This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Entsprechenden nationalen und institutionellen Ethik sollte vor der Durchführung von Tierversuchen gewonnen werden. 1. Entfernung von EDL Muskel und Nerv <ol><li> Wiegen und tief betäuben einen erwachsenen Maus mit inhalativen Isofluoran mit einem Verdampfer mit 5% Isofluran sowie ein 1,5 l / min Sauerstoffflussrate oder eine Glasglocke mit Isofluoran getränkten Watte auf der Unterseite. </li><li> Sicherzustellen, dass die Maus tief anästhesiert, und nicht zu einem Zehenklemm reagieren. Enthaupten schnell mit großen, geschärft einer Schere oder einem Guillotine. </li><li> Machen Sie eine ventralen Mittellinie Schnitt durch die Rippen mit einer Schere entfernen und die inneren Organe. </li><li> Die Haut des Tieres durch Greifen die Haut vom Halsbereich und ziehen vorbei an den Füßen. </li><li> Entfernen Sie die Beine, indem über den Hüften und legen Sie die Beine Haut in eine Schüssel mit kaltem (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% CO 2) geringe Kalzium Hoch Magnesiumbicarbonat Kochsalzlösung contaiNing in mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0,85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, und 10 Glucose (pH 7,4 ± 0,05) 16. Der niedrige Kalzium Hochmagnesiumlösung hemmt die synaptische Übertragung während der Präparation. </li><li> Legen Sie die Beine dorsale Seite nach oben in die Schüssel und stecken Sie die Beine und Hüften nach unten mit Nadeln oder Insekten Pins, so dass die Knie-und Knöchelgelenke im 90 ° Winkel sind. Legen Sie einen Stift an jedem Ende der Füße und auf jeder der vorderen und hinteren Oberschenkel einen Stift, um das Gewebe an Ort und Stelle zu halten. </li><li> Castroviejo mit Federschere, heben Sie die obere Schicht der Muskel an den Oberschenkeln und eine Mittellinie geschnitten, um den Ischiasnerv direkt unter aussetzen. Der Ischiasnerv ist knapp unter dem oberen Muskelschicht gelegen und verläuft oberhalb des Oberschenkelknochens aus seiner Ausfahrt in der Nähe von den Hüften bis es Niederlassungen in den gemeinsamen Wadenbein und Schienbeinnerv kurz vor dem Kniegelenk. </li><li> Entfernen Sie den Muskel über dem Ischiasnerv, bis die point, bei dem die tiefen Wadenbeinnerv Zweig taucht in das flexor hallucis longus (FHL) Muskel ist sichtbar. </li><li> Mit # 55 Pinzetten, sezieren das Bindegewebe rund um den Wadenbein Zweig, um ihn von den gastrocnemius und soleus Muskeln, die an der medialen Seite der Tibia sind kostenlos. Schneiden Sie die Sehnen der gastrocnemius und soleus Muskeln und sorgfältig entfernen Sie sie aus unter dem Nerv. </li><li> Entfernen Sie die oberflächliche Muskel auf der lateralen Seite des Schienbeins zu drei verschiedene Sehnenbündel am Sprunggelenk-von medial nach lateral aussetzen: FHL, EDS und tibialis anterior (TA), wobei der EDS unterhalb der TA verborgen. </li><li> Schneiden Sie die TA Sehne am Sprunggelenk, heben Sie die TA oben und weg von der EDL, und schneiden Sie den Muskel in der Nähe der Knie, um sie zu entfernen. </li><li> Schneiden Sie den FHL-Sehne am Knöchel und heben Sie sie zurück, um den Bereich, wo der Nerv in den FHL erreichen. Schneiden Sie direkt unter diesem Punkt und entfernen ~ 2/3 der FHL Muskel. </li><li> Schneiden Sie den Ischiasnerv so nahe dem Hüftgelenk als poslich und schonend entfernen alles Nervenäste mit Ausnahme der tiefen Wadenbein Zweig. </li><li> Schneiden Sie die EDL Sehnen an beiden Knöchel-und Kniegelenke mit großen Feder Schere. </li><li> Mit einer scharfen Schere, entfernen Sie die EDL, die verbleibende FHL und Nerven aus dem umgebenden Gewebe durch einen Schnitt durch die Tibia Knochen im Knie und in der Mitte des Oberschenkels. Schneiden Sie die verbleibende Tibiaknochen, so dass nur die EDL, ein Teil der FHL und Nerven bleiben. </li></ol> 2. Montage der EDL Muskel und Nerv in das Gewebe Bath (Abbildung 1A) <ol><li> Vor Beginn des Experiments vorbereitet Gewebebad. Ständig durchströmen das Bad mit Sauerstoff angereichertem (100% O 2) synthetische interstitiellen Flüssigkeit (SIF), die (in mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1,7 NaH 2 PO 4, 2,0 CaCl 2, NaCl 9,5 6 H 11 O ( Natriumgluconat), 5.5 Glucose, 7.5 Saccharose und 10 N-2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2 ethanesulfonic Säure (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Eine Fließgeschwindigkeit von 15-30 ml / min empfohlen. Gezeigt ist ein im Handel erhält Bad von 25 ml Kapazität mit zwei an der Unterseite der Wanne, brachten Gewebe Pfosten und einer Halterung für eine Kraft und Längenregler (ungefähre Abmessungen Badewanne befestigt stimulierenden Elektroden 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; Spezifikationen siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung). </li><li> Verwenden Sie die restlichen FHL Gewebe, um das isolierte Muskelnerv behandeln und legen Sie sie in das Gewebe Badewanne. Legen Sie ein kleines Stück Sylgard auf der Unterseite der Schale und verwenden Sie ein Insektenstift durch die verbleibenden FHL Gewebe, um den Muskel zu stabilisieren. </li><li> Verwenden Sie 6-0 Seidenfäden, beide Sehnen binden und bringen ein Ende mit dem Gewebe Post und die andere mit dem Hebelarm der Kraft und Länge Controller (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Daten). Verwenden Sie den kleinsten Fadenlänge, die praktisch ist. Entfernen Sie die Insektenstift und Sylgard, nachdem Sie die Sehnen gebunden haben. HINWEIS: Um einfach zu erleichternVerbindung mit dem Hebelarm ein kleines Stück Draht in einen &quot;J&quot; förmigen Haken in der Hebelarm mit Epoxy gebogen und befestigt werden. Das Nahtmaterial kann dann mit dem Draht verbunden werden, anstatt in die kleine Öffnung am Hebelarm fädelt. </li><li> Machen Saugelektroden von SA 16 Glas indem Sie zuerst eine Glasmikropipette Puller (Heat = 286, Ziehen = 0, Velocity = 150, Time = 200); brechen Sie die Spitze zurück und manuell schleifen es auf einem Schleifstein, bis es zu einem 3 mm Konus. Schmelzen Sie die Spitze mit einem Mikroschmiede auf die gewünschte Innendurchmesser der Spitze von 10 - 100 um abhängig von dem Bereich der Nerven man von probieren möchte (siehe den 1B-1C für Elektrodenschaltplan und Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Produktinformationen). </li><li> Füllen Sie ein Glas vorgefertigten Saug-Elektrode mit der inneren Silberdraht mit SIF. </li><li> Absaugen des geschnittenen Endes des Nervs in der Elektrode und eine Verbindung zu dem positiven Anschluss des Differenzverstärkers. Wickeln Sie die Elektrode mit einem chlorierten SilberDraht, der mit dem negativen Port des heads verbindet. Erden Sie die SIF-Bad, indem Sie einen zweiten chlorierten Silberdraht aus dem Bad zu Boden-Port des heads ist. Auch erden Infusionsschlauch an den Faraday-Käfig an mehreren Punkten zu elektrischen Störungen über die Perfusion Pumpen eingeführt mildern. </li><li> Stimulieren die Muskeln über die auf beiden Seiten des Muskels im Gewebe Bad, ein Zucken Kontraktion induzieren montiert Elektroden. Alternativ stellen eine stimulierende Elektrode, die auf dem geschnittenen Ende des Nervs. Erhöhen Sie die anregende Spannung, bis eine Spitzenkontraktionskraft beobachtet und dann erhöhen die Spannung um weitere 15% auf supraSpannung (0,5 ms Pulsbreite) zu erreichen. Weiterhin Twitch Kontraktionen im supramaximaler Spannung mit einer 10 sec Rest dazwischen, sondern variieren die Länge des Muskels bis zu einem Spitzenkontraktionskraft erreicht ist, um die optimale Länge (L o) des Muskels zu finden. Alle Längen Rampen und Schwingungen mit dem Muskel an diesem Leng startenth. </li><li> Damit das Muskelnerven Zubereitung in dem Bad für mindestens 1 Stunde bleiben, bevor nachfolgende Datenerfassung zu ermöglichen, das Gewebe um die Badtemperatur zu erreichen und für die normale synaptische Übertragung zu erholen folgende Zerlegung in einem niedrigen Calciumlösung. </li><li> Um die Daten an einem anderen als Raumtemperatur Temperatur zu sammeln, legen Sie einen Temperaturfühler in das Gewebe Bad in der Nähe des Muskels. Langsam bringen das Bad auf Temperatur durch Pumpen erwärmte Wasser durch das Gewebe Bad Bodenplatte. Wickeln Ton mikrowellen Heizkissen um die SIF Reservoir zu helfen, eine gleichbleibende Temperatur. </li></ol> 3. Datensammlung <ol><li> Um eine afferente als afferenten identifizieren, notieren Sie die neuronale Aktivität während der wiederholten Kontraktionen Zucken von einem 0,5 ms supraSpannungsReiz produziert geliefert einmal pro Sekunde. HINWEIS: Muskelspindel-Afferenzen sollten während der Kontraktion Zucken 18,19 (Abbildung 2) zu unterbrechen. </li><li> Verwenden data Erfassungssoftware zu Längenänderungen bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten und zu unterschiedlichen Längen gelten. Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Skript, um diese Aufgabe zu automatisieren (siehe Zusatzinformationen für einen Screenshot des Skripts und Anweisungen, wie man die Strecken gegeben anpassen). Anlegerampen-Halte-Abschnitte von 4 Sekunden bei Dehnungslängen von 2,5%, 5% und 7,5% L o und Dehnungsgeschwindigkeiten von 20, 40 oder 60% L o / s 15. HINWEIS: Siehe Bedienungsanleitung für spezifische Kraft und Länge Controller für notwendig Spannungs-Millimeter-Umrechnungsfaktor. </li><li> Am Ende des Experiments bestimmen Muskel Gesundheit bei 24 ° C mit maximalen isometrischen tetanischen Kontraktionen (500 ms Zug, Zug 120 Hz-Frequenz, 0,5 ms Pulsbreite, supraSpannung). Vergleichen Sie die Spitzenkontraktionskraft zu früher berichteten Werten (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Das Ziel dieses Artikels war es, ein Verfahren zur Aufzeichnung von Muskelspindel-Afferenzen in einer isolierten Maus-Muskel-Nerv Zubereitung zu beschreiben. Wir haben festgestellt, dass der Maus Spindel Afferenzen reagieren ähnlich wie die von Ratten, Katzen und Menschen 15 zu dehnen, und anderen Laboratorien haben Mäuse als Modellorganismen verwendet, um sensorische Neuronen sowohl im Muskel-und Haut in vitro-Studie (zB 3,13) . Muskel sensorischen afferenten für mindestens 6-8 Stunden bei jeweils 24 ° C und 34 ° C aufgezeichnet. Zur Minimierung der Handhabung der EDL und Nerven, verwenden Sie den verbleibenden Teil der FHL, um das Gewebe zu behandeln, wenn möglich. Nach der Präparation, warten Sie mindestens 1 Stunde bis Datensammlung zu starten, damit das Gewebe, um zu baden und Temperatur für den normalen synaptischen Übertragung ins Gleichgewicht zu erholen. Zuvor war Muskel Gesundheit auf einer Untergruppe von Muskeln in dieser Zubereitung durch Bestimmen, dass der maximale tetanische Gegen verifiziertctile Kraft durch die Muskeln erzeugt wird, ist ähnlich derjenigen von anderen am Anfang und am Ende des Experiments 15 gemeldet. Muskelspindel Afferenzen wurden funktionell in dieser Zubereitung durch die Suche nach einer charakteristischen Pause beim Brennen entsprechend der Kontraktion twitch (Abbildung 2) sowie die erwarteten Momentanfrequenz erhöht sich in Abhängigkeit von Änderungen Länge (Figur 3) identifiziert. Nach unserer Erfahrung die meisten Afferenzen, die in Kontrollbedingungen Fire Muskelspindel-Afferenzen. Die Länge der in dieser Zubereitung (~ 7 mm maximal) beibehalten Nerven ist nicht lang genug, um Unterschiede afferenten Leitungsgeschwindigkeit verwenden, um Muskel afferenten Subtypen 13 zu identifizieren. Zusätzlich, anders als bei Katzen und Menschen, Maßnahmen der dynamischen Empfindlichkeit nicht in der Lage, klar zu unterscheiden Gruppe Ia und II Afferenzen in Mäusen (für eine weitere Diskussion siehe Wilkinson et al. 15). Andere Subtypen von Afferenzen (dh., Gruppe III und IV) können mit zusätzlichen funktionellen Tests in dieser Zubereitung identifiziert werden, beispielsweise durch Zugabe von Substanzen wie Capsaicin, ATP oder Bradykinin, abnehm Bad-pH, Aussetzen der Muskel Ischämie usw. 3,13,21-23 Verwendung Saugelektroden können die Aktivität von mehreren sensorischen Neuronen auf einmal aufgezeichnet werden kann, was die Menge der Daten, die von einer einzelnen Muskel gesammelt werden kann, erhöht. Diese Vorbereitung kann verwendet werden, um die Gesamtwirkung einer Störung der sensorischen Neuronenpopulation Antworten oder die Antworten der identifizierten Afferenzen messen werden. Wenn die Spitze Formen sind einzigartig genug ist, können bis zu 4 sensorischen Neuronen durch Software unterschieden werden (beide Spike2 (Cambridge Electronic Design) und LabChart Pro (AD Instruments) haben ähnlich durchgeführt). In Fällen, bei denen Neuronen nicht unterschieden werden, können Änderungen in der Elektrodenanordnung oder Spitzendurchmesser leicht implementiert werden. Zusammenfassend ist die Maus Muskel-Nerv in vitro preparation ist eine einfache experimentelle Ansatz, der verwendet werden kann, um die Reaktionseigenschaften des Muskels sensorischen afferenten verschiedenen physikalisch-chemischen Störungen, Verletzungen und Krankheitsmodellen untersucht werden. Zusätzlich wird dieses Präparat ideal geeignet, um die Vorteile der leistungsfähigen genetischen Werkzeuge zur Verfügung, bei Mäusen, einschließlich der transgenen Tiere und optogenetischen Werkzeugen zu nehmen.

Skelettmuskeln werden von sensorischen Neuronen, die das zentrale Nervensystem mit wichtigen Informationen über den Muskel-Umgebung bieten innerviert. Muskelspindeln sind hochspezialisierte eingekapselten Strukturen intrafusale Muskelfasern, die parallel extrafusalen Muskelfasern zusammengesetzt sind. Spindeln von Gruppe Ia und II Afferenzen, die Veränderungen in der Muskellänge und intrafusalen Faser Ton wird dynamisch durch innervier Gamma-Motoneuronen 1 geregelt kodieren innerviert. Gruppe Ib Afferenzen zwischen Muskelfasern und die Sehnenansätze angeordnet und sind empfindlich gegenüber Veränderungen der Muskelkraft, beispielsweise während der Muskelkontraktion 2. Die Gruppe Ia, Ib und II Afferenzen bieten propriozeptiven Rückmeldungen, die in den entsprechenden Motorsteuerung unterstützt. Weitere Populationen von Muskel Afferenzen in der gesamten Muskel befindet (Gruppe III und IV) dienen Metabolit Aufbau, das Vorhandensein von nozizeptiven Reize und Muskeltemperatursignal <sup&gt; 3. Dieser Muskel sensorische Informationen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase, verhindert Muskelschäden und Regel Bewegung. Muskel Afferenzen können ihre Feuermuster, basierend auf früheren Erfahrungen 4 zu ändern. Aktivierung von Nozizeptoren können auf die Induktion von chronischen Schmerzzuständen und 5 abweichende Signalisierung von der Muskel Propriozeptoren führen kann, um Probleme mit dem Gleichgewicht oder Bewegungs 6 führen. Wir verwenden eine isolierte Muskelnerv in vitro Vorbereitung, um die Reaktion des Muskels sensorischen Neuronen Rezeptor Endungen von erwachsenen Mäusen beider Geschlechter zu studieren (abgebildet sind Antworten 2-4 Monate alten C57BL / 6 Mäuse). Die Maus ist das Modell genetische Spezies für Studien bei Säugetieren. Diese Vorbereitung erfordert die Isolierung des tiefen Wadenbein Zweig der Ischiasnerv und dem extensor digitorum longus (EDL) Muskels, ein schnell zuckenden Muskel der Peronealgruppe im lateralen Teil des Unterschenkels gefunden. Die EDL wird oft verwendet, um die Muskelkontraktionseigenschaften 7-9 zu studieren, hat tendons, die einfach sind, zu isolieren und ist klein genug, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung Diffusions in Ruhe und mit vernünftigen Kontraktion Arbeitszyklen 10 zu ermöglichen. Andere Muskeln in diesem Bereich (beispielsweise soleus und tibialis anterior) von ähnlicher Größe sind und diese Zubereitung kann leicht modifiziert werden, um von Afferenzen dieser Muskeln aufzunehmen. Eine Saugelektrode auf das Schnittende des Nervs zu Muskel sensorischen afferenten Brenn aufnehmen platziert. Einzelnen Neuronen identifiziert und basierend auf ihrer Spitzenform mit Spitze Sortiersoftware analysiert. Stimulationselektroden in der Badewanne oder auf den Nerv kann verwendet werden, um die Muskelkontraktion hervorzurufen. Muskellänge und Kraft gesteuert und gemessen unter Verwendung von kommerziell verfügbaren Systemen werden. Ähnliche In-vitro-Präparate haben in Nagetieren verwendet worden, um der Gruppe III und IV Muskel Afferenzen bei der Ratte, Gruppe Ia und II Spindel Afferenzen in der Ratte vierten Zehe Lumbrikalmuskel Muskel 12 und Gruppe III und IV Muskel Afferenzen in t studieren EDL 11er Maus Fußsohlenmuskel 13. Ein in vitro-System hat die Vorteile der pharmakologischen Zugänglichkeit und direkte Steuerung des Perfusat und physikochemischen Größen wie Temperatur und pH-Wert. Ein in vitro-Ansatz eliminiert das Potenzial in vivo verwechselt der Anästhesie-und Muskeldurchblutung Status. Während die Muskelnerven Herstellung ermöglicht die Untersuchung der direkten Reaktion einer Störung auf den Afferenzen, die Fähigkeit zur Modulation der Gamma efferenten Spindel Empfindlichkeit und anderen integrierten Antworten Studie, die mit in vivo-oder ex vivo-14 3 Zubereitungen als geopfert möglich ist keine neuronale Zellkörper in dieser Zubereitung. Dieses Präparat wurde früher verwendet, um die Reaktion der Maus Muskelspindel-Afferenzen zu einer Batterie von Rampe zu charakterisieren und zu halten Dehnungen und Schwingungen und es wurde festgestellt, dass die Maus afferenten Responses waren ähnlich denen in anderen Spezies, wie Ratten, Katzen und Menschen berichtet. Maus afferenten Reaktionen gefunden wurden ähnlich sowohl 24 ° C und 34 ° C Badtemperatur zu sein, obwohl bei 34 ° C absolut Feuerraten schneller waren und die Afferenzen waren in der Lage, schneller zu reagieren Länge ändert 15. Wir beschreiben im Folgenden, wie diese Vorbereitung kann verwendet werden, zu identifizieren und zu untersuchen die Muskelspindel-Afferenzen werden. Darüber hinaus kann diese Herstellung leicht modifiziert werden, um die Reaktion der anderen Muskel afferenten Subtypen 13 zu untersuchen, um die Eigenschaften der sensorischen afferenten in Reaktion auf ein Medikament oder einen Krankheitszustand oder verschiedene andere Variablen (zB Alter, Geschlecht, Gen-Knockout) zu vergleichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muskel sensorischen Neuronen innervieren Muskelspindeln und Golgi-Sehnenorgane kodieren Länge und Kraftänderungen wesentlich, Propriozeption. Zusätzliche Afferenzen überwachen andere Eigenschaften der Muskelumgebung, einschließlich Metaboliten Aufbau, der Temperatur und nozizeptiven Reize. Insgesamt kann abnormale Aktivierung von sensorischen Neuronen von Bewegungsstörungen oder chronischen Schmerzsyndromen führen. Wir beschreiben die Isolierung des extensor digitorum longus (EDL) Muskel-und Nerven für in-vitro-Studie von Dehnungs-evozierte zuführenden Reaktionen in der erwachsenen Maus. Sensorischen Aktivität von Nerven mit einem Saug-Elektrode erfasst und einzelnen Afferenzen kann mit Spike-Sortiersoftware analysiert werden. In-vitro-Präparate erlauben eine gut kontrollierte Studien zur sensorischen Afferenzen ohne die möglichen verwechselt der Anästhesie oder verändert Muskeldurchblutung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu identifizieren und testen Sie die Reaktion der Muskelspindel-Afferenzen zu strecken. Wichtig ist,diese Vorbereitung unterstützt auch die Studie von anderen Subtypen der Muskel Afferenzen, Antworteigenschaften nach der Arzneimittelanwendung und den Einbau von leistungsfähigen genetischen Ansätzen und Krankheitsmodellen in Mäusen.

Die Reaktion des Muskels Afferenzen kann nach einer Vielzahl von Störungen aufgezeichnet werden, je nachdem, welche afferenten Subtyp untersucht wird. Vertreter Reaktionen der Muskelspindel-Afferenzen die Muskelkontraktion und Rampe und halten Strecke werden hier gezeigt. Um eine afferente als afferenten identifizieren twitch Kontraktionen werden einmal pro Sekunde (0,5 ms Pulsbreite), um zu sehen, ob es eine Pause in der Brenn während der Kontraktion 18,19 gegeben. Figur 2 zeigt eine repräsentative Spur von neuronaler Aktivität und Muskelspannung während diese zuckenden Kontraktionen. Kein neuronale Aktivität während zucken Kontraktionen beobachtet, wie für Spindel Afferenzen erwartet. Wenn die aufgezeichnete afferenten eine Gruppe Ib Golgi-Sehnen-Organ afferenten eine Erhöhung Feuerrate während der Kontraktion zu erwarten. Unter Kontrollbedingungen meisten Afferenzen mit einem regelmäßigen Muster Brenn (~ 12 Impulse / s bei 24 ° C und ~ 32 Impulse / s bei 34 ° C) Sind Muskelspindel-Afferenzen. Eine Untergruppe der Spindel Afferenzen wird nur Feuer während Strecke (in der Hand ~ 11% der Spindel Afferenzen) 15. 3A zeigt eine repräsentative rohen Spur von zwei Muskelspindel-Afferenzen der Reaktion auf eine Rampe und halten Strecke durch die Kraft und Länge Controller erzeugt. Der Spike Histogramm Merkmal LabChart wird verwendet, um zu identifizieren und zu analysieren, die momentane Feuerfrequenz der beiden einzelnen Neuronen getrennt (3B-3C). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Isolierte Muskel-Präparat A) Die extensor digitorum longus (EDL) und innervierIschiasNerv in einem isolierten Gewebe Bad mit sauerstoff synthetischen interstitiellen Flüssigkeit (SIF) durchströmt montiert. Eine extrazelluläre Verstärker auf einen sucti verbundenauf der Elektrode zeichnet neuronalen Aktivität. Ein Dual-Kraft und Länge Controller-mit der entsprechenden Software-Kontrollen und Maßnahmen Muskelkraft und Länge. Die Gewebe Bad Elektroden liefern Reize zu erzeugen zucken oder tetanische Kontraktionen. Pumpen erwärmte Wasser durch interne Bad Plattenkanäle steuert die Gewebetemperatur Bad. B) gezogen Glaselektrode mit Saug ~ 3 mm verjüngten Spitze. C) Vergrößerte Darstellung der idealen Form der Spitze für die Absaugung Elektrode, die mit einem Mikroschmiede produziert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. afferenten entsprechend der Kontraktion zucken. Neuronale activity (obere Kurve) und die Muskelspannung (untere Kurve) von 30 zucken Kontraktionen sind mit überlappenden oberen Spur in schwarz überlagert. Afferenten Aktivität Pausen während der Kontraktion-induzierte Spannungserhöhung, die eine charakteristische Antwort von Muskelspindel-Afferenzen ist. Klammer und Pfeil über der oberen Spur bezeichnen die Zeit während der Kontraktion, wenn die Aktivität angehalten wird. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3. afferenten Antwort während einer Rampe Rampe und Halten Stretch A) Raw neuronale Aktivität von zwei Afferenzen (obere Kurve) und halten strecken, um die EDL (untere Kurve in gezeigt Muskellänge). B) Sofortfeuerfrequenz (Inst angewendet. Fr., Impulse pro Sekunde) der Einheit zeigt Aktivität bei L o von A (in blau dargestellt). C) InstantanéOrganisationseinheiten Schussfrequenz der kleineren Einheit, die nur Brände während der Strecke (in orange dargestellt). Beide Geräte zeigen die Spitze Frequenzanpassung beim Streck, die charakteristisch für Muskelspindel-Afferenzen 1 ist.

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muskel sensorischen Neuronen sind in proprioceptor Signalübertragung beteiligt und auch auf Stoffwechselzustand und Verletzungen bezogene Ereignisse zu berichten. Wir beschreiben einen erwachsenen Maus in vitro Muskel-Nerven Vorbereitung für Studien über Stretch-aktivierte Muskel Afferenzen.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.8K Aufrufe.  San José State University.  Muskel sensorischen Neuronen sind in proprioceptor Signalübertragung beteiligt und auch auf Stoffwechselzustand und Verletzungen bezogene Ereignisse zu berichten. Wir beschreiben einen erwachsenen Maus in vitro Muskel-Nerven Vorbereitung für Studien über Stretch-aktivierte Muskel Afferenzen. 

Serie: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Die Untersuchung der Integration von Adult-geboren Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Vorbereitung zur Auslösung und Aufzeichnung Feeding Motor Programme mit Physiologische Bewegungen in<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In-vitro- Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon afferenten Fasern in Ratten

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In-vitro- Test zur Untersuchung der Aggregation von Tau-Protein und Drogen-Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...