Wir danken Darren Obbard für Drosophila Bild in Abbildung 3 und video Manuskript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson und Heather M. Lamb für wertvolle Diskussion dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright gewähren 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation Fellowship (H.L.T.) und NCI K22 gewähren CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang war ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

(1) Vorbereitung der CaspaseTracker Biosensor fliegen
<ol><li>Betäuben Sie fliegen mit CO2zu, und verwenden Sie einen Pinsel, 7-10 Caspase-Sensitive Gal4 (DQVD)19 jungfräulichen Weibchen und 7 bis 10 G-Spur53 Gal4 Reporter junge männliche fliegen (oder umgekehrt) in der gleichen Flasche mit fliegen Essen und frische Hefe Paste übertragen. Hinweis: Kreuz von Caspase-Sensitive (DQVD) Gal4 und G-Spur fliegen erzeugt CaspaseTracker Nachkommen fliegen. Kreuz des Caspase -insensiblen (DQVA)19 Gal4 und G-Spur fliegen, erhalten Negativkontrolle fliegt (siehe Diskussion). Frische Hefe Paste dient als Proteinquelle, Ei-Produktion, zu verbessern, so dass die Anzahl der Nachkommen erhöht. Wählen Sie jungfräuliche Weibchen und junge Männchen fliegt nach ihren Phänotypen54.</li>
	<li>3 bis 7 Tagen inkubieren Sie fliegen bei 18 Grad Celsius (oC) während des Kreuzes und übertragen Sie dann die fliegen zu einem neuen Fläschchen zum Einrichten eines neuen Kreuzes bei 18 ° C. Weiterhin der Originalflasche bei 18 ° C inkubieren, bis Nachkommen Eclose fliegt. Hinweis: Übertragen Sie die Eltern fliegen auf neue Fläschchen zu vermeiden Überbelegung der Nachkommen in der Originalflasche. Elternteil fliegen Nachkommen mit frischen Lebensmitteln und Hefe Paste in den ersten 2 bis 3 Schaltern erzeugen können, und dann verringern die Produktivität deutlich mit der Zeit. Erhöhung der fliegen 18 ° C können unspezifische Signal des CaspaseTracker Biosensor reduzieren (siehe Diskussion).</li>
	<li>Wählen Sie Nachkommen fliegt mit richtigen Phänotypen54 für folgende Experimente. Hinweis: Transgene Caspase-Sensitive Gal4 und G-Spur hier befinden sich auf dem zweiten Chromosom mit CyO Balancer ausgeglichen. Wählen Sie die nicht lockig Flügel Nachkommen (ohne CyO), die beide transgene Caspase-Sensitive Gal4 und G-Spur hat.</li>
</ol>(2) die Anwendung der Transienten Zelle Tod Induktion, CaspaseTracker-Biosensor fliegen
<ol><li>Übertragen Sie 10 bis 20 neu geschlüpften Weibchen ein neues Fläschchen mit Fliege Frischwaren und frische Hefe Paste für 1 Tag auf 18 ° C fliegt um Ei-Kammer-Produktion durch Oogenese zu ermöglichen. Hinweis: Halten das Weibchen mit männlichen fliegen könnte Ei Kammer-Produktion erhöhen.</li>
	<li>Das Weibchen fliegt um Ei Kammern durch Kälteschock, Transfer Apoptose induzieren neue leere Fläschchen, die dann bei-7 ° C für 1 h platziert wird. Hinweis: Kälteschock verletzt Zellen durch Induktion Plasmamembran Bruch55,56.</li>
	<li>Um Ei Kammern durch Protein verhungern Apoptose induzieren, übertragen Sie die weiblichen fliegen zu einem neuen Fläschchen mit 8 % Saccharose und 1 % Agar Essen bei 18 ° C für 3 Tage. Hinweis: Protein-Hunger (nicht-Protein Lebensmittel) auslösen kann Ei Kammern um Apoptose57,58,59 und Autophagie60,61unterziehen. Schalter fliegt zu einem neuen Fläschchen mit 8 % Saccharose und 1 % Agar Essen jeden Tag um zu optimalen Zustand Saccharose fliegen Essen zu halten.</li>
	<li>Übertragen Sie die gestressten fliegen zurück zu einem neuen Fläschchen mit frischen fliegen Essen und frische Hefe Paste für 3 Tage bei 18 ° C, damit sie sich erholen. Sezieren Sie die hungrigen und die verhungert erholt fliegen Ei Kammern an Eierstöcken beschrieben62zu erhalten. Hinweis: Um Drosophila Eierstöcke zu sezieren, verwenden Sie 2 Paar Pinzette, um fliegen Kopf entfernen betäuben Sie fliegen mit CO2, zu und verwenden Sie die Zange, um die Basis des Bauches zu entfernen die Eierstöcke der fliegen zu ziehen.</li>
</ol>(3) Fixierung und Färbung der seziert Ei Kammern für die Bildgebung
<ol><li>Übertragen Sie die seziert Ei Kammern zusammen mit rund 0,5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 1 mL Zentrifuge Röhren. Lassen Sie die Eiern zu beruhigen. Hinweis: Beschichten von Kunststoff Pipettenspitzen mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) aufgelöst in Wasser oder PBS Ei Kammern zum Aufkleben auf die Kunststoffoberfläche der Tipps zu verhindern. Führen Sie die folgenden Verfahren in Dunkelheit, Immunofluoreszenz rot fluoreszierenden Proteins (RFP, auch bekannt als DsRed) zu vermeiden und grün fluoreszierendes Protein (GFP) in die Ei-Kammern.</li>
	<li>Entfernen Sie die PBS durch pipettieren, und wenden Sie dann 0,5 mL 4 % Paraformaldehyd in PBS, Ei Kammern bei Raumtemperatur in Dunkelheit für 20 bis 30 min. zu beheben. Hinweis: Sanfte Drehung in dieser und die folgenden Inkubationsschritte anwenden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Paraformaldehyd durch pipettieren und dann gewaschen, die Ei-Kammer mit 0,5 mL PBST (PBS + 0,1 % Triton x-100) für 3 Mal. Hinweis: Verlängerte Fixierung könnte die RFP und GFP-Signale reduzieren.</li>
	<li>Die Ei-Kammern mit PBST für 1 bis 2 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C mit sanften Drehung um das Ei Kammern permeabilize. Hinweis: PBST kann vermeiden, Ei Kammern, an die nicht-BSA beschichteten Kunststoff-Oberfläche.</li>
	<li>Entfernen Sie der PBST durch pipettieren und Ei Kammern für 1 bis 2 h bei Raumtemperatur für Kern Fleck dann zuweisen Sie 0,5 mL 10 μg/ml blauer nuklearen Hoechst Farbstoff in PBST. Hinweis1: Vermeiden Sie längeren Inkubation mit nuklearen Farbstoff, wie das unspezifische Signal zu erhöhen. Hinweis 2: Alternativer Ansatz zum Kern ohne Hoechst Fleck ist das Hinzufügen von 200 μl Anti-bleichen Montage Agent mit DAPI (siehe Material) und inkubieren Sie über Nacht63, vor der Montage das Gewebe auf Glas Deckglas, wie im Protokoll 3.8 beschrieben. NOTE3: führen Sie die Färbung und die folgenden Verfahren in Dunkelheit, Immunofluoreszenz zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen des nuklearen Farbstoffs durch pipettieren und dann gelten 0,5 mL PBST die Ei Kammern in die Zentrifuge Röhren 1 mL für 3 Mal mit 10 bis 20 min Inkubation mit sanften Drehung zwischen jedem Waschschritt zu waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie alle PBST mit feinen Pipette, und wenden Sie dann 200 μL Anti-bleichen Montage Agent (siehe Material) Ei Kammern bei Raumtemperatur 3 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren, bis Ei Kammern auf der Unterseite des Rohres sinken. Hinweis: auf den Boden des Rohres sinken Gewebe, die vollständig den Montage-Agent aufgenommen haben.</li>
	<li>Montieren Sie die gefärbten Ei Kammern durch Übertragung mit 200 μl Anti-bleaching Montage-Agent auf einem vorgereinigten Objektträger für die Bildgebung durch pipettieren, Ei Kammern mit einem 20 x 20 mm vorgereinigten Glas Deckglas abdecken und verschließen das Deckglas auf Glasobjektträger indem man Nagellack am Rand des Deckglases. Hinweis1: Pre-reinigen Sie den Objektträger und Deckglas mit Wasser oder 70 % Ethanol. Hinweis 2: Gelten Sie Vaseline zwischen den Objektträger und Deckglas zu zerstören die Ei-Kammern durch Unterverdichtungen.</li>
	<li>Bild der Ei-Kammern mit Fluoreszenz oder confocal Mikroskop, mit einem 20 X, NA 0,8 Plan-Apochromat Objektive, mit Anregung Licht-Wellenlänge 405 nm für nukleare Färbung (Erkennung Emission ~ 461 nm), 561 nm für RFP (laufende oder kürzlich Caspase-Aktivität) Signal ( erkennen Emission ~ 590 nm), und 488 nm für GFP (vorbei an Caspase-Aktivität) Signal (Emission erkennen ~ 518nm). Hinweis: Sehen Sie unsere veröffentlichten Protokolle für Mikroskopie-20,-64.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das CaspaseTracker dual Biosensor-System ist ein neuartiges und einzigartiges Werkzeug, das ermöglicht die Erkennung von den vergangenen oder laufenden Caspase-Aktivität und Verfolgung von Zellen, die Zelle Tod rückgängig gemacht haben verarbeiten und Überleben nach Caspase-Aktivität in Vivozu erleben. Während traditionell Caspase-Aktivität als ein Markenzeichen der Apoptose angenommen hat, zeigen wachsende Untersuchungen, dass-apoptotische Caspase-Aktivität mögliche Ro...

Programmierten Zelltod, z. B. Apoptose, spielt eine wesentliche Rolle in der embryonalen Entwicklung und normale Homöostase durch den Wegfall von unerwünschter, verletzter oder gefährliche Zellen in mehrzelligen Organismen1,2,3. Der Verlust des Gleichgewichts zwischen Zelle Tod und überleben kann zu fatalen Folgen wie Krebs, Herzversagen, Autoimmunität und Degeneration4,5,6,7,8führen. Aktivierung des Henkers, die Caspasen traditionell als der "Point Of No Return" Apoptose9,10,11, als es betrachtet löst schnelle und massive zellulären Abriss12, 13,14,15,16. Anspruchsvolle dieses allgemeinen Dogma, haben wir bewiesen, kultivierten sterbenden primäre Zellen und Krebszellen nicht nur nach Aktivierung der Caspase, sondern auch folgende wichtige Zelle Tod Kennzeichen einschließlich der Plasmamembran Blebbing, Schrumpfung der Zelle wiederherstellen zu können, mitochondriale Fragmentierung, Freisetzung von mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, nukleare und Chromatin Kondensation, DNA-Schäden, nukleare Fragmentierung, Zelle Oberfläche Exposition von Phosphatidylserin (PS) und Bildung von apoptotischen Körper 17 , 18 , 19 , 20 , 21. schlagen wir die Anastasis ist eine innere Zelle Erholung Phänomen, wie sterbende Zellen nach Entfernung der Zelle Tod Reize17,18,19,20, erholen können 21. wir prägte den Begriff "Anastasis" (Αναστάσης)18, was bedeutet "steigt zum Leben" in griechischer Sprache, zu dieser unerwarteten Zelle Erholung Phänomen zu beschreiben. Unsere Beobachtung der Anastasis wird weiter unterstützt durch unabhängige Studien, die zeigen auch Erholung der Zellen nach Phosphatidylserin Externalisierung22,23,24, mitochondriale begrenzte äußeren Membran Permeabilisierung25, Aktivierung der gemischte Abstammung Kinase-wie (MLKL) und Zelle Schrumpfung26.
Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Anastasis wird Paradigma-Verschiebung physiologische, pathologische und therapeutische Konsequenzen haben. Anastasis könnte einen bisher unbekannten zellschützenden Mechanismus zu retten oder bewahren wichtige postmitotischen Zellen und Gewebe, die schwer zu ersetzen sind, und möglicherweise Konto für Herzinsuffizienz Umkehrung von ventrikulären entladen mit Links ventrikulären darstellen unterstützen Sie Geräte (LVAD)27,28, Wiederherstellung der Sehzellen nach vorübergehender Exposition von übermäßigen hellen29,30,31, oder Reparatur von Neuronen nach Gehirn Verletzungen32. Wenn ja, Förderung der Anastasis Zell- und Erholung verbessern könnte. Umgekehrt könnte Anastasis eine unerwartete Flucht Taktik zu Zelle Tod-induzierenden Therapie verursacht Krebs Wiederauftreten17,18Überleben von Krebszellen verwendet werden. Deshalb unterdrücken Anastasis im sterben Krebszellen während und nach Behandlung von Krebs könnte eine neuartige therapeutische Strategie, Krebs zu heilen, durch ihren Rückfall zu verhindern.
Während des Prozesses der Anastasis haben wir festgestellt, dass einige wiederhergestellten Zellen erworben dauerhafte genetische Veränderungen und unterzog sich onkogenen Transformation, wahrscheinlich aufgrund von DNA-Schäden entstehen während der Apoptose18,20,21 . Umkehrung des Prozesses der Tod von DNA-beschädigte Zellen könnte ein Mechanismus der Tumorgenese, potenziell zugrunde liegt die Beobachtung, die Gewebeverletzung wiederholt erhöht das Risiko von Krebs in einer Vielzahl von Geweben, wie z. B. chronische thermische Schädigung in der Speiseröhre induziert durch den Verzehr von sehr heißen Getränken33,34,35, Leberschäden durch Alkoholismus36,37, Tumor-Evolution nach genotoxische Krebs Therapie38, 39,40und die Entwicklung von Neuerkrankungen von normalen Zellen, die in den Pausen zwischen den Zyklen der Anti-Krebs-Therapie41,42,43,44 entstehen . Wenn "true", könnte targeting Anastasis verhaften Krebsentstehung und Progression oder verhindern. Wir haben festgestellt, dass Hunger-induzierte sterbenden Keimzellen Anastasis erneut zugeführt werden, Drosophila19unterziehen.  Wenn Anastasis in Keimzellen mit DNA-Schädigung auftritt, könnte es sein, entfallen die Beobachtung, die Umweltbelastungen verlängert Entwicklung genetischer Erkrankungen fördert. Z. B. zur Hungersnöte Entwicklung der transgenerationalen vererbbare Krankheiten wie Diabetes und koronare Herzkrankheiten45. Daher könnten Verständnis Anastasis Strategien zur Prävention von vererbbaren Krankheiten, die durch diesen möglichen Mechanismus zu entwickeln.
Um die Entdeckung der Anastasis zu nutzen und zu lenken, innovative Therapien zu entwickeln, ist es wichtig, die Ursache und Folge der Anastasis mit lebenden Tieren zu studieren. Jedoch ist es technisch schwierig zu identifizieren und verfolgen Anastatic Zellen in Vivo, da die Zellen, die Zelle Todesprozess erholt morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen erscheinen, und es keine Biomarker der Anastasis gibt identifiziert noch17,18,21. Um diese Probleme anzugehen, haben wir vor kurzem entwickelt eine neue in-Vivo Caspase Biosensor bezeichnet "CaspaseTracker"19, zu identifizieren und verfolgen von Zellen, die Apoptose nach Caspase Aktivierung19,46, überleben die Markenzeichen der Apoptose10,14. Unterscheidet sie von der "Echtzeit" Caspase-Biosensoren wie SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 und iCasper52 erkennen, dass andauernde Caspase-Aktivität, der CaspaseTracker-Biosensor zusätzlich bietet die Möglichkeit, dauerhaft Zellen diese ausdrückliche Caspase-Aktivität sogar vorübergehend beschriften. Der CaspaseTracker-Biosensor ermöglicht somit, langfristige Verfolgung von Anastasis nach Umkehr der Caspase-vermittelte Zelle Tod Prozess in Vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (griechisch für "Rising zum Leben") ist ein vor kurzem entdeckten Zelle Erholung Phänomen, wobei Zellen sterben Tod Spätstadium Zellprozesse rückgängig machen kann, die in der Regel angenommen werden, per se nicht rückgängig gemacht werden. Förderung der Anastasis Körperverletzungen im Prinzip Rettungs- oder Konserve Zellen, die schwer zu ersetzen, wie Kardiomyozyten oder Nervenzellen, wodurch Gewebe Erholung sind. Umgekehrt kann unterdrücken Anastasis in Krebszellen die Apoptose nach Anti-Krebs-Therapien unterziehen Krebs Zelltod zu gewährleisten und reduzieren die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Auftretens. Allerdings haben diese Studien behindert wurde, durch den Mangel an Tools für die Verfolgung des Schicksals der Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen. Die Herausforderung ist es, die Zellen zu identifizieren, die die Zelle Tod trotz ihrer morphologisch normale Erscheinung nach der Wiederherstellung rückgängig gemacht haben. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, haben wir entwickelt, Drosophila und Säugetieren CaspaseTracker-Biosensor-Systeme, die erkennen und dauerhaft zu verfolgen, die Anastatic Zellen in Vitro oder in Vivo. Hier präsentieren wir Ihnen in-Vivo -Protokolle für die Erzeugung und Nutzung von das CaspaseTracker dual Biosensor-System zu erkennen und verfolgen Anastasis in Drosophila Melanogaster nach vorübergehenden Aussetzung zu Zelle Tod Reize. Während konventionelle Biosensoren und Protokolle Zellen aktiv durchmachenden apoptotischen Zelltod beschriften können, der CaspaseTracker-Biosensor kann dauerhaft beschriften, Zellen, die nach der Aktivierung der Caspase - ein Markenzeichen der Spätphase Apoptose, erholt haben und gleichzeitig aktive apoptotische Prozesse zu identifizieren. Dieser Biosensor kann auch die Erholung der Zellen aufspüren, die andere Formen des Zelltods versucht, die direkt oder indirekt Caspase-Aktivität beteiligt. Daher ist dieses Protokoll ermöglicht es uns, kontinuierlich verfolgen das Schicksal dieser Zellen und deren Nachkommen, die Erleichterung der Zukunftsforschung der biologischen Funktionen, molekulare Mechanismen, physiologischen und pathologischen folgen und therapeutische Implikationen der Anastasis. Wir diskutieren auch die entsprechenden Steuerelemente, um Zellen zu unterscheiden, die Anastasis von denen zu unterziehen, die nicht-apoptotische Caspase-Aktivität in Vivoanzeigen.

Time-Lapse live Zelle Mikroskopie eine zuverlässige Methode, um Trakt Anastasis in kultivierten Zellen20ist, ist es schwierig zu identifizieren welche Zellen Anastasis bei Tieren, unterzogen wurden, da die wiederhergestellten Zellen morphologisch nicht zu unterscheiden scheinen aus normalen gesunden Zellen, die nicht Zelltod versucht haben. Z. B. anzeigen menschliche Gebärmutterhalskrebs HeLa-Zellen morphologische Kennzeichen der Apoptose1,2</...

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Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

9.2K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Serie: Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Forschung

Medizin

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal vasculature of various eye diseases such as age-related macular degeneration (AMD). ICGA is especially useful to image the posterior choroidal vasculature of the eye due to its capability of penetrating through the pigmented layer with its infrared spectrum. ICGA time course can be divided into early, middle, and late phases. The three phases provide valuable information on the pathology of eye problems. Although time-course ICGA by intravenous (IV) injection is widely used in the clinic for the diagnosis and management of choroid problems, ICGA by intraperitoneal injection (IP) is commonly used in animal research. Here we demonstrated the technique to obtain high-resolution ICGA time-course images in mice by tail-vein injection and confocal scanning laser ophthalmoscopy. We used this technique to image the choroidal lesions in a mouse model of age-related macular degeneration. Although it is much easier to introduce ICG to the mouse vasculature by IP, our data indicate that it is difficult to obtain reproducible ICGA time course images by IP-ICGA. In contrast, ICGA via tail vein injection provides high quality ICGA time-course images comparable to human studies. In addition, we showed that ICGA performed on albino mice gives clearer pictures of choroidal vessels than that performed on pigmented mice. We suggest that time-course IV-ICGA should become a standard practice in AMD research based on animal models.

Indocyanine Green Angiography (or ICGA) performed by tail vein injection provides high quality ICGA time course images to characterize abnormalities in mouse choroid.

Erkennen von Fehlbildungen in Aderhautgefäßsystem in einem Maus-Modell der Altersbedingte Makuladegeneration durch Zeitverlauf Indocyaningrün-Angiographie

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

Auslösen Reactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Vorderhirn Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

Regenerative Therapie durch Suprachoroidal Zelle Autotransplantation in trockene altersbedingte Makuladegeneration: vorläufige In Vivo Bericht

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The complete solubilization of the compound is necessary for its safe use and relatively stable results. Here, a protocol for preparing naringenin solution and its intraperitoneal administration in a high-fat diet and streptozotocin (STZ)-induced diabetic model is demonstrated as an example. A small amount of naringenin (3.52-6.69 mg) was used to test its solubilization in solvents, including ethanol, dimethylsulfoxide (DMSO), and DMSO plus Tween 80 reconstituted in physiological saline (PS), respectively. Complete solubilization of the compound is determined by observing the color of the solution, the presence of precipitates after centrifugation (2000 x g for 30 s), or allowing the solution to stand for 2 h at room temperature (RT). After obtaining a stable compound/phytochemical solution, the final concentration/amount of the compound required for in vivo studies can be prepared in a solvent-only (no PS) stock solution, and then diluted/mixed with PS as desired. The antidiabetic osteoporotic effects of naringenin in mice (intraperitoneal administration at 20 mg/kg b.w., 2 mg/mL) were assessed by measuring blood glucose, bone mass (micro-CT), and bone resorption rate (TRAP staining and ELISA). Researchers looking for detailed organic/phytochemical solution preparations will benefit from this technique.

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

Here, the protocol presents the preparation of naringenin solution for in vivo intraperitoneal administration. Naringenin is fully dissolved in a mixture of dimethylsulfoxide, Tween 80, and saline. The antidiabetic osteoporotic effects of naringenin were assessed by blood glucose testing, tartrate-resistant acid phosphatase staining, and enzyme-linked immunosorbent assay.

Herstellung von Naringenin-Lösung für die In-vivo-Anwendung

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The ...