Dieses Protokoll eignet sich besonders für das genetische Screening von visuell defekten Drosophila-Mutanten. Dies liegt daran, dass sie den Nachweis selbst kleiner Anomalien in der Drosophila-Phototransduktion ermöglichen, insbesondere in Photopigmentspiegeln und Tier-Peer-bezogenen Funktionen. Diese Technik ist tiefgründig in vivo, einfach auszuführen und sehr robust, was den Nachweis kleiner Veränderungen in der Aktivität von Phototransduktionsproteinen ermöglicht.
Meiner Meinung nach ist die Fixierung der Fliegen unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit wahrscheinlich der kritische Teil dieser Methode. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Clampex-Software. Schalten Sie den Verstärker und den Master-8-Impulsgenerator und dann die Xenonlampe und den Verschlussregler ein.
Schalten Sie den Abzieher ein und legen Sie eine Glaskapillare in den Abzieher und ziehen Sie daran. Entfernen Sie die Glaskapillare vom Abzieher. Füllen Sie die Glaskapillare mit gefilterter Klingellösung mit einer länglichen Spitzenspritze.
Führen Sie die Drahtelektrode in die Glaskapillare ein. Stellen Sie sicher, dass die Lösung in der Kapillare mit dem Silberdraht in Kontakt steht. Stecken Sie die Elektrodenhalter in die beiden Elektroden-Mikromanipulatoren.
Schalten Sie die Stromversorgung des Lötkolbens ein. Stellen Sie den Strom auf ca. 2,25 Ampere ein. Dieser Strom soll das 0,25 Millimeter große Platin-Iridium-Filament auf etwa 55 bis 56 Grad Celsius erwärmen.
Legen Sie einen Tropfen Wachs mit niedriger Schmelztemperatur auf den Lötkolben. Betäuben Sie die Fliegen in der Flasche. Gießen Sie die betäubten Fliegen in den Schlafbehälter, wählen Sie eine Fliege und bedecken Sie den Rest der Fliegen mit einer Petrischale.
Halten Sie die Fliege vorsichtig mit einer scharfen Pinzette an den Flügeln und legen Sie sie auf den Fliegenhalter. Auf den Fliegenhalter legen Sie die Fliege auf die Seite liegend mit dem Rücken zur Hand. Heben Sie die Fliege mit einer Pinzette von ihren Flügeln und befestigen Sie ihre Flügel mit dem Lötkolben am Fliegenhalter.
Verbinden Sie den Rücken der Fliege mit Wachs mit dem Lötkolben mit Wachs. Senken Sie die Spitze des Lötkolbens auf den Verbindungspunkt der Beine und schmelzen Sie dann das Wachs, um alle Beine zusammen zu bedecken. Legen Sie einen kleinen Tropfen Wachs zwischen Kopf und Hals in den Nackenbereich.
Stellen Sie den Fliegenhalter in einen dunklen Faradayschen Käfig auf einen Magnetblock und stellen Sie sicher, dass die Fliege etwa fünf Millimeter vom Ende des Lichtleiters entfernt ist. Platzieren Sie die Aufnahmeelektrode über dem Fliegenauge und die Bodenelektrode über dem oberen Rücken der Fliege mit den Mikromanipulatoren. Führen Sie dann die Bodenelektrode mit den Mikromanipulatoren in den Rücken der Fliege ein.
Führen Sie die Aufnahmeelektrode in die äußere Peripherie des Fliegenauges ein, vorzugsweise mit den Mikromanipulatoren. Schließen Sie den Faradayschen Käfig und schalten Sie das Licht im Raum aus, um die Anpassung an die Dunkelheit für fünf Minuten zu ermöglichen. Geben Sie die Parameter ab einer Pulsdauer von 500 Metern pro Sekunde, einem Impulsintervall von 60 Sekunden und der Anzahl der Impulse auf sechs ein.
Um den PDA zu messen, stellen Sie den Master-8-Impulsgenerator in den TRAIN-Modus und geben Sie dann einen Fünf-Sekunden-Lichtimpuls maximaler Intensität mit einem orangefarbenen Filter ab. Überprüfen Sie die Spannungsantwort. Ersetzen Sie den orangefarbenen Filter durch einen breitbandigen Blaufilter und geben Sie drei 5-Sekunden-Lichtimpulse mit maximaler Intensität ab.
Überprüfen Sie die Spannungsantwort. Warten Sie mindestens 60 Sekunden im Dunkeln. Ersetzen Sie den Blaufilter durch den vorherigen orangefarbenen Filter.
Dann geben Sie zwei 5-Sekunden-Lichtimpulse mit 60-Sekunden-Intervallen. Überprüfen Sie die Spannungsantwort. Um das ERP-M-Potential zu messen, geben Sie einen kontinuierlichen Blaulichtimpuls, bis eine stationäre Spannungsantwort erreicht ist.
Geben Sie einen kurzen intensiven Lichtblitz mit einer Wellenlänge zwischen 350 und 700 Nanometern mit einem 20-Nanometer-Bandpassfilter. Messen Sie dann die Spitzenamplitude der M1-Phase der M-Potentialantwort, die die Metarhodopsinabsorption bei dieser spezifischen Wellenlänge im Photogleichgewicht widerspiegelt. Die PDA-Antworten wurden für verschiedene mutierte Fliegen ausgewertet.
Wildtypfliegen zeigten eine gesättigte Depolarisation im Dunkeln, die nach intensiver Blaulichtstimulation als verlängerte Hornhaut-negative ERG erschien. Die folgenden blauen Lichter erzeugten kleine Antworten, die dem PDA überlagert waren, ohne die Ein- und Aus-Transienten. Bei mutierten Fliegen mit abnormaler Photopigmentbiogenese wie ninaE kehrte die Spannungsantwort nach intensiver Blaulichtstimulation auf den Ausgangswert zurück, und die Reaktion auf ein zusätzliches blaues Licht wurde nicht unterdrückt und zeigte normale Ein- und Aus-Transienten.
Das Wildtyp-ERP der Fliege wird durch das gleiche Protokoll erhalten, aber während des PDA wird ein intensiver grüner Blitz angewendet. Dieser grüne Blitz löst das ERP aus und unterdrückt den PDA. Das M-Potential wurde durch den grünen Blitz nach blauer Beleuchtung erhalten, aber nicht durch einen blauen Blitz nach blauer Beleuchtung in der Wildtypfliege.
Dieses Protokoll wurde im Wildtyp, in der photopigmenthypomorphen Mutante ninaE und in der Phototransduktions-defizienten Mutante mit normalen Photopigmentspiegeln norpA wiederholt. Relative Absorptionsspektren von Fliegenrhodopsin und Metarhodopsin wurden aus photometrischen Messungen des unterschiedlichen Spektrums und des Photogleichgewichtsspektrums berechnet. Für das Überleben der Fliegen ist es wichtig, auf die Wachsviskosität zu achten, indem auf Überhitzung verzichtet wird.
Dieses Verfahren eignet sich für das genetische und durch Screening defekter visueller Mutanten. Methoden, die zufällig visuelle Mutationen isolieren und identifizieren, können die Entdeckung neuer Proteine und Mechanismen erleichtern, die an der Drosophila-Phototransduktion beteiligt sind. Das PDA-Protokoll ermöglichte die Isolierung wichtiger und neuartiger visueller Mechanismen.
Die Beteiligung wäre wahrscheinlich nicht entdeckt oder auch nur anders erwartet worden.
