unter der CaMKIIα Promotor in Ratten prelimbic Cortex und Rücken subiculum Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Vektor. Im Vorderhirn ist CaMKIIα Ausdruck exklusiv für glutamatergen Pyramidenzellen 9. AAV ist üblicherweise für die Grundlagenforschung aufgrund seiner relativen Einfachheit der Herstellung und das Fehlen von Pathogenität sowie verwendete starke und persiStent Transgen-Expression, die mit diesen Vektoren 10 erreicht wurde. Zusätzlich beschreiben wir die Schritte und Hardware für die gleichzeitige Aufnahme und Lichtabgabe bei narkotisierten Kopf fest Ratten.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Optogenetische Methoden als ein mächtiges Werkzeug für die Aufklärung neuronalen Schaltkreis-Aktivität eine vielfältige Reihe von Verhaltensweisen in einem breiten Spektrum von Arten zugrunde liegenden entstanden. Optogenetischen Werkzeuge mikrobiellen Ursprungs bestehen aus lichtempfindlichen Membranproteine, die in der Lage, neuronale Aktivität ingenetically definierten Zelltypen über verhaltensrelevanten Zeitskalen zu aktivieren (zB Channelrhodopsin-2, ChR2) oder Stille (zB Halorhodopsin, NpHR) sind. Wir haben zuerst einen einfachen Ansatz für Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von ChR2 und NpHR Transgenen auf die Rücken subiculum und prälimbischen Region des präfrontalen Kortex bei Ratten nachweisen. Da ChR2 und NpHR genetisch anzielbare, beschreiben wir die Verwendung dieser Technik, um die elektrische Aktivität von spezifischen Populationen von Neuronen (dh Pyramidenzellen) in heterogenen Gewebe mit hoher zeitlicher Genauigkeit eingebettet steuern. Wir beschreiben hier die Hardware, kundenspezifische SoftwareBenutzerschnittstelle, und Verfahren, die für die gleichzeitige Lichtabgabe und elektrische Aufnahme von transduzierten Pyramidenzellen in einem in-vivo-narkotisierten Vorbereitung zu ermöglichen. Diese lichtreaktions Werkzeuge bieten die Möglichkeit zum Identifizieren der kausalen Beiträge verschiedener Zelltypen, um die Informationsverarbeitung und Verhalten.

Abbildung 1 zeigt einen Screenshot der kundenspezifische Software (Neurolux Pro) in LabVIEW-Umgebung entwickelt (National Instruments) für die gleichzeitige Aufzeichnung von neuronaler Aktivität und Steuerung von Lichtimpuls-Parameter (dh Impulsfrequenz, Impulsbreite, Stimulationsdauer). Das Software-Programm sendet ein Befehlssignal zu einem digitalen Erfassungseinrichtung, die TTL-Impulse für die Kontrolle über die einzelnen Diodenlaser erzeugt. Zusätzlich werden die Software-Programm zeigt und speichert die aufgezeichneten neuronalen Aktivität und TTL-Signale geliefert. Diese Signale werden durch die Erfassungseinrichtung bei einer definierten Abtastrate (z. B. 20 kHz) digitalisiert. Zeichneten Signale werden als ein zweidimensionales Array mit doppelter Genauigkeit in einer Binärdatei gespeichert. Figur 2 zeigt die individuelle Optrode bestehend aus einer Wolframelektrode mit einer optischen Faser befestigt ist. Eine optische Faser wird an der Elektrode unter Verwendung dünner Faden an drei festenPunkten. Falls erforderlich, können Super-Klebstoff verwendet werden, um ihnen zu haften. Allerdings vermeiden dauerhaftes Fixieren der optischen Faser an die Elektrode, denn obwohl die Elektrode mehrmals Lichtübertragung durch die Faser wieder verwendet werden bei wiederholtem Gebrauch verschlechtern und sollten gespalten und gereinigt oder mit jedem Einsetzen in das Gehirn zu ersetzen. Linke Platten aus Abbildung 3 zeigen Fluoreszenzbilder der verstärkten gelb fluoreszierendes Protein, Anzeichen für eine tatsächliche und ChR2 NpHR Ausdruck. Diese Fotografien zeigen repräsentative NpHR Ausdruck in Rattenrücken subiculum (3A) und ChR2 Ausdruck in prälimbischen Kortex (3B). Viral-Expression wurde vor allem auf die Rücken subiculum und prälimbischen Kortex beschränkt (z. B. einige Fluoreszenz in Gyrus dentatus (Abbildung 3A, links)). Es wurden auch die Spuren der Elektrode (dünne Spur, Pfeilkopf) und Glasfaser (dicke Spur, Pfeil) beobachtet. Abbildung 4 zeigt, dass ChR2 induziert zeitlich präzise Spick in Ratten prälimbischen Kortex. 4A ist ein Beispiel Spur von ChR2 ausgelöste Aktionspotentiale in Reaktion auf 20 Hz Lieferung von 10 ms blauen Lichtimpulse Ratte prälimbischen Cortex. Raster Grundstück (4B) zeigt ChR2-induzierte Aktivierung in sechs Vertreter Neuronen. Alle aufgezeichneten Neuronen zeigte Licht-evozierte Spicken mit perfekter Treue. Im Gegensatz zu ChR2, NpHR schnell und reversibel spontane Aktivität in vivo in Ratten prälimbischen Kortex (rechts von Abbildung 4) zum Schweigen gebracht. 4C ist ein Beispiel zeigt, dass eine kontinuierliche Spur 532 nm Beleuchtung (10 s) der prälimbischen Kortex exprimieren NpHR unter der CaMKllα Promoter beseitigt spontane Single-Unit-Aktivität in vivo. Beachten Sie, dass die komplette Silencing prälimbischen Pyramidenzellaktivität ist zeit gesperrt, um die 10 Sek. Dauerlicht Lieferung. Niedriger Raster Grundstück (4D) zeigt NpHR-induzierten Silencing in sechs Vertreter Neuronen. Sowohl in vivo-Aufnahmen sind typisch für diejenigen von erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten erhalten, in dem AAV-vermittelte Abgabe von mikrobiellen Opsin Gene trat 18-21 Tage vor. Figur 5 zeigt das Ergebnis der wiederholte ChR2 Stimulation einer Ratte prelimbic Pyramidenzelle. Blaue Lichtimpuls (10 ms) wurde bei 20 Hz für 5 sec (100 Impulse gesamt) ausgeliefert. Spannung Spuren des Lichts hervorgerufenen Spick wurden immer wieder alle 2 Minuten während einer 2 Stunden Aufnahme-Session (61 Wiederholungen insgesamt) erworben. Selbst bei der Verwendung dieses wiederholende Stimulationsprotokoll, ChR2 induzierte stabile und robuste Spick in Reaktion auf die Lichtabgabe. 6 und 7 zeigen die Ergebnisse der NpHR-induzierte Photoinhibition und ChR2-driven Photoaktivierung von Ratte subicular Neuronenaktivität. Wie es der Fall in prelimbic Hirnrinde waren NpHR und ChR2 Lage,vermitteln die lichtinduzierte zeit gesperrt Hemmung und Aktivierung der Opsin-transduzierte subicular Neuronen mit hoher Reproduzierbarkeit. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Screenshot der Neurolux Pro-Software-Schnittstelle für die gleichzeitige Lichtabgabe und elektrophysiologische Aufnahme. Abgebildet Trace zeigt NpHR induzierten Silencing der spontanen Aktivität der Ratte prälimbischen Pyramidenzellen als Reaktion auf 10 Sek. Dauer 532 nm Lichtabgabe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> 2. Hohe Leistungs Bild von benutzerdefinierten Optrode. Eine optische Faser wird in Glaskapillare mit einer Wolframelektrode angebracht ist und mit der Elektrode mittels Faden fixiert. Der Abstand von Mitte zu Mitte zw.een die Elektrodenspitze und der Faserspitze ist etwa 500 um. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> 3. Viral-Expression und Optrode Platzierung. (Links) Fotos zeigen repräsentative NpHR Ausdruck in Rücken subiculum (A) und ChR2 Ausdruck in prälimbischen Kortex (B). (Rechts) Schematische, die den Ort, wo jedes Foto aufgenommen wurde darstellt. Die Pfeilspitze und Pfeil in jeder Photographie zeigen den Ort der Wolframelektrode und der optischen Faser auf. SUB: subiculum, DG: Gyrus dentatus, PL:. Prälimbischen Kortex <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Abbildung 4. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen von ChR2 oder NpHR-transduzierte Ratte prelimbic Kortex. (A) Beispiel Spur von ChR2 ausgelöste Aktionspotentiale in Reaktion auf die Lieferung von 20 Hz Blau (473 nm) Lichtpulse (10 ms, blauer Balken). (B) Raster Diagramm, ChR2-induzierte Spick in sechs Vertreter Neuronen. Jede Aktivität wird als Punkt aufgetragen. (C) Beispiel Spur von NpHR-induzierte Unterdrückung der spontanen Aktivität im Dauer Grün (532 nm) Lichtbeleuchtung (10 sec, grüner Balken). (D) Raster Diagramm, NpHR-induzierten Silencing in sechs Vertreter Neuronen. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> 5. Repetitive 20 Hz ChR2 getriebenen Spick einer Ratte prälimbischen Pyramidenzelle in vivo. (A) Spannung Spuren der Licht-evozierte Spickzu den Zeitpunkten 0, 30, 60, 90 übernommen, 120 min nach Beginn der Aufzeichnungen. (B) Diagramm, Raster alle 61 Wiederholungen (2 min inter-trial-Intervall, 120 min Gesamt) der lichtinduzierten Aktivierung. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Abbildung 6. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen aus NpHR-transduzierte Rattenrücken subiculum. (A) Beispiel-Trace zeigt, dass 10 Sek. Dauer 532 nm Beleuchtung (grüner Balken) der Rücken subiculum ausdrücken NpHR beseitigt spontane Aktivität. (B) Durchschnittswellenformen der beiden aufgezeichneten Einheiten aus der obigen Spur. Die Amplitudenschwelle zum Identifizieren zwei unterschiedlichen Neuronen verwendet. (C) Raster Grundstück mit fünf Wiederholungens NpHR induzierten Silencing dieser Einheiten. Jede Aktivität wird als Punkt aufgetragen. <img alt="Fig. 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Abbildung 7. Repetitive 20 Hz CR2-driven Spick einer Ratte Rücken subicular Neuron in vivo. (A) Spannungs Spuren des Lichts hervorgerufene Spiking zu den Zeitpunkten 0, 30, 60 übernommen, 90, 120 min nach Beginn der Aufzeichnungen. Einschub: Platzen typische Aktivität dieser Zelle. (B) Diagramm, Raster alle 61 Wiederholungen (2 min inter-trial-Intervall, 120 min Gesamt) der lichtinduzierten Aktivierung. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als &quot;Optogenetik&quot;, ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

18.9K Aufrufe.  University of Colorado Boulder.  Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzel...

Serie: A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

In-vivo-Elektrophysiologische Messungen an Maus Ischiasnerven

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.