Die Autoren danken allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Cobb-Labors für wertvolle Arbeit und Diskussionen und Dionne Ware für administrative Unterstützung. Diese Studien wurden von National Institutes of Health Grant R37 DK34128 und Welch Foundation Grant I1243 an MHC unterstützt

1. Kinase Purification Resources und allgemeine Immunopräzipitation Pipeline ANMERKUNG: Kinasen zur Verwendung mit diesem Assay können aus Immunopräzipitaten von kultivierten Zellen oder durch rekombinante Mittel, wie Affinitätsmarkierte Reinigung 6, bezogen werden. Unten ist ein allgemeines Protokoll für Flag-markierte Immunpräzipitation, die möglicherweise abhängig von der Kinase von Interesse geändert werden müssen. Alles sollte auf Eis gehalten werden, wenn möglich. <ol><li> Füge 2 μl 1 mg / ml Antikörper zu 200 μl Zelllysat (üblicherweise ~ 1 mg / mL Gesamtproteinkonzentration) zu und inkubiere bei 4 ° C für 1 h während des Schwingens. </li><li> Waschen von Protein A Sepharoseperlen 2-3 mal mit Lysepuffer (siehe unten) durch kurzes Spinnen bei 4 ° C für 30 s bis 1 min bei 5.000 xg (&quot;Touch Spin&quot;), Entfernen des Überstandes mit einer Pipette und Resuspendieren von Perlen in Puffer . <ol><li> Vorbereitungs-Lyse-Puffer: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 10% Glycerin, 0,2 mM Natriumorthovanadat, 100 mM Natriumfluorid, 50 mM β-Glycerophosphat, 0,1% Triton X 100 oder 0,1% NP-40. </li></ol></li><li> Füge 30 μl 50% ige Aufschlämmung von Protein A-Sepharoseperlen in Lysepuffer zu Lysaten hinzu; Bei 4 ° C für 1 h bei Schaukeln inkubieren. </li><li> Berührungsspin bei 4 ° C, um die Perlen zu pellet und den Überstand zu entfernen. </li><li> 3 mal mit 1 ml Wulstwaschpuffer (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4) waschen. </li><li> Waschen Sie einmal mit 1x Kinase-Reaktionspuffer (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl 2 ). So viel Puffer wie möglich entfernen, ohne Perlen zu entfernen. </li></ol> 2. Initialisierung von Kinase-Reaktionen ANMERKUNG: Für IP-Kinase-Assays sind ~ 15 μl nicht suspendierte Perlen eine typische Ausgangsprobe. Für rekombinante Proteinkinase-Assays liegen typische Ausgangsmengen im Bereich von 0,1-1,0 μg in 1-10 für 25-50 μl Endreaktionsvolumina. Passen Sie die Volumina der rekombinanten Proteinprobe anS mit dem Puffer gleich sein, den sie vor der Initialisierung des Assays gespeichert haben. Bei der Verwendung von hohen Mengen an Kinase, schließen Sie ein Trägerprotein wie BSA ein, um die Aufrechterhaltung der Proteinstabilität für die Dauer des Assays zu unterstützen. <ol><li> Bereiten Sie den unten angegebenen 5x-Kinase-Reaktionspuffer vor: 50 mM HEPES pH 8,0 50 mM MgCl &amp; sub2 ; 50 mM Benzamidin (Protease-Inhibitor) 50 mM DTT (Reduktionsmittel) 250 μM ATP (unmarkiert oder &quot;kalt&quot;) </li><li> Halten Sie Kinaseproben auf Eis in 1,5 ml Röhrchen. Bereiten Sie die folgende Reaktionsmischung in getrennten, gekühlten 1,5 ml-Röhrchen vor: 21 &amp; mgr; l H 2 O 6 &amp; mgr; l 5 × Kinase-Reaktionspuffer 1 &amp; mgr; l radioaktiv markiertes (&amp; ldquor; heißes &quot;) ATP 2 &amp; mgr; l Substrat (&amp; ndash; 5 mg / ml) ANMERKUNG: Für rekombinante Kinase-Assays kann das Volumen angepasst werden, um gereinigtes Protein unterzubringen. Berechnen Sie, dass das Endreaktionsvolumen 30 μl beträgt. Verwenden Sie dieses Rezept, um einen Master vorzubereitenmischen. Nach dem Empfang von markiertem ATP, verdünntem Bestand in H &amp; sub2 ; O zu einer spezifischen Aktivität von 0,01 mCi / &amp; mgr; l vor der Zugabe zu Reaktionsmischung. </li><li> Um den Assay zu initialisieren, wird die gesamte Reaktionsmischung zur Kinaseprobe zugegeben und die Reaktion bei 30 ° C für 5 min bis 1 h inkubiert, abhängig von der Aktivität der zu untersuchenden Kinase. HINWEIS: Bei der Arbeit mit einer Kinase, deren Aktivität bisher nicht getestet wurde, führen Sie einen zeitlichen Verlauf der Kinaseaktivität mit 5 Minuten Intervallen zwischen den Zeitpunkten durch. </li></ol> 3. Reaktionsbeendigung und SDS-PAGE <ol><li> Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie auf Eis setzen und 7,5 μl 5x Laemmli Probenpuffer 6 hinzufügen. </li><li> Hitze bei 100 ° C für 30 s bis 2 min in Hitzeblock. </li><li> Touch-Spin und laden 20 μL pro gut auf 10-15% SDS-PAGE Gel. Führen Sie das Gel lang genug, um die Kinase und das Substrat zu trennen (typischerweise 1 h bei konstanter Leistung von 5 W). Achten Sie darauf, dass die Gel-Apparatur abgeschirmt ist, um die Exposition gegenüber 32 zu begrenzen </suP&gt; P. <ol><li> Hier verwenden Sie hausgemachte Gelapparate, aber handelsübliche Mini-Gele eignen sich hervorragend. Verwenden Sie die Maße wie folgt: Gels: 8 cm Breite, 5,5 cm Länge (Auflösen), 1,5 mm Dicke. Kämme: 15 Vertiefungen, 1,5 mm Dicke, 2,9 mm Breite, 16 mm Tiefe </li></ol></li></ol> 4. Gel-Färbung und Trocknung Achtung: Für alle Schritte unbedingt die persönliche Exposition gegenüber 32 P durch radioaktive Abschirmung und das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung reduzieren. Für weitere Informationen zu bestimmten Schritten sind einige hilfreiche Referenzen enthalten. <ol><li> Entfernen Sie das Gel aus Glas / Aluminiumoxid-Platten und legen Sie es in 50 ml Coomassie-Fleck (10% Eisessig, 50% Methanol, 0,25% R-250-Farbstoff) für 1 h auf einem Orbitalschüttler auf 50 U / min. Für diesen Schritt einen Behälter verwenden, der etwas größer ist als das Gel selbst. 8 </li><li> Das Gel vom Fleck zur Fixierlösung bewegen (10% Eisessig aciD, 20% Methanol), um zu entfärben. Fang das Gel in 600-700 ml Fixierlösung über Nacht auf Orbitalschüttler bei 50 U / min. Legen Sie Stücke von Schaum oder geknoteten Labor-Wischtücher in den Behälter mit dem Gel, um den Coomassie-Farbstoff 8 , 9 zu absorbieren. </li><li> Gel von der Fixierlösung entfernen und in 200 ml Methanol für 1-2 min unter leichtem Rühren einweichen, bis das Gel milchig weiß wird. Dies wird dazu beitragen, Risse während des Trocknungsschrittes zu verhindern. </li><li> Nass ein 14 cm x 14 cm Stück qualitatives Filterpapier mit Methanol und auf Platten-Gel-Vakuumtrockner stellen. Legen Sie das Gel auf die Filterpapier-Vorderseite nach oben. </li><li> Bedecken Sie das Gel mit Plastikfolie sorgfältig, um Falten und Luftblasen zu vermeiden. Den Trockner für 1,5 h bei 80 ° C laufen lassen. Nachdem das Vakuum erreicht wurde, öffnen Sie den Deckel und rollen alle Luftblasen aus, wenn nötig mit einem weichen Gummibolzen. </li></ol> 5. Autoradiogramm und Szintillationszählungen <ol><li> Dri entfernenEd Gel und befestigen Sie eine autorad Marker, phosphoreszierende Lineal oder Punkte auf das Filterpapier auf der Seite des Gels. Wenn Sie Punkte verwenden, stellen Sie sicher, dass sie in einem asymmetrischen Muster sind. Dadurch wird das Gel nach Belichtung und Entwicklung mit dem Film ausgerichtet. </li><li> Verwenden Sie einen Geiger-Zähler, um die Intensität des Signals zu überprüfen. Für schwächere Signale belichtet die Belichtung bei -70 ° C bis -80 ° C mit einem Verstärkungsschirm die Filmbanddichte. </li><li> In einem dunklen Raum getrocknetes Gel in eine Filmkassette mit Film und einem Verstärkerschirm in der folgenden Reihenfolge von oben nach unten: Gel, Film, Verstärkerschirm. </li><li> Befestigen Sie den Verstärkerschirm am Deckel der Kassette und kleben Sie das Gel an Ort und Stelle, um diesen Schritt zu erleichtern. Der Verstärkungsschirm emittiert Licht, wenn es von den Beta-Partikeln aus dem 32 P bestrahlt wird. Diese Lichtemissionen durchdringen den Film effizienter als die Beta-Partikel. <ol><li> Vergewissern Sie sich, dass die vom Verstärkungsschirm emittierte Wellenlänge korrespondiertTeiche auf eine Wellenlänge, auf die der Film am meisten empfindlich ist. </li><li> Benutze einen Geiger-Zähler, um festzustellen, wie lange die Exposition belassen wird: Wenn die cpm-Zahl ~ 100 oder darunter ist, versuchen Sie es bei Nacht bei -70 ° C. Wenn die Zählung ~ 10.000 ist, beginnen Sie mit einer 1 h Belichtung und optimieren von dort aus. </li></ol></li><li> Am Ende der Belichtung entfernen Sie den Film und entwickeln sich in einem medizinischen / Röntgenfilmprozessor. Wenn die Belichtung bei -70 bis -80 ° C durchgeführt wurde, lassen Sie die Kassette auf Raumtemperatur erwärmen, um die Kondensation auf dem Film zu minimieren oder den Film unmittelbar vor der Kondenswasserbildung zu entfernen. 10 . </li><li> Legen Sie den Film über das getrocknete Gel / Filterpapier und richten Sie das Bild der Marker / Punkte mit den Markern / Punkten auf dem getrockneten Gel aus. Markieren Sie auf dem Film die Bänder entsprechend den Proteinstandards. Beschriften Sie die Protein-Standards und welche Spuren sind die Reaktionen für zukünftige Referenz. </li><li> Heben Sie die Bänder aus dem Gel, die Bands von Interesse auf dem Film entsprechen und legen Sie sieIn 7 ml Szintillationsfläschchen. Füge 4 ml Szintillationsflüssigkeit hinzu und zähle mit Flüssigkeitsszintillationszähler. Bestätigen Sie, dass der Zähler eingestellt ist, um das korrekte Energiespektrumfenster für 32 P zu überwachen . HINWEIS: Achten Sie darauf, auch das Band, das dem Substrat entspricht, von der Nicht-Kinase-Kontrollspur zu überschreiten. Dies wird verwendet, um Hintergrundstrahlung zu berechnen, die von allen Szintillationszählungen subtrahiert wird. </li></ol> 6. Analyse der Ergebnisse HINWEIS: Das Autoradiogramm liefert eine qualitative Visualisierung der Ergebnisse. Für eine genaue Quantifizierung kann der 32 P-Einbau mit einem Szintillationszähler gemessen werden. Die Daten werden üblicherweise in Bezug auf die relative Aktivität ausgedrückt, wie in 1B gezeigt . Solange für alle Proben einheitliche Bedingungen eingehalten werden, reichen relative Messungen der spezifischen Aktivität aus, um Behandlungen zu vergleichen. <ol><li> Bei der Berechnung absoluter spezifischer Aktivitätswerte eine Strenge ausführenOptimierung aller Reaktionsbedingungen, einschließlich Kinase-, Substrat- und Kalt-ATP-Konzentrationen, um einen linearen Wirkungsbereich über einen Zeitverlauf ( zB 2 x [Kinase] = 2 x spezifische Aktivität) zu gewährleisten. Für Kinasen mit hoher spezifischer Aktivität führen Assays mit erhöhter Substratkonzentration durch, falls die Kinaseaktivität durch die Menge des Substrats begrenzt ist. </li><li> Berechnen Sie die spezifische Aktivität der Kinase von Interesse in Einheiten von Nanomol Phosphat übertragen pro Minute pro mg Kinase. <ol><li> Subtrahieren Sie Leerzeichen aus der cpm in den gezählten Bändern. </li><li> Berechnen Sie den Zerfall der heißen ATP: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0,95 wobei t die Anzahl der Tage seit dem Stichtag ist (sollte vom Verkäufer bereitgestellt werden), t 1/2 ist der Halbwertszeit von 32 P, was 14,3 Tage beträgt, und 0,95 spiegelt die Effizienz des Szintillationszählers wider. Beispiel: Bei Verwendung von heißem ATP, das 28 Tage alt ist, sollte der Zerfallswert 0,245 sein. </li><li> BerechnetUlieren die Picomole (pmol) des Gesamt-ATP im Assay (üblicherweise ist dies gleich der Menge an kaltem ATP in der Reaktion): Assayvolumen (μL) x [kaltes ATP] (μM) = Gesamt-ATP (pmols). Beispiel: 30 &amp; mgr; l x 50 &amp; mgr; M = 1500 pmol </li><li> Berechnen Sie cpm / pmol ATP: [μL heißer ATP x (2,2 x 10 7 ) x Zerfallsfaktor] / pmol kaltes ATP. HINWEIS: Der Wert von 2,2 x 10 7 wandelt 0,01 mCi / μL ATP zu cpm. </li><li> Berechnen Sie die Menge an Kinase im Assay in mg. Sowohl für rekombinante Kinase als auch für immunpräzipitierte Kinasen sind Standardverfahren wie BCA-Assays geeignet, die Ausgangskonzentrationen zu bestimmen. Beispiel: wtERK2 0,0002 μg / μL in einer 50 μl Kinase-Reaktion beträgt 0,01 μg oder 1 x 10 -5 mg. </li><li> Berechnen Sie insgesamt cpm im Assay. Zusammensetzen von 30 &amp; mgr; l Reaktionen und Durchführen von 20 &amp; mgr; l von jeder Reaktion auf einem Gel. Multiplizieren Sie die cpm gezählt (nach leerer Subtraktion) um einen Faktor des gesamten Assayvolumens / Volumen geladen. Fortsetzung der oben genanntenBeispiel, multiplizieren Sie alle Zählungen um 1,5 oder 30/20. </li><li> Berechnen Sie die spezifische Aktivität der getesteten Kinase: Gesamt-cpm im Assay) / (cpm / pmol ATP) / (Testzeit in Minuten) / (Menge an Kinase in mg) HINWEIS: Die Aufteilung des obigen Wertes um 1.000 ergibt die spezifische Aktivität in Nanomolen / Minute / mg </li></ol></li><li> Berechnen Sie, wie viele Mol Phosphat in ein Substrat eingebaut werden (solange sein Molekulargewicht bekannt ist). Dies wird verwendet, um die Anzahl der Phosphosite auf einem bestimmten Protein zu bestimmen, sobald die Reaktion abgeschlossen ist. Gesamt-cpm im Assay) / (cpm / pmol ATP)] / (Menge an Substrat in pmols) </li></ol>

<ol>
	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kinasen sind eine vielfältige Familie von Proteinen, die in zahlreichen Kontexten umfangreiche Funktionalität entwickelt haben, und Kinase-Assays waren bei der Untersuchung mehrerer Signalproteine ​​unglaublich nützlich und haben zu unserem aktuellen Verständnis der zellulären Kommunikation stark beigetragen. Bemerkenswerterweise wurde der gleiche Grundtest bei der Charakterisierung von zwei verschiedenen Kinasen trotz großer Unterschiede in Struktur und Aktivität verwendet. Die WNK1-Kinase enthält eine atyp...

Proteinkinasen sind anspruchsvolle Enzyme, die für die Übertragung von zellulären Signalen in entsprechende Reaktionen kritisch sind 1 . Angesichts ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Prävention oder Förderung von Krankheitszuständen 2 sind biochemische Methoden zur Beurteilung der Kinaseaktivität weiterhin mächtige Werkzeuge zur Abgrenzung der Einzelheiten der eukaryotischen Signalisierung 3 . Obwohl Strategien, die Phosphorspezifische Antikörper verwenden, in hohem Maße informativ waren hinsichtlich der Messung der Effekte verschiedener Behandlungsbedingungen auf den Zellsignalisierungsstatus 4 , ermöglicht ein Kinase-Assay die Messung der Wirkungen verschiedener Behandlungsbedingungen direkt in Bezug auf die enzymatische Aktivität einer Kinase von interessieren. Zwar gibt es mehrere Möglichkeiten für ähnliche Assays, die keine radioaktiven Materialien verwenden 5 , wir setzen uns weiterhin auf diese Methode zur robusten Quantifizierung der Ergebnisse. DortSind zwei typische Anwendungen dieses Assays, die beide aus verschiedenen Gründen wertvoll sind: der immunpräzipitierte (IP) Kinase Assay (Abbildung 1 ) und der rekombinante Proteinkinase-Assay (Abbildung 2 ). Der IP-Kinase-Assay ist für die Identifizierung von Faktoren, die in der Lage sind, spezifische Proteinkinasen zu aktivieren, sowie die Bewertung von inhibitorischen Behandlungsbedingungen ungeeignet. Kurz gesagt wird eine Epitop-markierte Kinase von Interesse in kultivierte eukaryotische Zellen transfiziert, einer Vielzahl von Behandlungen unterworfen, immunpräzipitiert und auf die Fähigkeit untersucht, radioaktiv markiertes Phosphat in ein Modellsubstrat einzubauen ( z. B. Myelin-basisches Protein (MBP)). IP-Kinase-Assay kann auch ohne Rückgriff auf Überexpression durchgeführt werden, entweder durch Immunpräzipitation von endogenem Protein oder einer beliebigen Anzahl von Genom-Editing-Techniken. Da Behandlungen in Kultur verabreicht werden, kann dieses Verfahren Stimulationen erkennen, die durch mehrere vorgelagerte Faktoren übertragen werdenOder parallele Wege durch In-vitro- Auslesung. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode besteht darin, dass es keine Vorkenntnisse über direkte stromaufwärtige oder nachgeschaltete Faktoren oder Phosphorylierungsstellen erfordert. Darüber hinaus können, sobald spezifische Substrate für eine interessierende Kinase identifiziert worden sind, das gleiche Kinase-Assay-Protokoll mit rekombinanten Komponenten verwendet werden, um spezifische Aktivität gegenüber natürlichen Substraten zu messen und spezifische Phosphorylierungsstellen zu identifizieren, wenn sie mit der Massenspektrometrieanalyse kombiniert werden. Auf diese Weise identifizierte Standorte können mit Kinase-Assays unter Verwendung von Substratmutanten weiter validiert werden. Schließlich kann diese Methode auch zur Erkennung und Messung der Autophosphorylierung verwendet werden. Das hier bereitgestellte Protokoll nimmt entweder ein optimiertes Proteinreinigungsschema oder Transfektionsverfahren zur Expression einer Affinitätsmarkierungskinase von Interesse in kultivierten Zellen an. Für detailliertere Ausstellungen der Transfektion, Lyse, Immunopräzipitation und Proteinreinigung protOcols, schlagen wir vor, auf Cold Spring Harbor Protocols 6 zu verweisen. Weitere Informationen zur Assayentwicklung und -veränderung finden Sie unter Proteinphosphorylierung: Ausgewählte Methoden in Enzymologie 7 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0963-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled [&#947;-32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C010MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610737</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive shielding</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>BR-006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 dye (Coomassie)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20278</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-917</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slab gel vacuum dryer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 583 Gel Dryer #1651745&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autorad marker</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent ruler</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent dots</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td>Ludlum</td>
			<td>Model 3 with 44-9 detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax Cassette 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>107 2263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Film 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>829 4985</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Intensifying Screen 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>851 8706</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical/X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>SRX-101A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>125500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>188245305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS 6500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

Proteinkinasen sind in der Lage, großräumige zelluläre Veränderungen in Reaktion auf komplexe Anregungen von Reizen zu regeln, und viel Aufwand wurde auf die Aufdeckung allosterischer Details ihrer Regulierung gerichtet. Kinasen umfassen Signalisierungsnetze, deren Defekte oft Markenzeichen von mehreren Formen von Krebs und verwandten Erkrankungen sind, was eine Assay-Plattform zur Manipulation von vorgeschalteten regulatorischen Faktoren und zur Validierung von Reaktionsanforderungen, die bei der Suche nach verbesserten Therapeutika kritisch sind, ermöglicht. Hier beschreiben wir einen basischen Kinase-Assay, der sich leicht an spezifische experimentelle Fragen anpassen lässt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Prüfung der Wirkungen von biochemischen und pharmakologischen Wirkstoffen, genetische Manipulationen wie Mutation und Deletion sowie Zellkulturbedingungen und Behandlungen zur Sonde Zell-Signalisierungsmechanismen. Dieser Assay nutzt radiomarkiertes [γ- 32 P] ATP, das quantitative Vergleiche und eine klare Visualisierung der Ergebnisse ermöglicht und mod sein kannFür die Verwendung mit immunpräzipitierten oder rekombinanten Kinase, spezifischen oder typisierten Substraten, über einen weiten Bereich von Reaktionsbedingungen.

WNK1 IP-Kinase-Assays Myc-markiertes WNK1 wurde in HEK293-Zellen transfiziert und mit einem Anti-Myc-Antikörper 11 immunpräzipitiert. Das Immunpräzipitat zeigte die Kinaseaktivität gegenüber dem Modellsubstrat MBP sowie zu sich selbst (Abbildung 1A ). WNK1-Mutanten wurden dann für die Kinaseaktivität gegenüber MBP nach demselben Verfahren getestet, wobei diesmal GST-markierte Konst...

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

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18.2K Aufrufe.  University of Texas Southwestern Medical Center.  Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation. 

Serie: Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality for: (1) The identification of related protein structure sets to user specified thresholds of similarity; (2) Their multiple alignment and structure superposition; (3) Sequence and structure conservation analysis; (4) Inter-conformer relationship mapping with principal component analysis, and (5) comparison of predicted internal dynamics via ensemble normal mode analysis. This integrated functionality provides a complete online workflow for investigating sequence-structure-dynamic relationships within protein families and superfamilies.

A protocol for the online investigation of protein sequence-structure-dynamics relationships using Bio3D-web is presented.

Untersuchung der Proteinsequenz-Struktur-Dynamik Beziehungen zu Bio3D-Web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Forschung

Biochemie

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.

Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. Y-27632 is a highly potent inhibitor of Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase (RhoA/ROCK) and is used to prevent dissociation-induced cell apoptosis (anoikis). We demonstrate that Y-27632 pretreatment for human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs+RI) prior to implantation results in a cell engraftment rate improvement in a mouse model of acute myocardial infarction (MI). Here, we describe a complete procedure of hiPSC-CMs differentiation, purification, and cell pretreatment with Y-27632, as well as the resulting cell contraction, calcium transient measurements, and transplantation into mouse MI models. The proposed method provides a simple, safe, effective, and low-cost method which significantly increases the cell engraftment rate. This method cannot only be used in conjunction with other methods to further enhance the cell transplantation efficiency but also provides a favorable basis for the study of the mechanisms of other cardiac diseases.

In this protocol, we demonstrate and elaborate on how to use human induced pluripotent stem cells for cardiomyocyte differentiation and purification, and further, on how to improve its transplantation efficiency with Rho-associated protein kinase inhibitor pretreatment in a mouse myocardial infarction model.

Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek