Gnade Dion für das Verfolgen der Dendriten in 5A gezeigt;; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute R01EY017925 und R21EY020985 und Finanzierung von den Dana &amp; Whitehall Foundations PK Wir danken auch Matthew Petrella für die Unterstützung bei chirurgischen Eingriffen unterstützt und Pratik Chhatbar für Anmerkungen zum Manuskript.

Ein. Chirurgische Vorbereitung <ol><li> Induzieren Anästhesie und kontinuierlich überwachen Herzfrequenz, endexspiratorischen CO 2, EEG und Temperatur. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt und wurden auf die wir zuvor veröffentlichten 9,15 basiert. </li><li> Setzen Sie den dorsalen Oberfläche des Schädels, indem die Haut mit einem Skalpell. Sezieren die Bindegewebe über dem Knochen mit einer Brudon Kürette. Reinigen Sie die Knochen mit Wattestäbchen Applikatoren und Baumwollgaze. Bewerben Knochenwachs (bei Bedarf) auf den Schädel, gelegentlich Blutungen durch kleine Emissarien stoppen. </li><li> Bringen Sie einen Titan oder Edelstahl Kopfplatte auf den Schädel (über die Region von Interesse, wo die Kraniotomie durchgeführt werden), indem Zahnzement mit schwarzer Farbe (siehe Materialien) gemischt. Eine rechteckige Öffnung in der Mitte der Kopfplatte bietet Zugang für den Kraniotomie und optische Bildgebung. Bringen Sie ein Metall-Kammer auf der Oberseite des Kopfes Platte. Diese Kammer wird als Fluidreservoir zur Bildgebung dienen mit dem Wasser Immersionsobjektivlinse. </li><li> Sichern Sie die Kopfplatte mit einem xy mit Metall-Beiträge. </li><li> Auszudünnen einen großen Bereich des Knochens innerhalb der rechteckigen Öffnung der Kopfplatte durch Verwendung eines Dentalbohrers. Der zu verdünnen muß gut über die Grenzen des geplanten Kraniotomie erstrecken. Die dicke Schädel des nicht-Nagetier-Säuger muss ausgedünnt, wenn Bilder mit hoher Auflösung aus der Großhirnrinde erworben werden, weil am Ort Kraniotomie, die Dicke des Knochens wird die Dicke der Agarose zwischen dem Deckglas und neokortikalen Oberfläche diktiert werden (siehe unten) . </li><li> Bohren eines 2 x 2 mm quadratischen Umriss im Knochen für die Kraniotomie. Spülen Sie die Kammer regelmäßig mit frischen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) an Knochen Scherben zu entfernen und zu minimieren Wärmeabgabe an den zugrunde liegenden Kortex. Bewerben Knochenwachs nach Bedarf auf gelegentliche Blutung zu stoppen. </li><li> Lift der Knochen Klappe mit einem # 3 Pinzette. </li><li> Entfernen Sie alle, aber die untere Schicht der Dura mit einer feinen Pinzette (# 5CO) und Vannas Frühjahr Schere. Die Dura in Nicht-Nagetier Säugetieren ist dick und undurchsichtig, kann aber in verschiedenen Schichten entfernt werden. Blutung ist selten, kann aber mit Gelfoam gestoppt werden und kein Blut Rückstände sollten vorsichtig aus dem verbleibenden Schicht der Dura mit einer Pinzette und Spülen mit ACSF entfernt werden. Die letzte Schicht der Dura ist transparent und Pia Schiffe sollten deutlich sichtbar sein durch. Verlassen dieses letzte Schicht der Dura intakt während intrinsische Signal Bildgebung die Erfolgsrate der Bulkbeladung fluoreszierender Kalzium-Indikatoren für die anschließende Zwei-Photonen-Imaging-Phase des Experiments zu erhöhen (siehe Diskussion). </li><li> Geben Sie einen Tropfen warmen 2% Agarose (gelöst in ACSF) und sofort einen Deckglas über die Kraniotomie. Prüfen der Kraniotomie um sicherzustellen, dass respiratorischen und Herz-Kreislauf Pulsationen minimal sind durch Verwendung eines chirurgischen Präpariermikroskop oder die Okulare des zweiteiligenPhotonen-Mikroskop im Hellfeld-Modus. </li></ol> 2. Intrinsic Signal Optical Imaging <ol><li> Hinzufügen Gel-Schaum mit ACSF um die Außenseite des Abdeckglases, um die Agarose von Trocknung während intrinsische Signal Bildgebung verhindern eingeweicht. </li><li> Bringen Sie die intrinsische Signal Imaging CCD Kamera mit dem Standard-C-Mount-Anschluss auf der Oberseite des Zwei-Photonen-Mikroskop (Abbildung 1). Legen Sie die Beleuchtungslichtquelle in der Luft Tisch in der Nähe der xy-Ebene (Abbildung 1A). Position und sichern Sie die Lichtleiter über die Kraniotomie und Kopfplatte / Kammer (Abbildung 1B). Einfahren des primären dichroitischen Spiegel und die unterhalb der C-Mount-Port, so dass das reflektierte rote Licht für intrinsische Signale benötigt wird direkt von der Kraniotomie zur CCD-Kamera (1C-D). Mit dem 4x Luftobjektiv (0,13 NA, 17 mm WD), einem 2 x 2 mm Sichtfeld ist für intrinsische Signal Bildgebung zur Verfügung. </li><li> Legen Sie eine Wärme-Filter in der light Pfad, um den Kortex von Erwärmung zu verhindern. Verwenden eines Filters, der grünes Licht (546 nm Mittelpunkt λ) und Aufzeichnen eines digitalen Referenzbildes der kortikalen Oberfläche Blutgefäße hindurchgeht. </li><li> Bewegen Sie den z Fokus auf 500 um unterhalb der kortikalen Oberfläche. Verwenden Sie einen roten Filter (630 nm Zentrum λ), um den Cortex zur Messung intrinsische Signale zu beleuchten. Positionieren Sie die Lichtleiter, so dass die kortikale Oberfläche gleichmäßig ausgeleuchtet wird. Abschirmen Kraniotomie aus dem Licht von dem visuellen Stimulus-Display hergestellt. Präsentieren Sie eine Abfolge von visuellen Reizen und aufzeichnen Reflexionsdaten Bildern. Um eine Ausrichtung der Karte innerhalb von 10 min zu erzeugen, Daten erfassen, welche 4 Wiederholungen einer Sequenz von 8 Stimuli (4 Orientierungen und zwei Richtungen für jede Richtung). </li><li> Analysieren Sie die intrinsische Signal Daten an eine falsche Farbe Orientierungsplan generieren. Wählen potenziellen Zielregionen für Zwei-Photonen-Kennzeichnung von Neuronen, zB Orientierung pinwheel Singularitäten - Punkte in der Karte, woAlle bevorzugten Orientierungen konvergieren (Abbildung 2A). Überlagern die Ausrichtung der Karte und das Bild der kortikalen Oberfläche Gefäßsystem (2B-C). Verwenden das Layout der funktionalen Domänen und die Lage der großen Oberfläche Gefäße, um ein Ziel auszuwählen, die Vermeidung Bereichen mit großen Blutgefäßen und Arteriolen 15. </li></ol> 3. Bulk Loading fluoreszierender Kalzium-Indikatoren <ol><li> Vorbereiten einer Lösung aus 20% Pluronic / DMSO nach Zugabe von 1 g Pluronic in 5 ul DMSO. Das Gemisch wird bei 60 ° C für 10 min bis zum vollständigen Lösen des Pluronic. Man läßt das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen. Add 4 ul des Pluronic / DMSO-Gemisch zu einer 50 ug Fläschchen der fluoreszierende Kalzium-Indikator Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Dann fügen Sie 1 ul einer roten Farbstoff (Alexa Fluor 594, 2 mM Stammlösung) und 35 ul der Pipette Lösung (siehe Materialien) für eine Endkonzentration von 1 mM OGB-01.00. Beschallen die Lösung für ½ Stunde inein gekühltes Wasserbad und dann Zentrifuge mit einer 0,45 um-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Ziehen Sie einen Langkegel Pipette mit einem äußeren Durchmesser der Spitze von 2,0-2,5 um. Beladung 5 ul der Farbstoffmischung in die Pipette. </li><li> Entfernen Sie die letzte Schicht, um Dura Pipette Einführen zu erleichtern und zu erhalten, die höchste Qualität Zwei-Photonen-Bildern. </li><li> Bestimmung der exakten Position auf der kortikalen Oberfläche daß die Pipette platziert werden muss, um sein Ziel in kortikalen Schicht 2/3 zu erreichen. Unsere vorgegebenen kortikalen Ziel ist ein Windrad Singularität in der Ausrichtung Karte (Abbildung 2). Die Pipette ist in die Rinde in einem 30 °-Winkel angetrieben werden, um zwischen der Kammerwand und dem Ziel passieren. Somit, um die Zielregion 200 um unterhalb der kortikalen Oberfläche bezeichnen, wird die Pipette Eingabeposition auf der kortikalen Oberfläche ungefähr 350 um quer zur Soll-Position (3 AB) sein. </li><li> Bewegen des XY-Tischs (an dem das Tier und die pipette Mikromanipulator platziert sind) für die Zentrierung der kortikalen Oberfläche Eintrittsposition unter dem Objektiv (3C). Verwenden Sie ein 20x oder 40x-Objektiv mit einem Arbeitsabstand (WD) von mindestens 3 mm (siehe Materialien), um sicherzustellen, dass die Pipette wird leicht in die Hirnrinde, ohne das Ziel oder den Knochen an der Wand entlang der Kraniotomie. Sobald der Eintrag Position unter dem Ziel zentriert ist, erhöhen die Z-Position des Ziels um 2 mm (Figur 3D). Mit der grüne Auflicht-Fluoreszenz Licht eingeschaltet, um den roten Farbstoff Alexa in der Pipette zu visualisieren, benutzt das diagonale Achse der Mikromanipulator, um die Pipette zu bewegen, bis ihre Spitze zentriert ist (und fokussiert) unter dem Objektiv unmittelbar oberhalb der kortikalen Oberfläche Eingabeposition ( Abbildung 3E). </li><li> Pipette senkrecht abzusenken (entlang der z-Achse), bis die Pipette erreicht den kortikalen Oberfläche (3F), die sich während kontinuierlich die Pipettenspitze durch die okulars des Mikroskops. Verwendung Hellfeldbeleuchtung sind die kortikalen Oberfläche Blutgefäße und verbleibende Meningen (pia und Arachnoidea) leicht sichtbar wie die Pipette den kortikalen Oberfläche nähert. Wenn die Pipette nicht erreicht den gewünschten Eintrag Position, heben Sie die Pipette und kalibrieren Targeting basierend auf den vaskulären Wahrzeichen an der kortikalen Oberfläche. </li><li> Entfernen Sie das Ziel, Wick überschüssige Liquor aus dem Kraniotomie und trocknen Sie die angrenzenden Knochen mit fusselfreien Absorption Speeren. Geben Sie einen Tropfen warm 3% igen (gelöst in ACSF), um den Kortex, sichtbar durch die Kraniotomie (3G) ist zu stabilisieren. In Nicht-Nagern, 3% Agarose notwendig Pulsationen für eine erfolgreiche Aufnahme von fluoreszierenden Farbstoffen durch Neuronen zu dämpfen. Für intrinsische Signal Abbildungsoptik nur 2% Agarose ist erforderlich, da die Kombination von 2% Agarose und dem Deckglas für die nötige Stabilität. Hier wird kein Deckglas des Farbstoff-Ladeschritt so 3% Agarose verwendet wirdnotwendig. Nach Erstarren der Agarose, legen Sie eine 40x-Objektiv (0,8 NA, 3,3 mm WD) und neu füllen den Raum mit ACSF. </li><li> Wechseln Sie von Hellfeld-, zwei-Photonen-Leser und suchen Sie die Pipettenspitze. Verwendung der diagonalen Achse des Mikromanipulators, die Pipette zu bewegen, bis ihre Spitze erreicht die gewünschte Tiefe in der Rinde (Abbildung 3H). Gelegentliche Druck Auswerfen puffs der Farbstoffmischung (ein paar psi, wobei jeder Impuls 0,1 sec) verhindern helfen Pipettenspitze verstopfen. Da Uhr OGB-1 nur sichtbar beim Betreten Zellen, ist der rote Farbstoff Alexa entscheidend für die Visualisierung der Pipettenspitze in der Hirnrinde. </li><li> Vor dem Versuch, Neuronen in kortikalen Schicht 2/3 mit der vollen Dosis von Farbstoff zu laden, erneute Fokussierung des Ziels auf der kortikalen Oberfläche, um die Tiefe der Pipettenspitze zu bestätigen und sicherzustellen, dass die Spitze an der Zielposition ist, basierend auf dem Layout Oberfläche der Blutgefäße. Wenn die Pipette in Layer 2/3, sollten kleine puffs der Farbstoffmischung leuchten dieextrazellulären Raum und zeigen eine dichte Montage von runden Zellkörper als dunkle Schatten. </li><li> Zum Laden neuronale Zellkörper in einer Sphäre des Cortex 300-600 Mikrometer Durchmesser, injizieren die Farbstoffmischung in den extrazellulären Raum mit 30-90 Pulsen, wobei jeder Impuls 1,0 sec, 2-10 psi. Die Impulse der Druck sollte nicht so stark sein, dass das Gewebe bewegt. Nach der Injektion abgeschlossen ist, warten Sie ein paar Minuten, dann entfernen Sie die Pipette und objektiv. Warten Sie 1 Stunde, damit der OGB-01.00 vollständig aufgewickelt werden von Neuronen. </li><li> Entfernen Sie die Agarose für den Farbstoff Be-und spülen Sie die Aufnahme Kammer. Setzen Sie einen kleinen Tropfen von 2-3% Agarose auf der Oberfläche und schnell platzieren ein Deckglas über die Kraniotomie. Da die Fluoreszenzfarbstoffe lichtempfindlich sind, vermeiden Überbelichtung des Kortex Hellfeld-oder epi-fluoreszierendes Licht. Legen Sie eine hohe NA (1,0) 20x-Objektiv in das Objektiv Halter und re-Zentrum der markierten kortikalen Bereich unter dem Objektiv mit der xy. Schirmen die Kraniotomie aus Extraneous Lichtquellen, zB visuellen Stimulus Display, unter Verwendung mehrerer Schichten aus Blackout Material. </li></ol> 4. Single-cell Elektroporation von Fluoreszenzfarbstoffen <ol><li> Für die Untersuchung dendritische Morphologie, bereiten eine Lösung von 100 uM Alexa Fluor 594 (1:20 Verdünnung in ACSF von 2 mM Alexa Fluor 594 Aktien). Für die funktionelle Bildgebung von Dendriten eine OGB Salz kann 16,17 verwendet werden. </li><li> Ziehen Sie einen Langkegel Pipette mit einer Spitze Größe von 1 um und laden Sie 5 ul Farbstoff in die Pipette. Alle weiteren Schritte des Targeting eine funktionelle Domäne sind identisch mit dem Bulkbeladung Methode (Figuren 1-3). Um die Pipettenspitze benachbart zu einem neuronalen Zellkörper Membran positionieren, überwachen die Erhöhung Elektrodenimpedanz und Druck Sprühstöße von Farbstoff auf den extrazellulären Raum zu beleuchten und sehen Zellkörper als Schatten während Zwei-Photonen-Bildgebung. </li><li> Wenn die Pipettenspitze neben einem neuronalen Zellkörper Membran ist, verwenden Sie die Axoporator 800A anzuwenden1-3 Impulsen (-8 bis -10 V, 10 ms Puls). Die sofortige Füllung des Neurons mit Farbstoff ist leicht sichtbar mit zwei-Photonen-Mikroskopie. Nehmen Sie die Pipette und sammeln hochauflösende Bilder von Dendriten und Axone in vivo. </li></ol>

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S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17/18+border+in+cat+visual+cortex.">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li><li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex.">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li><li>da Costa, N. M., Martin, K. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir präsentieren eine Methode, um die Etikettierung von neuronalen Zellkörper (oder Dendriten und Axone) in vorgegebenen funktionalen Mikrodomänen des Neokortex Ziel. Zusammenführen intrinsische Signal optischen Bildgebung mit Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, zu bestimmen, welche Zellen Synapsen und tragen zur Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte, ob neuronalen Selektivität korreliert mit der Position des Neurons in einem funktionellen Karte, und die neuronale Schaltungskomponenten ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ein. Life Support / Experiment prep </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Webster Vet </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran Verdampfer </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Feedback geregelten Heizdecke </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> EKG-Monitor </td><td> Digicare Biomedical </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> EEG-Verstärker </td><td> AM-Systems </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> EEG Monitor </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> Endexspiratorischen CO 2-Monitor </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Optimieren Belüftung </td></tr><tr><td> Hartmetallbohrer Grate zum Bohren Knochen </td><td> Henry Schein </td><td> feine (0,5 mm Spitze) und grob (1,25 mm Spitze) </td><td></td></tr><tr><td> Zement für Kopfplatte / Kammermusik </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Black Powder Tempera Farbe </td><td> Sargent Art Inc. </td><td> 22-7185 </td><td> In den Zement zu lichtabschirmende verbessern und Reflexionen </td></tr><tr><td> Agarose - Typ III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Zur Minimierung Pulsationen während intrinsische Signal und Zwei-Photonen-Imaging </td></tr><tr><td> Deckglas: 5 oder 8 mm Durchmesser, 0,17 mm Dicke </td><td> World Precision InInstrumente </td><td> 502040, 502041 </td><td> Zur Minimierung Pulsationen während der Bildgebung kann die Deckglas nach Bedarf geschnitten werden </td></tr><tr><td> Brudon Küretten </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Reinigung Kopfoberfläche </td></tr><tr><td> Knochenwachs </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Schnell Blutungen stoppen </td></tr><tr><td> Wattestäbchen </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72308-05 </td><td> Saubere und trockene Knochenoberfläche </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Schnappen einzelnen Schichten der Dura oder pia </td></tr><tr><td> Vannas Federschere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td> Cut dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Um Blutungen auf der Dura zu stoppen </td></tr><tr><td> Absorption spears</td><td> Fine Science Tools </td><td> 18105-01 </td><td> Ultra-schnelle und fusselfreien Aufsaugen von CSF </td></tr><tr><td> Blackout Material </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Schild Kraniotomie </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Farbstoffzubereitung / Einspritzung </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-01.00 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Calcium-Indikator </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugal Filter (0,45 um Porengröße) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Um Verunreinigungen vor der Injektion zu entfernen </td></tr><tr><td> Glaspipette puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Fäden verbundene Kapillare (1,5 mm Außendurchmesser) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B150F-4 </td><td> Dye Auswerfen Pipette </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Zum Be-Farbstoff in Pipette </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Um Pipettenposition </td></tr><tr><td> Pressure Impulsregler </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Für Einspritzung des Farbstoffes </td></tr><tr><td> Einzelzell-Elektroporators </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Zur Elektroporation des Farbstoffs </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrinsic imaGing </td></tr><tr><td> 4x Objective (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olymp </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Intrinsic Hardware / Software </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ Software ist für episodische Bildgebung </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Lichtquelle Stromversorgung </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Lichtquelle </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> HAL 100 </td><td> Lichtstärke an der kortikalen Oberfläche beträgt 3-5 mW </td></tr><tr><td> Grün-Filter (für vaskuläre Bild) </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> λ = 546 nm (Bandpass 30 nm) </td><td> Für Referenzbild der Oberfläche Gefäßsystem </td></tr><tr><td> Red Filter (für eigensichere Signal) </td><td> Optische Imaging Inc. </td><td> λ = 630 nm (Bandpass 30 nm) </td><td> Um intrinsische Signale zu sammeln </td></tr><tr><td> Wärmeschutzfilter </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. Zwei-Photonen-rig / Imaging </td></tr><tr><td> Zwei-Photonen-Mikroskop und Software </td><td> Prairie Technologies </td><td></td><td> Siehe Shen et al. 2012 für Lichtweg, Filter und Laserleistung </td></tr><tr><td> Ti: Saphir-Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA, 3,5 mm WD) </td><td> Olymp </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 NA Ziel ist nur zum Ausrichten Pipette über die Kraniotomie verwendet (nicht für Zwei-Photonen-Imaging) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA, 2,0 mm WD) </td><td> Olymp </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) </td><td> Olymp </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Lufttisch </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Trennt Vorbereitung von externen Vibrationen </td></tr><tr><td> xy </td><td> Mike Machine Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Versuchsperson und Sutter Mikromanipulator auf xy Bühne platziert </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Rezepte </td></tr><tr><td> Künstliche Cerebrospinalflüssigkeit </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Pipette Lösung 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

In der primären Sehrinde des Nicht-Nagetier Säugetieren, sind Neurone nach ihrer Präferenz für Stimulus-Features wie Ausrichtung 1-4, Richtung 5-7, okuläre Dominanz 8,9 und binokulare Disparität 9 gruppierten. Orientierungsselektivität ist das am besten untersuchte und eine kontinuierliche Funktion der Karte mit einem quasi-periodischen Layout für bevorzugte Orientierung vorhanden ist über den gesamten primären Sehrinde 10,11. Die Integration der synaptischen, Mobilfunk-und Netzwerk-Beiträge, die Stimulus-selektive Reaktionen in diesen funktionellen Karten führen erfordert die Hybridisierung von bildgebenden Verfahren, die sub-micron überspannen bis Millimeter räumlichen Skalen. Bei herkömmlichen intrinsische Signal optische Bildgebung kann die gesamte Anordnung der Funktionskarten über die gesamte Oberfläche des visuellen Kortex 12 bestimmt werden. Die Entwicklung der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit Calcium-sensitiven Farbstoffen ermöglicht es, die SYNAPT bestimmenIC-Eingang ankommen einzelnen dendritischen Dornen 13 oder Rekord-Aktivität gleichzeitig aus Hunderten von einzelnen neuronalen Zellkörper 6,14. Folglich Kombinieren intrinsische Signal Bilderzeugung mit der Sub-Mikrometer Ortsauflösung Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, genau festzustellen, welcher dendritischen Zellen Segmente und an das Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte in der Großhirnrinde beitragen. Hier zeigen wir, eine hohe Ausbeute-Verfahren zum schnellen Gewinnung eines kortikalen Orientierungskarte und die eine spezifische Mikro-Domäne in diesem funktionellen Karte zur Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Neuronen in einem nicht-Nagetier-Säuger. Mit dem gleichen Mikroskop für Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet, wir erzeugen zunächst eine Orientierung Karte mit intrinsische Signal optische Bildgebung. Dann werden wir zeigen, wie man ein Mikro-Domain von Interesse mit einer Mikropipette mit Farbstoff entweder Label geladen gezielt eine Population von neuronalen Zellkörper oder Etikett eines einzelnen Neurons, dass Dendriten, Stacheln und Axone sichtbar sindvivo. Unsere Verbesserungen gegenüber bisherigen Methoden ermöglichen eine Untersuchung der neuronalen Struktur-Funktions-Beziehungen mit sub-zellulärer Auflösung im Rahmen des Neokortex funktionalen Architekturen.

Um die Genauigkeit der Farbstoff Markierungsverfahren veranschaulichen, gezielte wir den kleinsten Mikro-Domäne von irgendeinem bekannten funktionellen Karte im nicht-Nagetier Neocortex. Dünn ganzen Orientierungsplan in der primären Sehrinde unterbrochen sind Singularitäten. Diese treten an Stellen, wo alle bevorzugten Orientierungen konvergieren, so dass in Falschfarben Karten der bevorzugten Orientierung, die Regionen um die Singularität aussehen &quot;Windräder&quot; (2A-B). Ein Windrad pro Kra...

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Aufrufe.  Medical University of South Carolina. Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.

Serie: Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.