Die Autoren möchten M. Steczkowski für Sprachaufnahmen, M. Borczyk für Zeichnungen, A. Trąbczyńska für die Virusproduktion, M. Ziókowska für die Genotypisierung und A. Mirgos für die Unterstützung bei Dreharbeiten zu danken. KR erkennt die Art Geschenk des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) fluoreszierendes Protein mCherry unter der Kontrolle von CaMK Promotor von K. Deisseroth Ausdruck zu bringen. dem Europäischen Regionalentwicklungsfonds innerhalb - Dieses Projekt wurde in den Kernanlagen des Labors für Tiermodelle und Labor für Tissue Struktur und Funktion, Zentrum für Neurobiologie, Nencki Institut für Experimentelle Biologie, mit dem Einsatz von CePT Infrastruktur von der Europäischen Union finanziert werden durchgeführt das operationelle Programm &quot;Innovative Wirtschaft&quot; für den Zeitraum 2007-2013. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der National Science Centre unterstützt: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 zu KR und Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 bis RC

Alle nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von lokalen Ethikkommission am Nencki Institut für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften genehmigt. Hinweis: Einige der Szenen in dem zugehörigen Video beschleunigt werden. Drehzahlfaktor wird in diesen Szenen angezeigt. 1. Eine Operation Vorbereitung <ol><li> Sterilisieren alle Werkzeuge, Glasbehälter für Flüssigkeiten und Wattestäbchen im Autoklaven. Verwenden entbehrlich Handschuhe. Reinigen Sie den OP-Tisch, die Stereotaxierahmen und die ganze Umgebung mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine sterile OP-Pad einen sterilen Raum für alle sterilisierten Ausrüstung zu schaffen. Schneiden Sie Gelfoam in kleine Stücke und genießen sie in steriler Kochsalzlösung. Hinweis: Nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, Ethanol ist weder ein Sterilisierungsmittel noch ein High-Level-Desinfektionsmittel. Es sollte nur als Reinigungs- / Entfettungsmittel auf zuvor sterilisierten Oberflächen verwendet werden. </li><li> Legen Sie das Tier in the Induktionskammer und stellen Sie die Isofluran-Ebene auf 5% und Sauerstoffstrom auf 2 l / min. Dieses Verfahren sollte ca. 3 Minuten dauern. </li><li> Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer. Verwenden Schwanz oder Zehen kneift, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert. </li><li> Mit Hilfe eines präzisen Trimmer das Haar von der Rückseite des Kopfes (zwischen den Ohren) bis zu den Augen rasieren. </li><li> Legen Sie das Tier in der Stereotaxierahmen und stabilisieren den Kopf mit Ohr-Bars. </li><li> Set Anästhesie Ebenen 1,5-2% Isofluran und 0,3 l / min Sauerstoff. </li><li> Tragen Sie die Augensalbe. </li><li> Injizieren das Tier subkutan mit Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) und Baytril (5 mg / kg) Entzündung, Schmerz und Infektion zu verhindern, respectively. </li><li> Spritzen Sie das Tier intramuskulär mit Dexamethason (0,2 mg / kg) Schwellung des Gehirns zu verhindern. Hinweis: Es ist möglich , Dexamethason subkutan zu injizieren oder intraperitoneal Muskelschäden zu verhindern. </li><li> Reinigen Sie die Haut mit sterile Wattestäbchen mit Betadine um 70% Ethanol. </li><li> Ändern Sie die Handschuhe und sprühen sie mit 70% Ethanol. Hinweis: Während der Einmalhandschuhe verwenden nicht das sterile Feld berühren. Berühren Sie das Tier nur mit den Spitzen der sterilen chirurgischen Instrumenten und sterilen Tupfer. </li></ol> 2. Cranial Fenster Chirurgie <ol><li> Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und mit Mikro Schere, um die Haut horizontal entlang der Basis des Kopfes einzuschneiden und dann schräg nach vorne Punkt zwischen den Augen. Entfernen Sie die Hautlappen. </li><li> Bewerben Lidocain Salbe mit einem sterilen Tupfer auf die Knochenhaut übermäßigen Blutungen und Schmerzen zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie sterile Wattestäbchen oder einem Skalpell das Periost zu entfernen. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Tupfer. </li><li> Mit Anwendung einer sterilen Nadel dicht Sekundenkleber auf die Hautränder sie zu immobilisieren und aus dem Kontakt mit Zahnzement zu verhindern. Warten Sie auf den Leim trocknen. </li><li> Legen Sie eine sterile 3 mm Deckglas über ter Schädel nach vorn auf die Lambdanaht. Zentrieren Sie das Deckglas an RSC-Koordinaten: AP, Bregma -2,8; ML, Bregma 0. Markieren Sie die Deck Kanten durch die Schädeloberfläche mit einer sterilen Nadel zu kratzen. Legen Sie das Deckglas wieder in den sterilen Behälter mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden Sie ein High-Speed-Dentalbohrer mit kleinem Durchmesser Grat mit einem 3 mm Durchmesser-Kreis zu skizzieren. Reinigen Sie die Bohrstelle aus dem Knochenstaub mit steriler Kochsalzlösung getaucht Tupfer. Verwenden Sie die Gelfoam und Tupfer die gelegentliche Blutungen zu stoppen und den Knochen zu reinigen. </li><li> Dazwischen Bohrungen überprüfen Sie die Knochendicke mit einer feinen Pinzette vorsichtig den Knochen Kreis berühren und seine Beweglichkeit zu prüfen. Denken Sie daran, dass der Knochen auf der Naht der Bereich dicker ist. Stoppen Sie die Bohrung, wenn der Knochen Kreis ist mobil und nur eine gleichmäßige, wird dünne Schicht von Knochen auf dem Umfang links. Reinigen Sie das Operationsfeld aller verbleibenden Knochenstaub mit Kochsalzlösung getaucht Tupfer. </li><li> Löschen Sie die sterile Kochsalzlösung auf der Bohrstelle, für den gebohrten circle. den Knochen Kreis mit einer feinen Pinzette vorsichtig hebeln und dann vorsichtig, aber fest den Knochen entfernen, indem Sie ihn nach oben zu heben. Achten Sie darauf, nicht die Knochen Kreis zu neigen, während sie heben eine mögliche Beschädigung der Dura zu verhindern. </li><li> gelten vorsichtig die Gelfoam in steriler Kochsalzlösung auf die Dura getränkt, um die Blutung zu stoppen. Warten Sie, bis alle Blutung vollständig gestoppt wird. Entfernen Sie vorsichtig den Gelfoam nicht den Gerinnungsprozess zu stören. Hinweis: Die Nahtbereich gefäß ist, so dass die an dieser Stelle Blutungen könnte sich tiefgründig zu sein. Es ist wichtig, für die genügend Zeit zu warten, bis die Blutung vollständig zu stoppen. Es ist hilfreich, die Kochsalzlösung getränkten Gelfoam, indem sie auf Eis gestellt gekühlt zu halten. </li></ol> 3. Virus Injection <ol><li> Bringen Sie die Infusionspumpe mit dem stereotaktischen Turm und den Controller angeschlossen werden. </li><li> Legen Sie die 35G Nadel in die Spritze. Spülen Sie die Spritze 10-mal mit Ethanol um sie zu sterilisieren und 10 mal mit steriler Kochsalzlösung zu entfernen Spuren von ethanol. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spritze. Legen Sie die Spritze in die Pumpe. Hinweis: Stellen Sie sich andere Desinfektionsmittel verwenden. </li><li> Tauen Sie eine Einzeldosis von rAAV2 / 1 mCherry Vorbereitung (10 12 pfu wird empfohlen) und halten Sie sie auf Eis. Füllen Sie die Spritze mit der Virus-Lösung. </li><li> Zentrieren Sie die Nadel auf dem Bregma und dann sanft in den Hippocampus fügen Sie die folgenden Koordinaten: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Diese Koordinaten werden in der Nähe der Kante der Kraniotomie befinden. Warten Sie 5 Minuten für das Gewebe zu stabilisieren. </li><li> Injizieren 0,7 ul der rAAV2 / 1 mCherry Lösung mit einer Geschwindigkeit von 50 nl / min. Warten Sie 10 min für das Virus vollständig zu adsorbieren. Sie vorsichtig die Nadel entfernen. Blot mit Gelfoam wenn die Blutung auftritt. Wiederholen Sie mit dem kontralateralen Seite. </li></ol> 4. Cranial Fenster Implantierung <ol><li> Legen Sie das sterile, getrocknete Deckglas auf der Oberseite der Dura in dem gebohrten Kreis Rahmen. Halten Sie das Deckglas mit dem forceps die Dura zu sanft flach und bringen Abdeckglas &#39;Kanten an die Schädeloberfläche näher. Hinweis: Es ist möglich , dass das Deckglas das Gerinnsel stört und die Blutung wird fortgesetzt. Wenn das der Fall ist, heben Sie den Deckglas, legen Sie sie in Alkohol, trocken und Rückkehr 2.9 zu treten. </li><li> eine sterile Nadel gelten die dichte Sekundenkleber auf den Abdeckglas Kanten Mit ihnen auf den Schädel zu befestigen. Warten Sie auf den Leim trocknen. </li><li> Legen Sie eine Befestigungsstange (M2 Mutter oder eine Sonderanfertigung) im vorderen Teil des Schädels. Tragen Sie die Sekundenkleber über die Ränder des Balkens. Warten Sie auf den Leim trocknen. <ol><li> Legen Sie die Befestigungsleiste in einer Position, die horizontale Positionierung des Schädelfenster während der Bildgebungssitzung ermöglicht. Stellen Sie sie so weit entfernt wie möglich aus dem Fenster. Wenn es um das Fenster zu schließen platziert wird, die Bar und die Schraube mit dem maßgeschneiderten Halter verbinden könnte als ein Hindernis für das Ziel während des Abbildungsprozesses darstellen. </li></ol></li><li&gt; Bereiten Sie die Dentalacryl und wenden es auf der Schädeloberfläche um das Glas. Es ist hilfreich, um das Fenster eine kraterartige Form zu bilden. Es wird einen Hohlraum zum Wasser schaffen später für die Bildgebung mit dem Wasser Ziel angewandt. </li><li> Erstellen Sie eine Kappe mit dem Dentalacryl, für den Rest des operativen Bereich Hautränder, Fixierung Bar, den Krater um die Schädelfenster verstärken. Warten, bis der Zahnzement zu härten. </li><li> Nehmen Sie das Tier aus dem Stereotaxierahmen und steckte es in die Auffangkammer. </li><li> Warten, bis das Tier von der Operation erholen, während die physiologischen Funktionen zu beobachten. </li><li> Anwenden postoperative Analgesie (Carprofen, 10 mg / kg) und Antibiotika-Behandlung (Baytril, 5 mg / kg) für 48 Stunden. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Starten Sie den Ti: Saphir-Laser, Macht das Mikroskop auf. Das System in diesem Experiment verwendet wird mit einem Zwei-Photonen-Laser, OPO System und Dual GaAsP PMT ausgestattet. </li><li> Legen Sie das Tier in der INDUCtion Kammer und Anästhesie zu induzieren. </li><li> Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer und in der Gasnarkosemaske unter dem Mikroskop. Verringern Sie den Sauerstofffluss auf 0,3 l / min und die Isofluran-Konzentration auf 1,5 bis 2%. </li><li> Befestigen Sie das Tier auf dem benutzerdefinierten Mikroskop Rahmen mit einem M2 Schraube (oder einem anderen benutzerdefinierten System). Richten Sie die Schädelfenster. Hinweis: Es ist möglich , die Mikroskophersteller Kopf Fixationssystem zu verwenden, obwohl die spezifische benutzerdefinierte Rahmen zu besseren Ergebnissen führt (verbesserte Kopfstabilität, konstante Positionierung in mehreren Sitzungen während einer chronischen Experiment). </li><li> Mit Hilfe der Weitfeld-Mikroskop-Einstellungen und eine geringe Vergrößerung Ziel Zentrum der Blick auf eine der Seiten von retrosplenialen Kortex und fokussieren es auf der Deckfläche. </li><li> Tragen Sie einen Tropfen Wasser in die kraterartigen Acryl gut. Wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv lange Strecke. Bewegen Sie das Ziel in Richtung Schädelfenster, bis der Wassermeniskus conConnects der Probe und Ziel. </li><li> Wechseln Sie in den Zwei-Photonen-Einstellungen und beginnen Scannen der Probe von oben nach unten niedrigsten Zoom verwendet wird. Die Überquerung der Dura mater wird als Blendung von hohen unspezifischen Signal sichtbar sein. </li><li> Passen Sie die Mikroskop Erwerb Einstellungen in beiden Kanälen (GFP und mCherry) entsprechend der Signalstärke von fluoreszierenden Zellen, um den gesamten Dynamikbereich abzudecken. </li><li> ein geeignetes Neuron (mit dendritischen Baum von anderen Zellen getrennt) führen einen ersten Scan nur mit der GFP filterset mit dem niedrigsten Zoom und z-Abstand von 5 Mikrometer Nach dem Auffinden. </li><li> Besorgen Sie sich einen maximalen Vorsprung des gescannten Stapel und drucken Sie es für Anmerkungen (invertierten Farben verwenden). </li><li> Stellen Sie Zoom auf einen Wert, der die gewünschten morphologischen Details Bild ermöglicht. Bild der gesamten dendritischen Baum in den GFP und mCherry Kanäle mit maximaler Projektion als Führer. </li></ol>

<ol>
	<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window.">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li><li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex.">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex.">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input.">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation.">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li><li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat.">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li></ol>

Die Autoren (KL, MR, KR) haben Rechte für Patent angemeldet (PL410001) für in diesem Artikel verwendete Halterahmen.

In der aktuellen Papier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Zwei-Photonen - in - vivo - Bildgebung der synaptischen Eingänge und postsynaptischen Ziele im RSC durch ein Schädel-Fenster. Das Implantationsverfahren bestehen aus mehreren Schlüsselschritte. Zunächst wird das Tier tief anästhesiert und in dem stereotaktischen Rahmen befestigt, dann wird der Schädel über RSC wird entlang der markierten Kreislinien mit einem Bohrer ausgedünnt und die kreisförmige Knochen entfernt w...

Zwei-Photonen-Mikroskopie revolutioniert die Beobachtung der Gehirnaktivität in lebenden und lebenden Tier. Seit seiner Einführung im Jahr 1990 es schnell Popularität gewonnen und ist nun als eines der interessantesten und innovative Ansätze zur Untersuchung zahlreicher Aspekte der Hirnaktivität in vivo 1,2 umgesetzt. Diese Anwendungen umfassen Blutströmungsmessungen, neuronale Aktivierung (beispielsweise unter Verwendung von Calciumfüllstandsanzeiger oder immediate early Gene expression) und die Morphologie von neuronalen Zellen. Eine zunehmende Anzahl von Laboratorien Zweiphotonen - Mikroskope, die Technik in der gesamten wissenschaftlichen Welt als neuer Standard für die Umsetzung in vivo Bildgebung des Gehirns. Der Standardansatz beinhaltet die Implantation des Schädelfenster (ein rundes Loch in den Schädel mit einem Deckglas bedeckt) über den Lauf oder visuellen Kortex des Gehirns von Mäusen 3. Als nächstes wird in Abhängigkeit von der Versuchsprotokoll, das mouse durchläuft eine Reihe von Visualisierung und Verhaltenstrainingseinheiten, so dass die Veränderungen in der Hirnaktivität und die neuronale Morphologie über 4,5 Zeit zu überwachen. In beiden Fällen wirkt sich die Kraniotomie nur den Scheitelbein, ohne die Nähte kreuzen. Es wird weitgehend angenommen, dass der Hauptnachteil der Technik leicht zugänglich Cortex wie der Lauf oder Sehrinde seine begrenzte Anwendung. Implantieren des kranialen Fenster über anderen Regionen stellt eine Menge Schwierigkeiten, aufgrund einer übermäßigen Blutungen und / oder räumliche Hinderung. In dieser Arbeit schlagen wir vor der Implantation des kranialen Fenster über dem retrosplenialen cortex (RSC) als weitere mögliche interessierende Region für die Zwei-Photonen - Mikroskopie in vivo 6. RSC ist ein wichtiges Element des Gehirns Schaltung verantwortlich für die räumliche Gedächtnisbildung. Anatomisch ist RSC ein Teil eines neuronalen Netzes verbindet cortical, hippocampalen und thalamischen Regionen 7. Es istin einer Reihe von Verhaltensweisen, wie räumliches Lernen und Extinktion sowie räumliche Navigation 6 stark beteiligt. Um die morphologischen Veränderungen der Neuronen zu visualisieren verwenden wir eine transgene Mauslinie, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der THY1 Promotor. Bei diesen Mäusen GFP wird in etwa 10% der Neuronen im Gehirn ermöglicht eine klare Visualisierung der kortikalen Axonen und Dendriten mit Zwei-Photonen - Mikroskopie 8 ausgedrückt. Eine weitere Neuerung , die wir vorschlagen , ist die Injektion eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus - Serotyp 2/1 (rAAV2 / 1) Codieren eines rot fluoreszierendes Protein (mCherry) unter einer neuron-spezifischen Promotor CaMKII 9 in die tieferen Strukturen des Gehirns RSC Projizieren wie dem Hippocampus. Die Expression von rAAV2 / 1 mCherry im Hippocampus von Thy1-GFP - Maus ermöglicht die gleichzeitige Darstellung von prä- und postsynaptischen Elemente der Hippocampo-cortical Synapsen 10. Die rAAV-gesteuerte Expression von mCherry erfordert zwei bis drei Wochen für das Protein ausreichendes Niveau in den axonalen Terminals zu erreichen. Diese Frist ist mit der üblichen Zeitaufwand für die Wiederherstellung von Craniotomie konsistent.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drug</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>5-2% pre-operative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>1.5-2% during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexametasone</td>
			<td>Scan Vet</td>
			<td>Dexasone 2mg/ml</td>
			<td>0.2 mg/kg intramuscular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>5 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tolfedine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4%</td>
			<td>4 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butomidor</td>
			<td>Richter Pharma</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>2 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>KRKA-Polska</td>
			<td>Rycarfa 50mg/ml</td>
			<td>10 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>Lignocainum</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>20 mg/g</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Spongostan dental; REF MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Dedra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA glue</td>
			<td>Pelikan Daniel</td>
			<td>20G Huste</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>SpofaDental</td>
			<td>Duracryl Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>HSE-64-0720</td>
			<td>3 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Sigmed</td>
			<td>Keystone KVet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation bar</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M2 or M3 screw nuts could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Renex</td>
			<td>PN-7B-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BM.183.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>KOZO</td>
			<td>XTL6445T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder frame</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Upright Axio Examiner Z1</td>
			<td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus</td>
			<td>gift from K. Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die Expression von GFP in einer Untergruppe von Neuronen im Thy1-GFP reporter Maus in vivo Abbildung der kortikalen Dendriten und lokale axonale Projektionen in RSC ermöglicht. 1A zeigt maximale Projektion eines Stapels von Bildern mit mehreren GFP-positive Dendriten erkennbar. Der Zellkörper wird durch eine Arterie verdeckt. 1B zeigt eine einzige Ebene vergrößerte Bild (Digitalzoom 3x) der dendritischen Verzweigung in 1A angegeben. Details ...

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K Aufrufe.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Serie: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Die gleichzeitige Zwei-Photonen

Zusammenfassung

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