Die Autoren danken der TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) und NIH R21CA152473 für die Unterstützung.

Ein. Zellaussaat <ol><li> Lassen Sie keine Zellen auf overconfluency wachsen. Verwenden frühen Passage Zellen, wenn Transfektion primärer Zellen. </li><li> Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion der Zellen trypsinieren Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnt die Zellsuspension mit Medien, um die gewünschte Zelldichte (Zellen / Volumen) zu erreichen. Seed Zellen in klare Gewebe mit flachem Boden 96-Well-Platten mit einem Reservoir und Mehrkanal-Pipetten Kultur behandelt. Die gewählte Dichte sollte 70-80% Konfluenz am Tag der Transfektion. Zum Beispiel, wie in Tabelle 1 dargestellt, wurden die Zellen auf 25 bis 50 Zellen / ul für die Transfektion Daten abgebildet verdünnt. </li></ol> 2. Zelltransfektion <ol><li> Dilution von Polymer und DNA Aktien. Auftauen Polymer und DNA Stammlösungen bei Raumtemperatur (RT). Verdünnte Polymer-Stammlösung und DNA Stocklösung, getrennt in klaren 96-Well-Platten unter Verwendung eines Zwölf-Kanal-Pipette, Mit dem geeigneten Lösungsmittel, um Konzentrationen erforderlich, um die gewünschte DNA zu Polymergewicht Gewichtsverhältnissen (Gewicht / Gewicht) zu erhalten. In diesem Fall ist das gewählte Lösungsmittel 25 mM Natriumacetatpuffer (pH = 5,2). <ol><li> DNA-Verdünnung. Typischerweise wird die DNA mit 1 mg / ml gelagert Natriumacetat-Puffer auf eine Konzentration von 0,03 bis 0,06 mg / ml in einem klaren, nicht Gewebekultur-behandelten Platte mit 96 Vertiefungen (eine Vertiefung für eine einzelne Formulierung) verdünnt. Tabelle 2 zeigt, die typische DNA-Verdünnung Protokoll für einen einzigen Formulierung verwendet, um vier replizieren Wells in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit Zellen aus Schritt 1 ausgesät transfizieren. </li><li> Polymer Verdünnung. Die 100 mg / ml Polymer / DMSO-Lösung wird in Natriumacetatpuffer gemäß der Konzentration, die erforderlich, um das gewünschte Polymer zu DNA wt / wt-Verhältnis zu erhalten verdünnt. Der Bereich der wt / wt-Verhältnisse typisch für die Genabgabe mit Poly (beta-Aminoesters) s (PBAEs) eingesetzt ist 20 bis 100 ist. PBAE Polymere ersten bis 10 mg / ml verdünnt, gefolgt von der Verdünnung pROTOKOLL wie in Tabelle 3 gezeigt. Die Polymer-Verdünnungen in einem klaren, nicht Gewebekultur-behandelten Platte mit 96 Vertiefungen, die die Probe Orientierung des DNA Verdünnungsplatte übereinstimmt durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Nanopartikelbildung. Hinzufügen des PBAE Lösung zu einem gleichen Volumen der Plasmid-DNA-Lösung mit einer Zwölf-Kanal-Pipette und kräftig schütteln. Lassen Sie die Mischung inkubieren bei RT für 10 min bis self-assembly ermöglichen. </li><li> Nanopartikel Transfektion. Nach Selbstorganisation werden 20 ul pro Vertiefung Nanopartikel zum Kulturmedium tropfenweise über das Zwölf-Kanal-Pipette zugegeben. Die Wells werden unbehandelt oder mit im Handel erhältlichen Reagenzien als Kontrollen transfiziert. Die transfizierten Zellen werden bei 37 ° C für zwei bis vier Stunden und dann die Vertiefungen werden mit frischem Medium (100 pl / Vertiefung) ersetzt. Die Wahl der Inkubationszeit wird auf der Zelllinie Kulturbedingungen, und Transfektion Systems abhängen. Der Unterschied bei der TransfektionseffizienzEffizienz und Zelltoxizität als Ergebnis unterschiedlicher Inkubationsdauer wird durch die Analyse-Protokoll in Schritt 3 beschrieben quantifiziert werden. </li></ol> 3. Analyse der Transfektionseffizienz und Zelltoxizität Transfektionseffizienz wird visuell mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert und quantifiziert unter Verwendung eines Durchflusszytometers 48 Stunden nach der Transfektion. Zelltoxizität wird visuell mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert und quantifiziert unter Verwendung des 96 CellTiter wässrigen Einkomponenten-Assay 24 Stunden nach der Transfektion. <ol><li> Fluoreszenzmikroskopie. Optisch analysieren die Vertiefungen für die Expression des transfizierten Reportergens (beispielsweise EGFP oder DsRed) unter Verwendung der entsprechenden Fluoreszenz-Kanal. Erwerben Sie Bilder für jeden gut, die Wahl Sichtfelder, die entsprechend stellen die Transfektionseffizienz für die jeweiligen Formulierungen (Abbildung 1). Notieren Sie sich jeden Zelltoxizität visuell beobachtet. </li><li> Durchflusszytometrie. <ol><li> Verwenden Sie Mehrkanal-Pipetten, um die 96-Well-Platte für die Durchflusszytometrie vorzubereiten. Waschen mit PBS, mit 30 ul / Vertiefung von Trypsin / EDTA, mit 170 ul FACS-Puffer (PBS + 2% FBS) zu neutralisieren, Pipette nach oben und unten in jede Vertiefung, einschließlich an den Kanten trypsinieren, und übertragen Sie die gesamte 200-ul Volumen von jede Vertiefung in entsprechende Vertiefungen in einer Hin-und Boden-oder V-96-Well-Platte. </li><li> Zentrifuge die Platte bei 130 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen 170 ul Medien von jedem gut und Pipette resuspendieren Zellen unter Vermeidung Blasen. So verwenden Sie eine Lebensfähigkeit wie Propidiumiodid (PI) zu färben, fügen Sie 10 ul FACS-Puffer + PI (50:1 FACS-Puffer: PI Verdünnung; PI Lager Konzentration 1 mg / ml) in jede Vertiefung. Sofort auf Eis legen und decken von Licht. </li><li> Starten Sie den C6 Accuri Durchflusszytometer, die HyperCyt 96-well Anlage, und die HyperView Software. Verwenden HyperView Design und Protokoll Registerkarten, um die entsprechende p wählenspäten Typs, Platinenlayout und andere Einstellungen wie Shake / sip / spülen / schütteln Zeit. Für die oben Protokoll wurden die folgenden Parameter verwendet, eine pre-Platte prime für eine Minute und eine Pre-Platte shake für 30 sec bei 2.400 Umdrehungen pro Minute. Sip Zeit für 15 Sekunden bei 15 Umdrehungen pro Minute eingestellt, spülen eine Sonde jeder gut für 2 sec und eine inter-gut schütteln alle 12 Brunnen für 12 sec bei 2.400 Umdrehungen pro Minute. Die zwischen Bohrlöchern Shake ist wichtig, dass die Zellen dispergiert in den Medien, sowie für eine verbesserte Fähigkeit, um die Daten, indem zeitlich zwischen Gruppen von Vertiefungen (in diesem Fall 12 sek) zu verarbeiten. </li><li> Verwenden HyperView Nun Registerkarte Identifikation die Daten und trennen sich in die entsprechende Vertiefung (Abbildung 2) zu verarbeiten. Um die einzelnen Vertiefungen zu erkennen, kann es helfen, die Software-Rauschfilter, sowie eine Basis sogar Filter unter den erweiterten Einstellungen zu verwenden. </li><li> Quantifizierung Prozentsatz der positiv transfiziert lebenden Zellen durch geeignete Gating verschiedenen Pop trennenulations (Abbildung 3). Erste Seite Flow-Daten auf einem FSC vs SSC Streudiagramm, um einzelne Zellen aus Schutt (Abbildung 3A). Wenn Propidiumiodid (PI) verwendet wurde, Tor der einzelnen Zellpopulation und Ansicht, dass Daten auf einem FSC vs FL3 Grundstück, um lebende Zellen von toten Zellen und Gate die lebenden Zellen zu trennen. Um die Anzahl der transfizierten Zellen zu quantifizieren, das Live-Zellpopulation auf die entsprechenden Kanäle, beispielsweise GFP in FL1 gesehen werden. Verwendung des unbehandelten Population, die unbehandelten Zellen Gate, um das Hintergrundsignal (3B) zu identifizieren. Die positiv transfizierten Zellen können dann isoliert mit diesen Gate und durch Anzeigen der transfizierten Populationen unter Verwendung sowohl streuen und Konturplots (3C und 3D). Es kann ein Kontinuum von positiv transfizierten Zellen sein, da unterschiedliche Zellen an verschiedenen Graden an Fluoreszenz transfiziert wird. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 wässrige One-Assay <ol><li> Transfizieren andere Platte in gleicher Weise für Zelltoxizität Messungen. </li><li> Vormischung 1 ml der wässrigen Einkomponenten CellTiter 96 Assaylösung mit 10 ml frischem Medium. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und verwenden Sie eine Multikanal-Pipette bis 110 ul der vorgemischten Lösung + Medien pro hinzufügen. </li><li> Die Extinktion bei 490 nm jede Stunde Intervall von 1 bis 4 Stunden, bis die Absorption aus dem Bohrloch zu unbehandelten Zustand ist im linearen Bereich des Assays. Gehören vier Kontrollvertiefungen mit einzige Lösung + Medien für einen Hintergrund Extinktion. </li><li> Durchschnittliche die Absorption Werte aus den vier replicate Wells pro Zustand und subtrahieren die durchschnittliche Hintergrundabsorption voneinander Durchschnitt. Normalisieren Sie die korrigierte Durchschnitt für jeden behandelten Zustand der korrigierten Mittelwert der unbehandelten Zustand, um die prozentuale Zellviabilität zu bestimmen. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. Nanopartikel Sizing mit NTA und Plasmid Per Particle Berechnungen <ol><li> Prime die Fluidik-System der NanoSight NS500, indem Sie das Verdünnungsmittel Pumpe nach vorne bei etwa 1:5 die maximale Geschwindigkeit und die Probe Pumpe rückwärts bei etwa 1:10 die Höchstgeschwindigkeit. Fortfahren, bis die Fluidik-System mit Verdünnungsmittel gespült wird. </li><li> Vorbereitung der Nanopartikel analysiert werden. Im Fall von PBAEs, getrennt verdünnt das Lager Plasmid-DNA (1 mg / ml) und Lager PBAE (100 mg / ml) in Natriumacetat-Puffer (25 mM, pH 5) in Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Verdünnt das Plasmid-DNA-Konzentration auf 0,06 mg / ml. Polymer-Konzentration kann je nach dem erforderlichen Gewicht-Gewicht-Verhältnis von Polymer zu DNA (zum Beispiel für 60 wt / wt Teilchen wird Polymer zu 3,6 mg / ml verdünnt). </li><li> Hinzufügen der Polymerlösung zu einem gleichen Volumen der Plasmid-DNA-Lösung und mischt kräftig. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 10 min bis Selbstorganisation ermöglichen. </li><li> DiLaute die Nanopartikel-Lösung 100-fach in PBS, damit die Konzentration Nanopartikel in den geeigneten Bereich für NTA sein und um ein Endvolumen von mindestens 500 ul zu erhalten. </li><li> Laden der Probe in die NanoSight indem das Einwurfrohr in der Probe Eppendorfröhrchen (4A). Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. </li><li> In Capture-Modus, erhöht die Kamera waagerecht bis alle Partikel zu sehen. Stellen Sie den Fokus, so dass die Partikel glatter aussehen (4A und 4B). </li><li> Während im Standard-Modus, stellen Sie die Kamera waagerecht über den Punkt, dass alle Partikel auf dem Bildschirm zu sehen sind. Dann verringert sich die Kamera in der untersten Ebene, so dass die Teilchen alle noch beobachtet werden kann. Wenn ein Zwischenprodukt Kamera-Ebene erforderlich, in fortgeschrittenen Modus und ändern Sie den Kamera-Auslöser und gewinnen den entsprechenden Ebenen. </li><li> Sichtprüfung sicherstellen, dass es zwischen 20 bis 100 Teilchen auf der screen. Eine ideale Zahl für Nanopartikel Tracking ist etwa 50 Teilchen. Wenn es zu viele oder zu wenige sind, spülen Sie das NS500, passen Sie die Verdünnung in PBS, und wieder laden die Probe. </li><li> Stellen Sie die Dauer des Imports nach dem Standard-Tabelle. Typisch 30 - 60 sec ist eine geeignete Erfassung Länge (4B). </li><li> Um die nächste Probe laden, spülen Sie das System, dann erneut laden die neue Probe. </li><li> Einmal Videos erfasst werden, um die Verarbeitung der Bühne gehen durch die Eröffnung einer Videodatei. </li><li> Es gibt eine Reihe von Parametern, die abgestimmt werden kann, um zur bestmöglichen verarbeiten ein Video (4C). Das Ziel ist es, Parameter auswählen, die am besten zu erfassen jedes Partikel auf dem Bildschirm, wie durch ein rotes Kreuz Zeichen auf dem Bildschirm über jedes Teilchen (Abbildung 5) dargestellt. </li><li> Erhöhen Sie den Bildschirm Gewinn um besser sehen die Partikel. Unter dem Standard-oder erweiterten Modus, wählen Sie das Auto für die Parameter einstellen, indem ClickIng die entsprechenden Felder ein. In dem Fall, dass die automatischen Einstellungen nicht angemessen auszuwählen Partikel setzen, klicken Sie erneut die Box und manuell die Parameter (4C). </li><li> Sobald alle Partikel werden auf dem Bildschirm ausgewählt, klicken Sie auf die Schaltfläche Prozess der Software, um die Videodatei (4C) zu verarbeiten. Dies bietet die Teilchengrößenverteilung, Größendurchschnitte sowie Partikelkonzentration. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Partikelkonzentration genau ist, ändern Sie die PBS Verdünnung, z. B. durch zunehmende Verdünnung durch 2x, und wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang. Messen mehrerer Verdünnungen derselben Probe wird empfohlen, dass die Konzentration Messung der Probe genau ist. Eine gute Auswahl für die Messung ist 10 7 -10 9 Partikel / ml. </li><li> Sicherstellen, dass alle Plasmide in Nanopartikel werden durch Ausführen Gelelektrophorese der Nanopartikel und Evaluieren, ob beliebige freie DNA vorliegt eingearbeitet.Wenn nicht alle Plasmide eingekapselt sind, verwenden Standard-Techniken zur DNA Absorption zu messen, um insgesamt gekapselte Plasmide zu quantifizieren. </li><li> Die durchschnittliche Anzahl von Plasmiden pro Partikel dividieren die Gesamtzahl eingekapselten Plasmidkonzentration von der NTA gemessene Teilchenkonzentration. Um das Plasmid pro Partikel Probenverteilungssystem abzuschätzen, zuerst die NTA Teilchengröße Histogramm, um den Volumenanteil der jeweiligen 1-nm-Bin der Teilchen zu berechnen. Multiplikation dieses Volumenanteils Verteilung durch die gesamte Plasmid Betrag, um die Anzahl von Plasmiden in jedem Bin erhalten. Unterteilen diese Nummern durch die Anzahl der Teilchen in jedem Fach, um die Anzahl von Plasmiden-per-Teilchens für jede Teilchengröße (Abbildung 6) zu erhalten. </li></ol>

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Die Autoren berichten, keine Interessenkonflikte.

Die Protokolle über beschreiben Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit der Transfektion von Nanopartikel-Formulierungen sowie einen Weg, um die Teilchengröße und DNA Beladung der Nanopartikel zu charakterisieren. Die Anzahl von Plasmiden pro Partikel ist ein wichtiger Parameter, der zur Vorhersage der Wirksamkeit der Partikel kann und kann auch für Dosisermittlung verwendet werden. Nanopartikel Tracking-Analyse kann in einem Bereich von unterschiedlichen wässrigen Lösungen, wie solche, die sich in der Salzkonzent...

Die Bestimmung der Anzahl von Plasmiden pro Nanopartikel komplexiert ist eine wirksame Nanopartikel-Genabgabe Strategien, insbesondere zum Zusammenwirken Bereitstellung von mehreren Plasmiden zur selben Zelle Target gestalten, wie es oft in Stammzelle Umprogrammierung Studien 12 erforderlich. Einige Ansätze, um die Anzahl von Plasmiden mit einer einzelnen Nanopartikel assoziiert berechnen beschrieben worden sind, und jeder Ansatz hat Nachteile in den Techniken zur Abschätzung 13-16 verwendet. Quantenpunkt (QD) Markierung mit TEM kombiniert wurde verwendet, um Plasmide pro Teilchen in Chitosan basierende Nanopartikel abzuschätzen. Die Möglichkeit, dass verkapselte unmarkierten DNA nicht direkt erfasst;; potentiell überlappenden Plasmiden und QD in den 2D-TEM-Aufnahmen der Partikel; Schätzung mit diesem QD Technik ist aufgrund der Notwendigkeit, die DNA, die ihre Selbstorganisation Eigenschaften verändern kann beschriften kompliziert und anderen vereinfachenden Annahmen 13. Ein alternativer Ansatz, a istpplicable wenn bestellt Mikrodomänen in den Teilchen vorhanden sind verwendet worden, um Lipopolyamin-DNA-Komplexe mittels Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Cryo-TEM), Röntgenstreuung und dynamische Lichtstreuung (DLS) 14,15 studieren. Leider sind Materialien wie die polymeren Nanopartikel hier untersuchten entfällt bei dieser Methode. In einer anderen Studie verwendet Collins et al eine Strömung Teilchenfluß-Bildanalyse Technik zu studieren (Lys) 16-enthaltende Peptid / DNA-Komplexen;. Jedoch ihre Methode nur auswerten größeren, Mikrometergröße Partikel 16. Somit haben wir kürzlich entwickelte eine neuartige flexible Assay, um die Anzahl von Plasmiden pro Nanopartikel 11 quantifizieren.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumacetatpuffer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Verdünnen bis 25mm in deionisiertem Wasser </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI-, verzweigte </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 wässrige One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialien </td></tr><tr><td> Klar flacher Boden 96-Well-Platte, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Klare Rundboden 96-Well-Platte, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-Kanal-Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 und 50-300 ul </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Modellnummer: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt Anlage </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Nicht-virale Gentransfer unter Verwendung von polymeren Nanopartikeln als attraktiver Ansatz für Gentherapie zur Behandlung genetischer Krankheiten 1 und als Technologie für die regenerative Medizin 2 entstanden. Im Gegensatz zu Viren, die erhebliche Sicherheitsprobleme haben, können Polymernanopartikel gestalten als nicht-toxisch, nicht-immunogenen, nicht-mutagen, leichter zu synthetisieren, chemisch vielseitig für die Beförderung von Fracht größeren Nukleinsäure und biologisch abbaubare und / oder ökologisch anspricht werden. Kationischen Polymeren mit negativ geladenen DNA über elektrostatische Wechselwirkung auf Komplexe in der Größenordnung von 100 nm, die üblicherweise polymere Nanoteilchen bezeichnet bilden selbst zusammen. Beispiele von Biomaterialien verwendet werden nanoskalige polykationischen Genabgabe Nanopartikel bilden, umfassen Polylysin, Polyphosphoester, Poly (Amidoamine) s und Polyethylenimin (PEI), welches ein nicht-abbaubaren off-the-shelf kationisches Polymer ist üblicherweise für Nukleinsäurelieferung 1,3 verwendet. Poly (beta-aminoEster) s (PBAEs) sind eine neuere Klasse von kationischen Polymeren, die hydrolytisch abbaubare 4 5,6 sind und es wurde gezeigt, die bei Gentransport zu hart zu transfizierende Zelltypen wie menschlichen retinalen Endothelzellen (HRECs) 7 wirksam, Maus Brustepithelzellen 8, menschliche Gehirn Krebszellen 9 und makrovaskuläre (humane Nabelschnur, HUVECs) Endothelzellen 10. Ein neues Protokoll zu polymeren Nanopartikel nutzen Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) charakterisieren beschrieben. In diesem Ansatz wird sowohl die Korngrößenverteilung und die Verteilung der Anzahl von Plasmiden pro Partikel 11 erhalten. Zusätzlich wird ein Hochdurchsatz-96-Well-Platte für Transfektions-Assay schnelle Screening der Transfektion Wirksamkeit von polymeren Nanopartikeln vorgestellt. Bei diesem Protokoll, Poly (beta-Aminoesters) s (PBAEs) als Modell Polymeren und menschlichen retinalen Endothelzellen (HRECs) verwendet werden als mo benutztdel menschlichen Zellen. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um jegliche polymere Nanoteilchen und eine beliebige Zellart von Interesse in einer Multiwellplatte Format auswerten.

Abbildung 1 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines Beispiels für eine erfolgreiche Transfektion HRECs mit der EGFP-Plasmid. Die Hellfeld Bild ist hilfreich, um sicherzustellen, dass die Zellen ihre übliche Morphologie erhalten. Zusätzlich können Zelllebensfähigkeit Assays, wie MTS oder ähnliche Assays verwendet, um die Toxizität von Nanopartikeln 7 zu bewerten. Durchflusszytometrie, wie beschrieben, verwendet, um die Transfektionseffizienz zu quantifizieren. Bei Verwendung...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Ein Protokoll für Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) und High-Throughput-Durchflusszytometrie, polymere Gentransfer Nanopartikel evaluieren beschrieben. NTA eingesetzt wird, um die Nanopartikel Teilchengrößenverteilung und das Plasmid pro Teilchenverteilung charakterisieren. High-throughput Durchflusszytometrie erlaubt die quantitative Transfektion Wirksamkeitsnachweis für eine Bibliothek der Gentransfer Biomaterialien.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. Ein Protokoll für Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) und High-Throughput-Durchflusszytometrie, polymere Gentransfer Nanopartikel evaluieren beschrieben. NTA eingesetzt wird, um die Nanopartikel Teilchengrößenverteilung und das Plasmid pro Teilchenverteilung charakterisieren. High-throughput Durchflusszytometrie erlaubt die quantitative Transfektion Wirksamkeitsnachweis für eine Bibliothek der Gentransfer Biomaterialien.

Serie: Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Formulierung von Diblock Polymernanopartikel durch Nanopräzipitation Technik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Forschung

Biotechnik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash-NanoPrecipitation für die Kapselung der hydrophoben und hydrophilen Verbindungen in Polymeren Nanopartikel

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...