Wir danken Dr. Yuriy M. Usachev für seine Hilfe in der ersten Standardisierung der konfokalen Mikroskopie / Bildgebung der Maus plantar Stanzbiopsie Immunfärbung und Dr. Donna L. Hammond für ihre weitere Unterstützung und konstruktive Kritik an dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NINDS / NIH (NS069898), und eine Idee Development Grant Award von dem Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) zur DPM finanziert

1. Tierische Perfusion Alle tierischen Verfahren in dieser Studie durchgeführt werden, durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Iowa zugelassen, und folgen NIH-Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung. <ol><li> Am Tag vor der Perfusion, bereiten 1 L Phosphat-Puffer (0,2 M PB in doppelt destilliertem H 2 O, pH 7,4) und bei 4 ° C. Dies wird für die Perfusion und Postfixierung Prozesse verwendet werden. </li><li> Am Tag der Perfusion, bereiten 500 ml von 4,0% Paraformaldehyd in 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) Fixierlösung, ein ausreichendes Volumen für die Perfusion von 2 Mäusen: Mikrowelle 200 ml ddH 2 O in ein Becherglas für 30 sec oder bis sie Ansätze zu kochen. 20 g körniger Paraformaldehyd (PFA) in das Becherglas unter ständigem Rühren unter einer Abzugshaube. 5 ml 5 N NaOH tropfenweise und unter Rühren, bis die Lösung klärt. Wenn der PFA vollständig gelöst ist, kühlen die Lösung auf Raumtemperatur (RT). Slowly add 250 ml von 0,2 M PB unter ständigem Rühren. Mit zunehmend schwächere HCl-Lösungen (6 N bis 1 N bis 0,1 N), den pH-Wert auf 7,4. Passen Sie das endgültige Volumen auf 500 ml und Chill auf Eis. Auch die Zubereitung von 400 ml 0,1 M PB von 0,2 M Lager durch Verdünnung 1:1 in ddH 2 O und Chill auf Eis. </li><li> Anesthetize der Maus durch intraperitonial Injektion einer Überdosis Betäubungsmittel (Natrium-Pentobarbital, 80 mg / kg, mit einer 27G Nadel verabreicht). </li><li> Während Perfusion, werden mit 50 ml 0,1 M PB (verdünnte 0,2 M PB Lager 1:1 mit ddH 2 O) und 150 ml PFA nacheinander in der Maus Kreislauf geführt werden. Richten Sie die Schlauchpumpe, indem Sie den Schlauch mit PB und Fixierung eines 23 2.1 G Butterfly-Nadel an einem Ende. Tauchen Sie das andere Ende des Schlauches in das Becherglas mit 0,1 M PB. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Schlauchpumpe bis 10 ml / min, und die Pumpe durch eine ausreichende Menge der Lösung, um sicherzustellen, dass es keine Luftblasen in den Schlauch. </li><li> Warten Sie, bis die anesthetized Maus nicht mehr zeigt keine Reflexe Aktivität, wie toe / Schwanz kneifen und Blinkreflex. Legen Sie das Tier auf einer Dissektion Tablett Bauchseite im Inneren einer Abzugshaube und sichern Sie die Pfoten mit Klebeband. Sprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol. Machen Sie einen Schnitt durch die Haut entlang der Mittellinie des Brustkorbs und der obersten Viertel der Bauchdecke entlarven. Dann durch die Bauchdecke schneiden an der Basis des Brustkorbs. Nach dieser Einschnitt, sollte das Zwerchfell und unteren Ende des Brustbeins sichtbar sein. Sorgfältig von links nach rechts durch den Rand der Membran, und über die gesamte Länge des Brustbeins schneiden, dabei nicht in die Lunge Schaden. Einige kleinere Blutungen aus dem Brustbein in dieser Phase ist normal und gefährden nicht Perfusion. Sobald der Schnitt entlang des Brustbeins vorgenommen worden ist und die Membran geschnitten, es sollte möglich sein, jeweils die Hälfte der Brustkorb nach oben und nach außen, so dass das Herz ausgesetzt ist aufzuheben. Bewegen zur Seite der Lunge, wenn nötig. Beide Hälften des Brustkorbs kannin dieser Position mit dem Einsatz von hämostatischen Klammern gehalten werden. Legen Sie die Butterfly-Nadel (23 1 / 2 G) an der Schlauchpumpe 3-4 mm in den linken Ventrikel, parallel zur Längsachse des Tieres. Diese Platzierung minimiert das Risiko der Nadel immer verdrängt. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof, damit die Rückkehr Kreislauf fließen aus dem Herzen. </li><li> Begin Perfusion mit 0,1 M PB bei 10 ml / min für 4-5 min. Wenn es immer noch eine erhebliche Menge an Blut, die aus der rechten Vorhof an dieser Stelle fortgesetzt, bis der Fluss ist klar. </li><li> Stoppen Sie den Fluss von PB und schalten Sie den Eingang auf der Schlauchpumpe auf die 4% PFA-Lösung. Reduzieren Sie die Durchflussmenge zu 5 ml / min und wieder pumpen PFA-Lösung für 20-25 min. Da die PFA in den Kreislauf, die Muskeln in Krampf gehen, und nach ein paar Minuten, sollte das Tier buchstäblich &quot;repariert&quot; werden in Position. Diese Steifigkeit kann durch leichtes Drücken gegen die Hinterpfoten getestet werden, dabei nicht zu bewegen das Tier einnd verdrängen die Kanüle. Gute Durchblutung wird das Bein von Biegen in Reaktion zu verhindern. Nach Perfusion mit PFA abgeschlossen ist, kann die Kanüle und blutstillende Klemmen getrennt, und die kadaver für Gewebedissektion vorbereitet. Die Dissektion Ansatz verwendet wird, hängt von der spezifischen Gewebe. </li><li> Bereiten Sie 4% PFA / 5% (v / v) Pikrinsäure (PA; für die Sammlung und post-Fixierung von plantar punch nur) durch Zugabe von gesättigter Pikrinsäure-Lösung auf 4% PFA. Aufnahme von PA deutlich verbessert Antigen Nachweisbarkeit in peripheren neuronalen Geweben 1 </li><li> Bereiten Knochen / Knorpel Entkalkung / Frostschutzmittel-Lösung - 10% EDTA in 0,1 M PB mit 0,07% Glycerin und 15% Saccharose. EDTA-basierte Lösungen entkalken Gewebe bei gleichzeitiger Wahrung Epitope 2. </li><li> Bereiten Sie das Frostschutzmittel Lösung - 30% Saccharose in 0,1 M PB. </li></ol> 2. Gewebedissektion / Entfernen, Post-Fixierung und Schnitte <ol><li> Plantar Punsch Legen Sie die Perfusionsed Tier Bauchseite nach unten auf eine Schneidematte oder andere feste Oberfläche. Halten Sie den Fuß Fußsohle-up, drücken Sie fest mit der Stanzbiopsie Werkzeug (3 mm Durchmesser; Harris Micro-Punsch, Ted Pella Inc.) in die Mitte des Fußes. Schalten Sie die Biopsie-Tool hin und her um 180 Grad um zu bestätigen, die Biopsie-Tool hat durch die Gesamtheit der Hinterpfote geschnitten. Entfernen Sie vorsichtig die Biopsie-Tool aus dem Fuß und Auswerfen der Gewebe in sterile 2 ml Röhrchen mit Deckel, mit 1 ml 4% PFA / 5% PA-Lösung. </li><li> Limb Bone (ex. Femur) Machen Sie einen seitlichen Einschnitt entlang des Rückens des Tieres auf der Ebene des Beckens, weiterhin entlang beider Hintergliedmaßen. Cut in das Becken und die umliegenden Muskeln zu den Oberschenkelknochen aus dem Becken getrennt und gleichzeitig den proximalen Kopf des Oberschenkelknochens intakt. Cut in die Tibia / Fibula zum Verlassen des distalen Kopf intakt, das Entfernen der umgebenden Muskulatur / Periost vom Knochen Welle. Legen Sie die Oberschenkel in ein 2 ml Röhrchen mit 1 ml 4% PFA /5% PA-Lösung. </li><li> Post-fix die Gewebeproben in 4% PFA / 5% PA-Lösung, mit sanftem Mischen auf einer Wippe für 16-18 h bei 4 ° C </li><li> Entkalken des Gewebes wie folgt: Für plantar Stempel (die kleinen Knochen des Fußes entkalken) Ort der Gewebestanze in ein steriles 2 ml Röhrchen mit Deckel, mit 1,5 ml 10% EDTA-Lösung in 0,1 M PB mit 0,07% Glycerin und 15 % Saccharose. Das Rohr auf einer Wippe mit einem milden Mischung für 16-18 h bei 4 ° C. Für Extremitätenknochen Ort des Gewebes in einer sterilen 2 ml Röhrchen mit Deckel, mit 1,5 ml 10% EDTA-Lösung in 0,1 M PB mit 0,07% Glycerin und 15% Saccharose. Das Rohr auf einer Wippe mit einem milden Mischung für 6-7 Tage bei 4 ° C. Die Entkalkung Lösung sollte alle 24 Stunden und das Gewebe für den Verlust an Steifigkeit mit einer Pinzette überwacht geändert werden. </li><li> Übertragen Sie die Gewebe in ein steriles 2 ml Röhrchen mit Kappe mit 1,5 ml Gefrierschutzmittel-Lösung (30% Saccharose in 0,1 M PB), und legen Sie das Rohr auf einer Wippe wit mild Mischen für 16-18 h bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Gewebe zum Schneiden: Ort ein Bett Volumen der optimalen Schneiden Temperatur (OCT)-Verbindung (Sakura Finetek USA Inc.) auf einem Kryostat Gewebe Befestigungsblock und lassen Sie in den Kryostaten Kammer einfrieren (in der Regel bei -20 ° C gehalten). Ein Kryo-Aerosol (Cyto-freeze, Control Co. USA) können auch auf der OCT besprüht werden, um das Einfrieren zu beschleunigen. Legen Sie Gewebeprobe auf diesem Bett von OCT und decken mit einer zusätzlichen dünnen Schicht von Oktober Gently Spray diesem OCT mit kryogenen Aerosol, bis es ausgehärtet ist und das Gewebe innerhalb eingefroren. Legen Probe auf den Schneidkopf in den Kryostaten und lassen Sie die Gewebeprobe Block zum Schneiden temperieren - mindestens 1 Stunde. Der Versuch, Abschnitt, wenn die Einbettmasse noch zu kalt Ergebnisse in spröden Abschnitte und Gewebeschäden. </li><li> Sobald das Gewebe hat eine optimale Schnittleistung Temperatur erreicht hat, beginnen Schneiden der Probe und erzeugen 40 um Abschnitte. </li><li&gt; Für plantar punch sammeln die Gefrierschnitte in 12-well-Zellkulturplatten mit 0,1 M PB mit 10 mM Natriumazid. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte in dieser Lösung bleiben bei 4 ° C getaucht Die Abschnitte können auf diese Weise gespeichert werden für bis zu 4-6 Monaten für Immunfärbung Zwecke. Alternativ können frei schwebende Abschnitte auf unbestimmte Zeit in Gefrierschutzmittel Lösung bei -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g Saccharose, 10 g PVP40, 300 ml Ethylenglykol) gespeichert werden. Passen Endvolumen von 1L mit destilliertem Wasser) 3. Für Extremitätenknochen sammeln die Gefrierschnitte direkt auf Gelatine pre-beschichtete Objektträger (oder Superfrost Plus-Objektträger, Fisher Scientific) und an der Luft trocknen lassen für 1 h, vor der Lagerung bei -20 ° C. Knochen-Abschnitte auf Folien auf diese Weise gespeichert werden können für die Immunfärbung Zwecke innerhalb von 2-3 Monaten eingesetzt werden. </li></ol> 3. Immunfärbung von Gewebeschnitten für die sensorischen Nervenfasern 3.1. Plantar PunschAbschnitte - schwimmende Abschnitt Färbung <ol><li> Mit einer Rasierklinge geschnitten 6-7 mm vom Ende einer 1 ml Mikropipette Spitze. Voraussetzung der Innenseite der Spitze durch die Entnahme von 1% fötalem Rinderserum (FBS) in 0,1 M PB mehrmals (dies verhindert ein Verkleben der Gewebeschnitte an den Wänden der Spitze). Transfer-plantar punch Abschnitte zu einer 24-Well-Gewebekulturplatten gefärbt werden. Normalerweise 8-10 Abschnitte sollten je gut gefärbt werden, um sicherzustellen, mehrere hochwertige Abschnitte pro Immunfärbung generiert werden. </li><li> Wash plantar punch Abschnitte mit 500 ul 0,1 M PB pro Vertiefung für 5 min unter kräftigem Mischen auf einer Wippe bei RT. Wiederholen Sie 2 weitere Male. </li><li> Entsorgen Sie die Wasch-Lösung, Inkubation der plantaren punch Abschnitte in Blocking-Lösung, bestehend aus 10% Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB (500 ul der Blocking-Lösung pro Well), mit leichtem Rühren auf einer Wippe für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Entsorgen Sie die Blocking-Lösung und Inkubation der Gewebeschnitte in Primär-Antikörperndy / Antikörper in 250 ul Blockierungslösung für 18-24 h mit leichtem Rühren auf einer Wippe verdünnt bei 4 ° C. Basierend auf Ermittlers experimentellen Anforderungen, single Immunomarkierung (mit einem primären Antikörper gegen ein bestimmtes Protein oder Nervenfaser Marker), oder doppelklicken Immunomarkierung (mit zwei primären Antikörper gegen zwei Proteine ​​oder Nervenfaser Marker) können auf dem gleichen Abschnitt durchgeführt werden. Während der Durchführung Doppel Immunomarkierung ist es wichtig zu überprüfen, ob die beiden primären Antikörper verwendet in verschiedenen Host-Arten erhoben werden (z. B. eine erhöhte in Maus und einem in Kaninchen angehoben), oder alternativ, gereinigte monoklonale Antikörper verschiedener Immunglobulin G (IgG)-Isotypen (zB ein IgG1 und ein IgG2a) verwendet werden kann. Es ist ratsam, die Platte mit Parafilm Siegel für Nacht Inkubationen eine zu starke Verdunstung zu vermeiden. Um die peripheren sensorischen Nervenfasern färben, können mehrere spezifische Antikörper eingesetzt werden. Antikörper gegen das Protein Neurofilament 200 (NF200, Sigma) Label large-Durchmesser Fasern, während Calcitonin gene-related peptide (CGRP; Sigma) und transient receptor potential Vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) Label peptiderge, mit kleinem Durchmesser peripheren sensorischen Fasern. Alle peripheren Nervenfasern können auch mit Antikörpern gegen β3-Tubulin gefärbt werden. In der Haut ist Kollagen IV (Abcam) verwendet werden, um die Basalmembran, dass die Epidermis trennt sich von der Dermis abzugrenzen. Als allgemeine Regel gilt, müssen Antikörper gegen 5-10 mal stärker konzentriert als bei kultivierten Zellen basierende Immunfluoreszenz-Assays, in der Regel bei einem Arbeitsessen Konzentration von 5-10 g / ml sein. </li><li> Waschen Sie die Gewebeschnitte mit 500 ul Blockierungslösung (mit Triton X-100) pro Vertiefung für 5 min unter kräftigem Mischen auf einer Wippe bei RT. Wiederholen Sie 3 mal. </li><li> Entsorgen Sie die Wasch-Lösung, Inkubation Gewebeschnitten in geeigneter Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (in der Regel verdünnt 1:1000 in Blocking-Lösung, 500 ul) unter leichtem Mischen auf einer Wippe bei 4 ° C. Die Platte must in Alufolie zu vermeiden Bleichen von Fluorophoren gewickelt werden. </li><li> Waschen Sie die Gewebeschnitte mit 500 ul Blockierungslösung pro Vertiefung für 10 min unter kräftigem Mischen auf einer Wippe bei RT. Dann mit 500 ul 0,1 M PB abwaschen mit kräftigem Mischen für 10 min bei RT. Schließlich mit 500 ul 0,05 M PB abwaschen mit kräftigem Mischen für 10 min bei RT. </li><li> Mit einer 1 ml-Mikropipette mit einem FBS-behandelten Spitze (Schnitt 6-7 mm vom Ende), absaugen Abschnitte aus dem Gewebekulturplatte und Übertragung auf SuperFrost Plus-Objektträgern. Ordnen Sie die Abschnitte und absorbieren überschüssiges Waschpuffer mit einem feinen Pinsel. Vermeiden Sie längeren Belichtung. Inkubieren Sie die Objektträger bei RT, um zu ermöglichen Abschnitte Abschnitte auf Folie (5-30 min) trocknen lassen. </li><li> Einige Tropfen Eindeckmedium (ProLongGold, Vectashield oder ähnliches), langsam statt einem Deckglas auf Abschnitte. Lassen Sie die Folien in der Dunkelheit 5 min stehen lassen, und dann Deckglasränder Kanten mit transparentem Nagelpolieren. Lassen Lufttrocknung für 15-20 min. Die Folien können nun visualisiert werden oder bei -20 ° C für mehrere Jahre ohne nennenswerten Verlust der Fluoreszenz. </li></ol> 3.2. Limb Knochenteile - on-Anfärbung <ol><li> Lassen Sie die Dias auf RT von -20 ° C Lagerung zurück. Mit einem hydrophobe Barriere Stift (Super Pap Flüssiges Blocking Pen, Ted Pella Inc.) umschreiben die Region auf der Folie mit dem Knochen Abschnitte mit einer großzügigen Schicht-Lösung gefärbt werden. Lassen Sie die Luft für 10-15 Minuten trocknen lassen. </li><li> Waschen Sie die Knochenteile mit 250 ul 0,1 M PB pro Objektträger für 5 min und wiederholen Sie für 2 weitere Male. </li><li> Entsorgen Sie die Wasch-Lösung, Inkubation der Knochen Abschnitte in Blocking-Lösung, bestehend aus 10% Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB (250 ul der Blockierungslösung pro Folie) für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Entsorgen Sie die Blocking-Lösung und Inkubation der Knochen Abschnitte in Primärantikörper (oder eine Kombination von Primär-Antikörper, für den Fallder doppelten Immunomarkierung wie unter 3.1.4 erwähnt) in 250 ul Blockierungslösung für 18-24 h bei 4 ° C verdünnt Es ist sehr wichtig zu beachten, dass die Folien in einer feuchten Kammer mit einem abgedichteten Deckel gestellt werden muss, um ein Austrocknen zu verhindern primärer Antikörper-Lösung. Um die peripheren sensorischen Nervenfasern Fleck, den oben genannten Satz von Antikörpern (siehe Abschnitt 3.1.4) kann mit ähnlichen Arbeiten Konzentrationen verwendet werden. </li><li> Waschen Sie die Gewebeschnitte mit 250 ul Blockierungslösung (mit Triton X-100) pro Objektträger für 15 min bei RT und wiederholen Sie für 3 weitere Male. </li><li> Entsorgen Sie die Wasch-Lösung, Inkubation Knochen Abschnitte in geeigneten Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (in der Regel verdünnt 1:1000 in Blocking-Lösung, 250 ul) bei 4 ° C. Die Färbung Kammer muss in Alufolie zu vermeiden Bleichen von Fluorophoren gewickelt werden. Der Einfachheit halber ist es ratsam, dunkle Färbung Kammern (z. B. Slide Inkubationswanne / box, RPI Corp) zu verwenden. </li><li> WAsche der Knochen Abschnitte mit 250 ul Blockierungslösung pro Objektträger für 15 min bei RT. Dann mit 500 ul 0,1 M PB gewaschen und 15 min bei RT. Schließlich mit 500 ul 0,05 M PB gewaschen und 15 min bei RT. Dip kurz in ddH 2 O zu spülen Dias und dann bei RT inkubieren, um die Knochen Abschnitte an der Luft trocknen (5-30 min) zu ermöglichen. Vermeiden Sie längeren Belichtung. </li><li> Einige Tropfen Eindeckmedium (ProLongGold oder ähnliches) und langsam statt einem Deckglas auf Abschnitte. Lassen Sie die Folien stehen in der Dunkelheit für 5 min und dann Deckglasränder Kanten mit transparentem Nagellack. Trocknen lassen für 15-20 min. Dias können bei -20 ° C für mehrere Jahre ohne Verlust der Fluoreszenz gespeichert. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse 4.1. Plantar punch Abschnitte Plantar punch Gewebeschnitten unter Epifluoreszenzmikroskop visualisiert werden, oder unter einem konfokalen Mikroskop mit 10x, 40x oder 63X Ziel. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig1.jpg" /> Abbildung 1. AD zeigen Färbung mit Kollagen IV Antikörper (grün) in Basalmembranen, an der epidermal-dermale Übergang und im Knorpel und Muskeln. Zahlreiche CGRP-(AB, rot) und NF200-positive Fasern (CD, rot) sind in der Haut von Mäusen in die plantare Region (Pfeile) verteilt. β3-Tubulin ist ein pan-neuronalen Marker (E, rot), während TRPV1-Färbung (F; rot) ist vor allem für kleine Durchmesser Fasern, die auch CGRP-positive (; Pfeilspitzen grün) beschränkt. A und C sind Epifluoreszenz Bilder mit einer 10X-Objektiv (Maßstab -500 um) genommen; B, D, E und F sind konfokale Abbildung Verbundwerkstoffe aus einem 11-image Z-Stapel bei 2 mm-Schritten unter einem 60X Objektiv (Maßstab genommen generiert bar - 50 um). 4.2. Limb Knochenteile Limb Knochengewebe Abschnitte können auch unter Epifluoreszenzmikroskop, oder unter einem konfokalen Mikroskop visualisierte mit einem 10X, 40X oder 63X Ziel. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig2.jpg" /> . Abbildung 2 zeigt Immunfärbung mit anti-CGRP (AB, rot, Pfeile), anti-NF200 (CD, rot, Pfeile), anti-β3-Tubulin (E, rot) und Anti-TRPV1 (F; rot) co-gefärbt mit anti-CGRP-Antikörper (grün; Pfeile). Diese Bilder zeigen Subtypen von sensorischen Nervenfasern während der Knochenmatrix in der schwammigen Kopfbereich Maus Femur verteilt. A und C sind Epifluoreszenz Bilder mit einer 10X-Objektiv (Maßstab -500 um) genommen; B, D, E und F sind konfokale Abbildung Verbundwerkstoffe aus einem 11-image Z-Stapel bei 2 mm-Schritten unter einem 60X Objektiv (Maßstab genommen generiert bar - 50 um).

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Keine Interessenkonflikte erklärt.

Hier haben wir die Methoden zur Vorbereitung der Haut von Mäusen und Knochengewebe Abschnitte für Immunfärbung und Erkennung von peripheren sensorischen Nervenfasern beschrieben. Die Abschnitte von plantar Stanzbiopsien produziert enthalten sowohl kahl und behaarte Haut, was bedeutet, das Protokoll über jeden Hauttyp verwendet werden kann. Diese Techniken können auch eingesetzt werden, um andere Zelltypen in diesen Geweben Flecken (z. B. Leukozyten, vaskulären Endothelzellen, glatte Muskelzellen ua) werden. Diese ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog Nr. </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> 3mm Harris Micro-Punch </td><td> Material </td><td> Ted Pella </td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td> Perfusionspumpe </td><td> Material </td><td> VWR International </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> Pikrinsäure </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> Oktober Einbettmasse </td><td> Reagens </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cyto-Freeze kryogenen Aerosol-Spray </td><td>Material </td><td> Control Company </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> Ziegenserum </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Inkubationswanne und Deckel für Immunfärbung (Large) </td><td> Material </td><td> RPI Corp </td><td> 248.270 (Fach) 248270-A (Deckel) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge hydrophobe Barriere Stift </td><td> Material </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Camel Haarbürsten (# 1 Dicke) </td><td> Material </td><td> Ted Pella </td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Long Gold-Eindeckmedium </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

tissue preparation and immunostaining of mouse sensory nerve fibers innervating skin and limb bones

Erkennung und primäre Verarbeitung von physikalischen, chemischen und thermischen Sinnesreize von peripheren sensorischen Nervenfasern ist der Schlüssel zur sinnlichen Wahrnehmung bei Tieren und Menschen. Diese peripheren sensorischen Nervenfasern ausdrücklichen eine Vielzahl von Rezeptoren und Ionenkanälen Proteine, die erkennen und initiieren spezifische Sinnesreize. Es gibt Methoden, um die elektrischen Eigenschaften der peripheren sensorischen Nervenfasern innervieren die Haut, die auch genutzt werden, um die funktionelle Expression von spezifischen Ionenkanal-Proteinen in diesen Fasern zu identifizieren können charakterisieren. Allerdings sind ähnliche elektrophysiologische Methoden nicht zur Verfügung (und sind auch schwierig zu entwickeln) für den Nachweis der funktionalen Expression von Rezeptoren und Ionenkanälen Proteine ​​in peripheren sensorischen Nervenfasern innervieren anderen inneren Organen, einschließlich der anspruchsvollsten Geweben wie Knochen. Darüber hinaus können solche elektrophysiologischen Methoden nicht genutzt werden, um die Expression von nicht-erregbaren Protein bestimmens in peripheren sensorischen Nervenfasern. Daher bietet Immunfärbung der peripheren / viszeralen Gewebeproben für die sensorische Nerven Fivers den bestmöglichen Weg, um die Expression bestimmter Proteine ​​von Interesse in dieser Nervenfasern ermitteln. Bisher haben die meisten der Proteinexpression Studien in sensorischen Neuronen genutzt Immunfärbung Verfahren in sensorischen Ganglien, wo die Informationen, um die Expression bestimmter Proteine ​​in der Zelle Körper bestimmter Arten oder Untergruppen von sensorischen Neuronen begrenzt ist. Hier berichten wir über detaillierte Methoden / Protokolle für die Herstellung von peripheren / viszeralen Gewebeproben für Immunfärbung der peripheren sensorischen Nervenfasern. Wir haben uns speziell Detail Methoden zur Herstellung von Haut-oder plantar Stanzbiopsie und Knochen (Femur) Abschnitte von Mäusen für Immunfärbung der peripheren sensorischen Nervenfasern. Diese Methoden sind nicht nur ausschlaggebend für die qualitative Bestimmung von Protein-Expression in peripheren sensorischen Neuronen, sondern auch eine quantitative Nachweisverfahren fürBestimmung von Veränderungen in der Proteinexpression Ebenen in bestimmten Arten oder Untergruppen von sensorischen Fasern, sowie für die Bestimmung der morphologischen und / oder anatomische Veränderungen in der Anzahl und Dichte der sensorischen Fasern bei verschiedenen pathologischen Zuständen. Darüber hinaus sind diese Methoden nicht auf die Färbung von nur sensorischen Nervenfasern beschränkt, sondern kann auch zur Färbung alle Arten von Nervenfasern in der Haut, Knochen und anderen viszeralen Gewebe verwendet werden.

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Immunzytochemische Identifizierung der peripheren sensorischen Nervenfasern Subtypen (und Detektion von Protein-Expression darin) sind der Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die periphere Empfindung. Hier beschreiben wir Methoden für die Herstellung von peripheren / viszeralen Gewebeproben, wie Haut-und Gliederschmerzen Knochen, für spezifische Immunfärbung der peripheren sensorischen Nervenfasern.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.0K Aufrufe.  The University of Iowa. Immunzytochemische Identifizierung der peripheren sensorischen Nervenfasern Subtypen (und Detektion von Protein-Expression darin) sind der Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die periphere Empfindung. Hier beschreiben wir Methoden für die Herstellung von peripheren / viszeralen Gewebeproben, wie Haut-und Gliederschmerzen Knochen, für spezifische Immunfärbung der peripheren sensorischen Nervenfasern.

Serie: Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of these afferent neurons are located within the sensory ganglia. Sensory ganglia innervate a specific organ or portion of the body. For instance, the dorsal root ganglia (DRG) are located in the vertebral column and extend processes throughout the body and limbs. The trigeminal ganglia are located in the skull and innervate the face, and upper airways. Vagal afferents of the nodose ganglia extend throughout the gut, heart, and lungs. The nodose neurons control a diverse array of functions such as: respiratory rate, airway irritation, and cough reflexes. Thus, to understand and manipulate their function, it is critical to identify and isolate airway specific neuronal sub-populations. In the mouse, the airways are exposed to a fluorescent tracer dye, Fast Blue, for retrograde tracing of airway-specific nodose neurons. The nodose ganglia are dissociated and fluorescence activated cell (FAC) sorting is used to collect dye positive cells. Next, high quality ribonucleic acid (RNA) is extracted from dye positive cells for next generation sequencing. Using this method airway specific neuronal gene expression is determined.

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Eine Methode zum Ziel und Isolieren Airway-innervating sensorischen Neuronen bei Mäusen

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

Physiologische Herstellung von Haarzellen aus dem Sacculus der American Bullfrog (<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...