המחברים נתמכים על ידי המועצה למחקר השוודי, הבסיס שוודית למחקר אסטרטגי, החברה השוודית סרטן, החברה השוודית סרטן ילדים, האייק Wibergs הקרן Jeanssons הקרן.

1. הצגת בדיקה לתאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Co-transfect תאים עם סריג בדיקה מבוססות לבין פלסמיד המקנה עמידות. בחר שיטת transfection כי הוא יעיל בסוג התא העניין שלך. עבור תאים U2OS, רמת סידן פוספט שיטות transfection לתת תוצאות נאות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תאים אנטיביוטיקה המתאימה לפחות שבעה ימים. זה מעשיר את כמות התאים המבטאים את בדיקה מגביל את כמות התאים עם רמות ביטוי רעיל, או רמות ביטוי חמור להשפיע על מחזור התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) בחר עבור שיבוטים יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתאי קבוע או לחיות, ודא כי הן CFP ו YFP נמצאים בכל התאים ביחס בקירוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה תאים מסוימים מכילים רק CFP או YFP, רקומבינציה אירעה סביר. רקומבינציה יכולה להתרחש גם במהלך התפתחות חיידקים או אחרי transfection של החללית והוא רשאי במקרה האחרון תלוי באיכות פלסמיד. חזור p פלסמידפיצוי ו linearize הפלסמיד לפני transfection אם הבעיה נמשכת. </li></ol> 2. Ratiometric ניטור סריג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים בתחתית צלחות זכוכית, או תלושי כיסוי הרכבה בתא. ודא כי מנות / תלושי לכסות אינם 1.5 (170 מיקרומטר עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תאים בינוני צמיחה ללא פנול אדום על מיקרוסקופ epifluorescence ממונע עם בקרת טמפרטורה מוגדר 37 ° C. ודא תקנה pH של התקשורת, או על ידי ה-CO 2 או באמצעות ה-CO 2 עצמאית מדיה כגון לייבוביץ-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על תאים באמצעות האור המועבר. אל תסתכל על תאים באמצעות אור ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי רכישת תמונה 12 או 16 ביט באמצעות עירור YFP (YFPex) ו YFP פליטה (YFPem) מסננים מראה dichroic מתאים. השתמש binning מקסימלי זמין עדיין מאפשר רזולוציה subcellular הנדרש. שימוש binning גבוהה כדי להקטין זמן חשיפה או אינטנסיביות חיונית כדי למנוע phototoxicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליasure או להעריך את עוצמת רקע הרעש המשוער על ידי מדידת או הערכת ממוצע גס, מינימום ערכי הפיקסלים המרבית באזור נטול תאים. שינוי זמן החשיפה ומסננים צפיפות ניטרלי, כך האות הממוצע בתא הוא כ עוצמת הרקע פלוס חמש עד עשר פעמים את ההבדל בין מקס בעוצמות דקות רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי התמונות לא קרובים להיות רווי. העוצמה המקסימלית של התמונה צריך להיות פחות ממחצית של טווח דינמי (למשל מקסימום 2000 בתמונת 12 ביט), כדי לאפשר ההבדלים בעוצמה כאשר תאים להיכנס מיטוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4-2.6 באמצעות עירור ופליטה CFP מסננים YFP ומראה dichroic מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באזורים מרובים עם תאים transfected, למעט באזורים המשמשים נקודת 2.4-2.7, ולוודא כי העוצמה המקסימלית היא פחות ממחצית הטווח הדינמי בכל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ניסוי זמן לשגות רכישת שתי תמונות כל 45 דקות באמצעות YFPex - YFPem ו CFPex - YFPem קובע הסינון. </li></ol> 3. אימות וייעול התנאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות רכשה ולנטר את מחזור התא בזמן מן מיטוזה כדי מיטוזה של תאים המבטאים את החללית transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת מחזור נמדד זמן תא לנתונים שפורסמו עבור סוג תא בשימוש. לחילופין, סרט untransfected תאים באמצעות רכישת תמונה אחת של אור מועבר רק (DIC למשל או שלב בניגוד) בכל שעה כדי לקבל תא התייחסות זמני המחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של זמן עד מיטוזה מיטוזה מתאים התייחסות תזמוני מחזור התא, המשך לשלב 4. לחלופין, לרכוש מחדש תמונות באמצעות חשיפה קשה יותר, יותר זמן או נקודות מרובות Z-רמות וחזור על שלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה בזמן מן מיטוזה כדי מיטוזה לא מתאימות התייחסות מחזור תזמוני התא, הסרט transfected תאים באמצעות רכישת תמונה אחת של אור מועבר רק (DIC למשל או שלב בניגוד) כל שעה ואחריו תמונה אחת בסוףהניסוי כדי לזהות תאים transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים transfected עדיין להראות פעמים מחזור התא יותר, חזור על שלב 1 אבל transfect בדיקה פחות או לבחור עבור שיבוטים יציב המכילים כמויות נמוכות מאוד של בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים transfected להראות נורמלי מחזור התא פעמים בהעדר אור ניאון, חזור על שלב 2 אבל חשיפה נמוכה יותר על ידי שינוי binning, מסננים צפיפות ניטרלי, זמן חשיפה, זמן בין תמונות. </li></ol> 4. ניתוח סריג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניתוח יכול להתבצע על ידי רוב התוכנות המוקדש במיקרוסקופ. כאן אנו מתארים כיצד לבצע את הניתוח באמצעות ImageJ freeware ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> ) ניצול יחס תוסף פלוס ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות ImageJ. בכל מקרה התמונות שלך הן בפורמט של stac ססגוניותk (למשל DeltaVision), להפריד את הערוצים הנפרדים על ידי הראשון הפיכתם hyperstack: Image-hyperstack מחסנית ל hyperstack ולאחר מכן לפצל אותם ערימות ערוץ אחד באמצעות: Image-hyperstack-להפחית ממדיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפלת YFPex - מחסנית YFPem עם 3 באמצעות: Process-Math-הכפל שלב זה הוא אופציונלי, שכן הוא נועד אך ורק כדי להגביר את בהירות הראייה של התמונות על ידי הקפדה יחסי אינם בטווח בין 0 ל -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב YFPex - מחסנית YFPem, צייר באזור של עניין (ROI) באזור כי הוא נטול תאים, אבל זה קרוב לתא כדי להימדד. תאים שונים באותה תמונה עשויה לדרוש באזורים שונים, כמו גם הרקע ועוצמת אות הוא בדרך כלל החזק במרכז התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההחזר על ההשקעה ROI אל מנהל: Analyze-tools-ROI מנהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את העוצמה הממוצעת של ההחזר על ההשקעה הן YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem: Analyze-מדוד </em&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על timepoints מרובים לוודא כי בעוצמות רקע קרוב לתא עניין דומים לאורך כל הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט מדידות לכלול בעוצמה מינימלית: Analyze-Set-Min מידות וערך מקס אפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של אינטרס המכסים את רוב התא ולמדוד את עוצמת מינימלי הן YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem. קח את ההבדל בין עוצמת מינימלי נמדד עוצמת הרקע 4.6 ומחלקים אותו על ידי שני. זה מספק הערכה מוצא ערך גזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחס פתוח פלוס. בחר את YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem. עבור סריג יחס, בחר CFPex - YFPem כמו מחסנית 1, עבור סריג יחס הפוך בדיקות הדמיה שבו סריג פוחתת יעילות על זירחון, בחר YFPex - YFPem כמו ערימה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את עוצמות רקע נמדד בערכים גזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה של מחסנית יחס וכתוצאה מכך ולהחיל u נראים מתאימיםp טבלה (LUT) כדי לחזות שינויים יחס. </li></ol> 5. נציג תוצאות Plk1 הפעילות הגלויה הראשונה בגרעין בשלב ופסגות G2 במהלך מיטוזה. איור 3 מציג ניסוי באמצעות הגדרות phototoxicity מינימלי כמתואר בסעיף 2. שים לב כי זוהי תוצאה ראשונית נציג וכי התנאים חשיפה או הזמן בין דמויות יכולות להיות משונות כדי להגדיל את יחס אות לרעש או רזולוציה טמפורלית. איור 3D מראה כי רוב התאים המבטאים את החללית להתרבות עם זמן מחזור של תא בין 20 ל 25 שעות, המציין את התנאים הדמיה רמות הביטוי של החללית אינם משפיעים על תזמון מחזור התא. למרות שיש רעש רב, את המגמה של הגדלת הפעילות Plk1 G2 ו peaking ב מיטוזה 14 נראה בבירור (איור 3A). עיבוד הנתונים הגולמיים, כאן על ידי מתכוון סינון כפי שהוצגו רשם גלים (איור 3B), או כימות של ra הפוך הממוצע<html> טיו (תאנה 3C) יכול לשפר את הבהירות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" /> באיור 1. עקרון בדיקה סריג מבוסס לפקח פעילות קינאז ו phosphatase. שני fluorophores, בדרך כלל CFP (כחול) YFP (ירוק), מחוברים על ידי תחום phospho מחייבים (כתום) רצף phosphorylatable (צהוב). (אדום) זירחון מתווכת מחייב תחום phospho מחייב, ובכך גרימת שינוי קונפורמציה החללית. השינוי בתוצאות קונפורמציה הבדל במרחק או נטייה בין שני fluorophores, אשר משפיע על היעילות בין סריג CFP ו YFP. סריג ניתן דמיינו ידי CFP מרגש וניטור YFP פליטה (קווים מקווקווים). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" /> באיור 2. המתאר סכמטי של הליך ניסיוני. p_upload/3410/3410fig3.jpg &quot;/&gt; באיור 3. Plk1 הפעילות הגלויה הראשונה בגרעין בשלב ופסגות G2 במהלך מיטוזה. תאים U2OS להביע סריג מבוססי ניטור בדיקה Plk1 פעילות 9,14 צולמו במשך 60 שעות באמצעות מערכת דימות Spectris DeltaVision מצויד מטרה 20x 0.7 אוויר NA ומנורת כספית. תנאי ההדמיה נבחרו כדי לגרום phototoxicity מינימלי, כפי שמתואר בסעיף 2, באמצעות binning 4x ומסננים צפיפות ניטרלי כי 99% בלוק של האור הנכנס. צבע, מצג שווא של יחס הפוך סריג, בעקבות תא אחד באמצעות 4 חטיבות. ב &#39;, רשם גלים של התא מוצג לאחר החלת מסנן מתכוון. C, כימות של יחס הפוך סריג של התא מוצג א &#39;ד&#39;, כניסה mitotic מצטברת של 50 סריג, בדיקה תאים להביע, כולל חטיבות של לתאי הבת.

<ol>
	<li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+microscopy+in+2010:+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth.">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li><li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B/Akt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter.">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li><li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase.">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li><li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter.">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li><li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity.">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li><li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis.">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li><li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient.">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li><li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters.">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 .</li><li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The cell cycle : principles of control. , (2007).</li><li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decision+to+enter+mitosis:+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network.">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li><li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery.">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li><li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA.">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

ניטור סריג לאורך מחזור התא דורש השיקולים הם קריטיים פחות כאשר מעריכים לטווח קצר תגובות לגירויים חיצוניים. ראשית, התקדמות מחזור התא בקלות מוטרד איתות מתח, המחייב phototoxicity היא למינימום. שנית, כל הכתבים עלולה להשפיע על תהליכים תאיים על ידי titrating החוצה קינאזות, phosphatases או ת?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> מספר קטלוגי </td><td> חברה </td></tr><tr><td> ליבוביץ L-15, לא פנול אדום </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0.05% טריפסין EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret

פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) מבוסס לכתבים 1 לאפשר הערכה של קינאז אנדוגני ופעילויות phosphatase בתאים חיים. בדיקות אלו בדרך כלל מורכבות של וריאנטים של CFP ו YFP, התערב על ידי רצף phosphorylatable ואת תחום phospho מחייב. לאחר זירחון, השינויים בדיקה הקונפורמציה, שתוצאתה שינוי המרחק או נטייה בין CFP ו YFP, מוביל לשינוי סריג יעילות (איור 1). מספר בדיקות פורסמו בעשור האחרון, מעקב אחר יתרת הפעילות של קינאזות ו phosphatases מרובות, כולל כתבים של 2 PKA, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, אורורה B 9 ו 9 Plk1 . בהתחשב עיצוב מודולרי, בדיקות נוספות צפויות לצאת ב 10 בעתיד הקרוב. התקדמות דרך מחזור התא מושפע מתח signaling 11 מסלולים. יש לציין, מחזור התא מוסדר באופן שונה במהלך שאנן צמיחה לעומת כאשר התאים הם מחלים מתח 12. זמן לשגות הדמיה של התאים דרך מחזור התא ולכן מחייב זהירות מיוחדת. זה הופך לבעיה במיוחד כאשר העסקת הדמיה ratiometric, שכן שתי תמונות עם האות גבוה יחס רעש נדרשים לפרש את התוצאות. Ratiometric סריג הדמיה של מחזור התא משתנה תלוי בפעילות קינאז ו phosphatase יש ברובה הוגבלה סעיפים קטנים של מחזור התא 8,9,13,14. כאן, אנו דנים בשיטה כדי לפקח על סריג מבוססי בדיקות הדמיה באמצעות ratiometric לאורך מחזור התא האנושי. השיטה מסתמכת על הציוד העומד לרשות חוקרים רבים במדעי החיים ואינו דורש ידע מומחה של מיקרוסקופיה או עיבוד תמונה.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET at JoVE.com

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

monitoring-kinase-phosphatase-activities-through-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  Karolinska Institutet. סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

Video: Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

ציור דם מן החולדות דרך וריד Saphenous ועל ידי נקר לב

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

סנכרון של<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; לחקירה של מחזור תא החיידק

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...