Die Arbeit wurde von der britischen Medical Research Council Projektförderung G0601253 GSB und RWB und einem SULSA Bioskape Zuschuss an GSB finanziert

Diese Methoden wurden in der Forschung berichtet in Banken verwendet, RW et al. 2 Mäuse wurden auf humane Weise durch Genickbruch eingeschläfert. Im Vereinigten Königreich ist dies eine gesetzlich zugelassene Anlage 1 Verfahren in den genannten Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 und der europäischen Richtlinie 2010/63 / EU. Dieses Bundesgesetz ist vor Ort an der University of Aberdeen durch den Tierschutz und ethische Review Board durchgesetzt, die alle Verfahren genehmigt haben. 1. Vorbereiten Ohren für Labeling <ol><li> Bereiten einer Standard physiologische Salzlösung, wie Liley der (1956) 5 und sättigt sie mit 90% O 2/5% CO 2 (Carbogen). Liley der Kochsalzlösung (mM): NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) und Glucose (11). HINWEIS: Für den Rest des Manuskripts &quot;Saline&quot; wird auf Kochsalzlösung beziehen, die vollständig mit Carbogen gesättigt ist. Während DISSECTIOn, aktualisieren Sie die Kochsalzlösung für den Zubereitung alle 15 - 20 min. </li><li> Menschlich eine erwachsene Maus einschläfern, ohne den Schädel zu beschädigen. Anmerkung: Wir haben C57 / Bl6J und MF1-Mäuse verwendet, aber jede Mausstamm verwendet werden kann. Der wichtigste Aspekt ist nicht groß Erwachsene zu verwenden (&gt; 25 g). Beschriften in größeren Mäuse weniger zuverlässig, oft zu kleinen und verstreuten Gruppen von Follikeln beschränkt werden. </li><li> Entfernen Sie die äußeren Ohren (Ohrmuschel) in der Nähe der Basis mit ~ 25 cm Schere, gerade über dem dichten Haarlinie und versenken in Kochsalzlösung in einem Silikon-Gummi ausgekleidete Kultur / Petrischale (50 mm ist in der Regel bequem). </li><li> Positionieren Sie die Ohrmuschel vorderen (konkaven) Seite nach unten und stecken Sie die Ränder auf dem Silikon in regelmäßigen Abständen mit feinen Insektenstifte (~ 6 - 8 pro Ohr, ~ 0,2 mm Durchmesser Pins). Aktualisieren Salz jede 15 bis 20 Minuten, oder verwenden Sie eine ständig durchbluteten Bad. </li><li> schälen Sie vorsichtig die hintere Haut von der vorderen Haut durch stumpfe Dissektion entfernt, zunächst von der Schnitt Basis der Ohrmuschel Zugriff überdie dicken Mittel Knorpel und arbeiten systematisch an den dünnen, knorpelfreien Außenränder. <ol><li> Um dies zu tun, halten Sie die Mitte der Schnittkante der hinteren Haut mit einem Paar nicht. 3 Zange. Dann, mit geschlossenen Backen, legen Sie die Punkte von einem anderen Satz von Nr. 3 Zange in den Zwischenraum zwischen der Haut und dem darunterliegenden Knorpel. </li><li> Vorsichtig arbeiten, die Punkte der geschlossenen Zange von Seite zu Seite innerhalb der Lücke, die minimal erforderliche Kraft verwenden, sorgfältig Verwachsungen zu lösen, während Peeling die hintere Haut zurück, um die Schichten zu trennen. </li></ol></li><li> Mit der hintere Haut entfernt, lassen Sie die vordere Haut in Position. Pin der posterioren Haut, Hautseite nach oben, neben der vorderen Haut (nach 1,5, oben). </li><li> Als nächstes sorgfältig und vollständig die Ohrmuschel Knorpel entfernen, die zwischen den Hautschichten von der vorderen Haut durch die gleiche stumpfe Dissektionstechnik wie in 1.6 eingeklemmt wurde. Vermeiden Sie Einstichlöcher mit der Zange. </li><li> Dann foder beide Ohrmuschel Hautpräparate sanft schälen, zupfen und reiben Sie die dünne Schicht aus Bindegewebe, ähnlich expandiertem Polystyrolschaum, die die Haarfollikel Basen deckt weg. HINWEIS: Um eine optimale Clearing Beschaffung ein wenig Übung nehmen können; unzureichende Gewebeentfernung behindert den Zugang sowohl für die Farbstofflösung und für die Bildgebung, während zu stark Abschaben der neuronalen Netze entfernt, die an der Basis der Follikel sind. </li><li> Aktualisieren Sie die Kochsalzlösung. </li></ol> 2. Lanceolate Klemmenbeschriftung HINWEIS: Das folgende Protokoll für Styrylpyridinium- Farbstoff optimiert ist. Andere, chemisch ähnlich, Styrylpyridinium- Farbstoffe sollten arbeiten, vielleicht nach einer gewissen Einstellung der Konzentration und Inkubationszeit. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel, wenn Farbstofflösungen Handhabung. Entweder kaufen 10 mM Stammfarbstofflösung direkt vom Hersteller oder Lager herzustellen, indem man die Farbstoffpulver in Kochsalzlösung auflöst, ohne Glukose. Aliquot (10 &amp; mgr; l ist in der Regel bequem, aber passen diese für große scale Experimente) und Lagerung tiefgefroren für bis zu 6 Monate bei -20 ° C oder ~ 1 Jahr bei -80 ° C. Pulver wird für mindestens 2 Jahre gespeichert werden. Vermeiden Sie wiederholte Frost / Tau-Zyklen von Farbstofflösungen; Diese denaturiert schnell den Farbstoff. Einmal aufgetaute lagern bei 4 ° C und innerhalb von 1 Woche. <ol><li> einem Wasserbad auf 30 ° C vorgewärmt, mit einer Plattform ~ 3 bis 5 mm unterhalb der Oberfläche des Wassers. </li><li> Frisch herstellen 10 uM Styrylpyridinium- Farbstofflösung (10 ul frisch aufgetaut 10 mM Styrylpyridinium- Farbstoff in 10 ml Kochsalzlösung) und äquilibrieren in einem Wasserbad. </li><li> Pin jeder Zubereitung in einem Silikon-Gummi ausgekleidet 35 mm Kulturschalen untergetaucht in 1 bis 2 mm von Salzlösung (typisches Volumen, ~ 2 ml). Jede Ohrmuschel Vorbereitung der Haut wird zwei Präparate ergeben, wenn in der Hälfte von der Spitze schneiden mit einer kleinen Schere zu stützen (10 bis 15 cm Länge), Tierversuche zu minimieren. </li><li> Legen Sie die 35-mm-Schalen, die mit Kochsalzlösung bedeckt Ohrmuschel Präparate auf dem Untersee-Plattform im 30 ° C Wasserbad enthält. Sicherstellen, dass dieWassertiefe für eine ausreichende Erwärmung ausreichend, aber nicht die Kochsalzlösung in der offenen Schale verunreinigen. </li><li> Pin fein (0,5-1 mm Außendurchmesser) Schläuche mit O 2 / CO 2 in die Silikon - Basis jeder Schale fließt , um kontinuierlich die Vorbereitungen Gas. Auch legen in das Wasserbad 100 ml farbstofffreie Kochsalzlösung zum Waschen / Schale erfrischend. Verwenden Sie einen gut verschlossenen Flasche Carbogen der Sättigung zu halten und Wasserverschmutzung zu verhindern. </li><li> Äquilibrieren alles bei 30 ° C für 30 min, dann ersetzen Sie die Kochsalzlösung über die Ohrmuschel Präparate aus den 100 ml verschlossenen Flasche. Inkubieren weitere 30 min. HINWEIS: Diese Reserve kompensiert Salzverdampfung und alle Schüttvolumen Verluste aus Gas-line sprudelnden. </li><li> Abgießen farbstofffreien Kochsalzlösung in einem 100 ml Becherglas Abfall, dann schnell und sorgfältig jede Flüssigkeit blot entfernt verbleibenden um die Zubereitung mit Seidenpapier Verdünnungseffekte auf der Farbstofflösung zu minimieren, um als nächstes zugegeben werden. Achten Sie darauf, nicht zu berühren ( <em&gt; dh Schaden) direkt die freiliegenden tiefdermaler Oberflächen. </li><li> Inkubieren Ohrmuschel Präparationen in 2 - 3 ml von 10 uM Styryl pyridinium Farbstoff für 40 min bei 30 ° C dann zurück zu R / T für den Rest des Verfahrens. </li><li> Entfernen Sie nicht internalisierte Farbstoff in drei Stufen unter Verwendung von Lösungen bei R / T. Hinweis: Diese Schritte werden am besten durchgeführt, in minimalen Umgebungslicht (Verdunkelung, rot / orange mit niedriger Intensität Beleuchtung) Auge dunkel-Anpassung für die Bildgebung zu beginnen. <ol><li> Gießen Sie die Markierungslösung aus den Schalen in einen Abfallbecher weg und spülen Sie schnell in drei Änderungen von farbstofffreie Kochsalzlösung in schneller Folge. Dies beseitigt die Rest Styrylpyridinium- Farbstofflösung haftend auf die Vorbereitungen und jeder Farbstoff, der aus exponierten Membranen leicht departitions. </li><li> Inkubieren in einem letzten Änderung der farbstofffreien Kochsalzlösung für weitere 30 min die meisten verbleibenden Farbstoffes von Oberflächenmembranen departition, dh Farbstoff durch die Klemmen nicht internalisiert. </li><li> Entfernen Sie hartnäckigen Farbstoff stecken to der externen Faltblatt der exponierten Membranen mit sulfonierten b-Cyclodextrin - Derivat Chela (Advasep-7, 1 mM, 5 min - siehe Tabelle 1). Somit werden alle verbleibenden Farbstoffes innerhalb der Gewebe ist. </li></ol></li><li> Legen Sie in frischen farbstofffreie Kochsalzlösung für die Bildgebung und trocknen Sie die Außenseite der Schale gründlich mit Seidenpapier. HINWEIS: Die Anschlüsse sind nun bereit für die Bildgebung. Es ist wichtig, sich bewusst zu sein, dass die lanceolate Endungen sind lebendig und daher langsam wieder die Endozytose Styrylpyridinium- Farbstoff freigesetzt wird. Obwohl dies bei R / T langsamer sein, ist es wichtig, Verzögerungen vor / während der Bilderzeugung zu minimieren. Wenn das Experiment Kennzeichnung von mehreren Zubereitungen erfordert zunächst beibehalten sie alle bei 30 ° C nicht markiert. Sie werden für mehrere Stunden lebensfähig sein. Dann beschriften nacheinander in Abständen, durch die zweite Zubereitung Kennzeichnung (Schritte 2.7 - 2.8.3), während die erste Bildgebung. </li></ol> 3. Imaging Beschriftete Lanceolate Endings. HINWEIS: Der Beobachtersollte für die folgenden Bilderzeugungsstufen sein dunkel angepasst. Die erhöhte Sehschärfe dies ergibt bedeutet geringere Anregungslicht Ebenen die Follikel für die Bildgebung zu finden sind erforderlich. Dies ist besonders wichtig für die Phototoxizität zu minimieren, anstatt die Unannehmlichkeit des Photobleaching reduzieren. Freie Radikale durch volle Intensität Beleuchtung erzeugt schnell kann (innerhalb von 60 sec) töten Nerven lebenden Terminals (GS Bewick, S. Fadul und WJ Betz, nicht veröffentlichte Beobachtungen). <ol><li> Vor Bildgebung, überprüfen Sie die Vorbereitung unter einer Dissektion Stereomikroskop und sorgfältig jede Oberfläche Schmutz zu entfernen. Dies verhindert, dass Autofluoreszenz die Bilder zu kontaminieren. <ol><li> Montieren Sie die Schüssel auf der Bühne eines aufrechten Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Standard-Fluorescein-Filtersatz (480-488 nm Anregung, 500 - 520 nm Emission für Styrylpyridinium- Farbstoff). </li></ol></li><li> Dämpfen Sie den Anregungslichtintensität mit Neutraldichtefilter, bis ausreichend nur bequem, das Terminal zu lokalisierens. </li><li> Suchen Sie markierten Follikel durch mit niedrigen Beobachtung (3.5x - 4x trocken Ziel), dann progressiv höher (10x und 20x Wasserimmersionsobjektiv) vergrößernden Objektiven. </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern von markierten lanceolate Terminals durch 10x Trockenobjektiv für Low-Power und 20x Wassertauchziele für höhere Vergrößerung. Minimierung der Lichtintensität und der Belichtungszeit (eine Kameraintegrationszeit von 0,5-1 sec wird vorgeschlagen). </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern auf einem Standard-Digitalkamera und Speichern von Bildern auf Computer-Festplatte proprietäre Software. HINWEIS: Ein typisches Beispiel ist in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Bild ~ 20 lanceolate Endungen von jeder Zubereitung. Beginnen Sie am Rand am weitesten von der Schnittkante an der Basis der Ohrmuschel Haut und Arbeit entlang dieser Marge Bildgebung jeder Follikel in der Reihe. Die Arbeiten über in leicht überlappenden Bereichen der Schnittkante parallel, dabei nicht die gleiche Follikel zweimal und jeder zu Bild, das offensichtlich beschädigt sind. Beachten Sie dasRe sind in der Regel zu viele lanceolate Terminals Bild sie alle, bevor eine signifikante spontane de-Färbung auftritt. Daher empfiehlt Abtasten wir systematisch die Bevölkerung das folgende Protokoll. </li><li> Nach dem Randstreifen Abschluss einer Feldbreite in Richtung der Basis der Ohrmuschel, bewegen und den Prozess in umgekehrter Richtung wiederholen. </li><li> Bild alle Terminals angetroffen werden, außer gelegentlichen diejenigen klar orientiert sehr viel mehr schräg zur optischen Ebene und unwahrscheinlich ganz zu passen innerhalb der Standard-Ringanalyse ROI (siehe Abschnitt 4). nicht ausschließen, ungewöhnlich heller oder dunkler lanceolates zu den umliegenden Terminals verglichen, es sei denn, sie offensichtlich beschädigt sind oder Hintergrundintensität besonders hoch ist, was anzeigt, lokalisierte Gewebeschäden. </li><li> Entsorgen Sie die Vorbereitung, wenn mehr als 10% der Hautbereich / Klemmen beschädigt / unbrauchbar. HINWEIS: lanceolates mit der Zeit entfärben, vollständige Abbildung jedes Präparat innerhalb von 20 Minuten nach Ende des Wasch. </li><li> ichf unter Verwendung von mehr als einer Vorbereitung, gewährleisten Intensität Vergleiche gültig sind durch zeitlich passende Präparate. Um dies zu tun, Offset-Timings jeder Präparation von ~ 30 min Färbung, um sicherzustellen, Vergleichbarkeit der de-Beize Zeiten. </li><li> Zur Überwachung de-Färbung (Exozytose), Bild das gleiche Endgerät bei 5 oder 10-Minuten-Intervallen. Mit etwas Übung ist es möglich, Bild bis zu 3 getrennte Anschlüsse zu jedem Zeitpunkt in einem Präparat. </li></ol> 4. Analysieren Beschriftete Lanceolate Endings. Hinweis: Das folgende Verfahren eine schnelle Methode zur Analyse von Terminal Intensität ist. <ol><li> Machen Sie einen ringförmigen Bereich von Interesse (ROI) zentriert auf der Spitze der Haarschaft an der Basis des Haarfollikels (Abbildung 2). Stellen Sie den Innenumfang des ringförmigen ROI groß genug, um den Haarschaft Autofluoreszenz in jedem Follikel zu vermeiden analysiert werden, aber immer noch umfassen alle terminalen Fluoreszenz. Stellen Sie sicher, dass der Außenumfang groß genug ist, den größten termin zu umschließenal wahrscheinlich angetroffen werden, dass zur optischen Haupt / Follikel-Achse orientiert schließen wird. </li><li> Bilden einen Hintergrund ROI etwa gleich in Bereich in den Ziel Anulus (Quadrat oder einem Kreis, typischerweise ~ 400 &amp; mgr; m 2) , um die lokale Färbungsintensität in der Nähe des Terminals zu analysiere zu bestimmen. Hinweis: Die Größen dieser zwei ROIs werden zu Beginn der Analyse festgelegt und verwendet, um alle nachfolgenden Follikel / lanceolate Terminals über alle Präparationen in einem Experiment analysiert. So ist es wichtig, ihre Parameter mit Sorgfalt am Anfang zu setzen. </li><li> Platzieren Sie den Hintergrund ROI nahe genug an der Follikel lokalen Hintergrund in den Talgdrüsen zu repräsentieren, um die Anschlüsse zu Grunde liegen, nicht auf die geringere Intensität der Haut zwischen den Follikeln, aber sein nicht vorsichtig alle Anschlussbereiche aufzunehmen. </li><li> Notieren Sie sich die mittlere Intensität der beiden ROIs mit der &quot;Maßnahme&quot; oder &quot;analysieren ROI &#39;Funktion der Software und Übertragen von Daten in eine Tabelle.</li><li> In der Tabelle, Subtrahieren für jeden einzelnen Follikel die mittlere lokale Hintergrundintensität aus, dass in dem Ringraum einen Nettointensität zu geben. Diese Einstellung für lokalisierte Hintergrund stark reduziert zwischen-Follikel Variabilität. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bewick und Betz diejenigen entwickelt , die N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromid bezogenen Styrylpyridinium- Farbstoffe 7-10 lokale Recycling synaptischer Vesikel Membran zu überwachen. Die Farbstoffaufnahme und damit eine erhöhte Fluoreszenz spiegelt daher synaptischen Vesikelmembran Internalisierung (Endozytose). Anschließend kann diese internalisiert Farbstoff durch weitere elektrische Aktivität wieder freigegeben werden, überwacht die Vesikelmembran Externalisierung Farbstoffverlust zeigt (Exozytose). In Synapsen, dies ist ein Proxy für Neurotransmitter-Ausschüttung. Zur gleichen Zeit fanden wir auch diese Farbstoffe 7 primäre mechanosensorischen Nervenendigungen beschriften. In jüngerer Zeit 11, zeigte Bewick, Banken und Kollegen dann , dass dies in den reifen, differenzierten mechanosensorischen Terminals ex vivo einen ähnlichen Prozess widerspiegelt. Auch hier bezeichnen die Farbstoffe 50 nm Durchmesser &#39;synaptic-like&#39; Vesikel (SLVs), die konstitutiv recyceln Glutamat freisetzen.In mechanosensorischen-Terminals, im Gegensatz zu ihren synaptischen Kollegen ist dies in erster Linie Recycling spontan. Es wird auch durch mechanische, anstatt einfach elektrische Stimulation moduliert. Für sensorischen Neuronen in der Kultur und in Cochlea Haarzellen, Styrylfarbstoffe im Allgemeinen und Styrylpyridinium- Farbstoff insbesondere wurde gezeigt , durch die mechanosensorischen Kanäle passieren, die mechanosensorischen Kanäle blockiert und Kennzeichnung irreversibel inneren Membranen 12. Jedoch bei vergleichbaren Styrylfarbstoffs Konzentrationen in differenzierten mechanosensorischen Terminals in situ, wie hier in lanceolate Endungen 2 oder in Ia Endungen in Muskelspindeln 11, und in Haarzellen, die nicht mechanisch 13 angeregt, 14, Kennzeichnung ist durch Membran Endozytose. In mechanosensorischen Nervenendigungen, zum Beispiel, die Kennzeichnung ist reversibel und blockiert nicht die mechanosensorischen Antworten bei den Konzentrationen hier 2 verwendet, 11, 15. Während einige Farbstoff Internalisierung durch Kanal Permeation in diesen Endungen kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, die in der Nähe von insgesamt destain mit Latrotoxin zeigt die große Mehrheit der Etikettierung in reifen Terminals ist durch Internalisierung mit Recycling Vesikelmembran. Wir haben, verwendet daher diese Technik 11 die Aktivität Abhängigkeit zu studieren und, in jüngster Zeit, die Pharmakologie 2 von SLV Recycling in mechanosensorischen afferenten Terminals von Arzneimittelwirkungen auf die Aufnahme und Freisetzung der Farbstoffe zu untersuchen. Wie bei den meisten praktischen Techniken erfordert Reproduzierbarkeit Wiederholung und Praxis. Einige der wichtigsten Punkte für die Zuverlässigkeit sichergestellt wird nun diskutiert. Lanceolate Kennzeichnung bei jüngeren Tieren ist zuverlässiger - das kleinste Tier, das wir verwendet haben, betrug 15 g Körpergewicht. Es ist nicht ganz klar, warum dies der Fall ist, aber es kann sein, weil Dissektion der jüngeren Binde- erfordert Gewebe weniger mechanisches Trauma und leAves weniger verbleibende Rückstand, wenn das Gewebe Entfernen der Innervation Schicht liegt. Insgesamt ist die Gewebepräparation ganz einfach, mit den Hautschichten auseinander Abziehen der technisch anspruchsvollsten praktischen Aspekt zu sein und dann nur bei älteren Mäusen. In diesen haften die Hautschichten an der Basis stark zusammen, wo die Dissektion beginnt, aber auch hier eine Trennung der Schichten wird viel einfacher gegenüber den Rändern. Zum Glück, oder vielleicht damit diese dünneren Randhautbereiche geben in der Regel die meisten zufrieden stellende Kennzeichnung, wie die vordere Haut tut im Allgemeinen. Deshalb, vor allem vermeiden, an den Rändern der sehr dünnen Haut zu erfassen. Um das Risiko von Schäden zu minimieren, zu manipulieren Vorbereitungen indirekt mit geschlossenen Zange drückt, anstatt Greifen direkt oder wenn wesentliche Griff nur härtere Gewebe kaum markiert werden. Seien Sie gründlich bei der Entfernung der &#39;Schicht- Polystyrol&#39; Schicht sofort die Follikel liegt, da dies die Haupt michmechanische Behinderung Bildgebung und Drogen-Zugang. Allerdings ist es wichtig , physischen Kontakt mit den zugrunde liegenden Strukturen wie diese Schäden möglichst gering zu halten (dh Streifen weg) die neuronalen Netze und Endgeräte direkt unterhalb. Wenn die vorherrschende Fluoreszenz gelb / weiß in den Talgdrüsen ist, prominente Autofluoreszenz der Haarschaft Basen und einige Sicheln von orange / gelb lanceolate Endungen, deutet dies auf die Nervengeflechte Schicht und die damit verbundenen lanceolate Terminals während Clearance entfernt worden ist. Dies scheint das Hauptproblem bei älteren (&gt; 30 g) Mäusen zu sein. Während der Färbeverfahren, sicherzustellen, alles bei 30 ° C ist und gut mit Sauerstoff angereichert. Beachten Sie, dass markierte Terminals noch am Leben sind. Folglich wird Farbstoff durch laufende spontane (konstitutiv) Exozytose-Freisetzung sezerniert werden. Dies wird bei R / T langsamer sein, aber es ist eine gute Praxis, die Verzögerung zwischen der Entfernung von Chelator-Lösung und Bildgebung zu minimieren, Farbstoffverlust zu minimieren. Außerdem wird für zwischen den Gruppen Vergleichs sTUDIEN der Intensität, ist es wesentlich, Abbilden aller Gruppen zu gewährleisten ist zeit abgestimmt. Verwendung eines Farbstoff-Chelatbildner vor der Bebilderung deutlich verbessert Bildkontrast. Während also relativ teuer ist, ist die Chelat-Schritt sehr wichtig für die Gewährleistung einer guten Bildqualität. Chelator Verwendung kann durch Wiederverwendung der Lösung mehrmals minimiert werden, und sogar auf 2 bis 3 aufeinanderfolgenden Tagen, gelagert bei 4 ° C zwischen den Anwendungen. Entsorgen Sie die Chelator-Lösung, sobald es merklich rosa geht, zeigt seine Farbstoff-Sequestrierung Sättigung nähert. Während der Bilderzeugung beachten des Potenzials für phototoxische Schädigung dieser lebenden Terminals, die eine kumulative Ergebnis sowohl die Intensität und die Bestrahlungszeit des Anregungslichtes. Diese Überlegung ist weniger wichtig für einzelne Bilder Zeitpunkt, wo die Bildqualität das Hauptanliegen ist. Jedoch ist es während wiederholter Bildgebung in kinetische Studien entscheidend Anregungslichtexposition auf ein Minimum zu reduzieren. Während der Entwicklung dieser FarbstoffeLabel Synapsen, fanden wir Anregung für&gt; 1 min bei voller Leistung Anregungsbeleuchtung wird dramatisch und irreparable Schäden an den Nervenenden führen. Sie erweitern zuerst anschließend enorm, dann kollabiert vollständig über einen Zeitraum von ca. 15 min. Wir prüften nicht systematisch die relativen Beiträge von Belichtungszeit und Intensität, aber diese Beobachtungen legen nahe, das Leitprinzip sowohl zu minimieren sollte. So empfiehlt es sich, Anregungslichtintensität und Dauer sind das Minimum angemessen mit guten Bildern bekommen, und geeignete Kontrollbilder werden in Zeitverlaufsstudien gemacht. Um zu testen, dass die Daten nicht von Phototoxizität bei wiederholter Bildgebungsbedingungen betroffen sind, zu jedem Zeitpunkt nehmen ein zusätzliches Bild eines zuvor ungesehenen Terminal. Dies ist das Verhalten der Markierung in naive Klemmen zu gewährleisten ähnelt in Follikel wiederholt abgebildet wird. Eine Reihe von Faktoren können die innerhalb der Gruppe Variabilität der Nettointensität d reduzierenata. Genaue Platzierung der ROIs, insbesondere die Hintergrund ROI, ist wichtig, da sogar kleine Bereiche ungeeigneter Färbung stark zwischen Follikel-Datenvariabilität beeinflussen können. Die Variabilität der Nettointensität wird auch durch, wie vollständig jedes Haar beeinflusst Follikel durch die Palisade aus Endungen umgeben. Vergleichen Sie zum Beispiel die sichelförmige Verteilung Kennzeichnung in 1B mit dem nahezu vollständig kreisförmigen Muster in Abbildung 2 zu sehen ist . Komplexere Analyse, vielleicht mit automatisierten Software - Erkennung und Schwellwertbildung, sind notwendig , wenn der Grad der Einkreisung ein relevanter Parameter ist. Bitte beachten Sie, dass die Intensitätsverteilungen selbst für die genau analysiert Follikel Gruppen nicht normalverteilt sind (siehe Abbildung 3), was die Verwendung von nicht-parametrischer Statistiken für zwischen-Behandlung Vergleiche der Bevölkerung Mediane eher als Mittel. Normalisierungstechniken wie Intensitäten als Prozentsatz o exprimierendenf kontralaterale Kontrolle oder einer Kontrollgruppe aus mehreren Zubereitungen können Variabilität weiter zu reduzieren, angewandt werden. Die endgültige technische Artikel zu betrachten, ist die experimentelle Design für pharmakologische Tests. Während pharmakologische Untersuchungen vorge inkubieren die Herstellung der Arzneimittellösung 30 min vor dem Farbauftrag. Dann halten die Arzneimittelkonzentration in der Farbstofflösung. In der Kontrollgruppe, verwenden entweder Kochsalzlösung oder, wenn das Medikament in einem Fahrzeug, Kochsalzlösung und Träger gelöst wird. Der vorliegende Beitrag zeigt, wie diese neue Ohrmuschel Vorbereitung qualitativ hochwertige Bilder von mechanosensorischen Digungen in der Haut mit minimaler Vorbereitung bietet. Wir zeigen auch, kann es die Pharmakologie von zwei kritische Aspekte der Vesikelrecycling zu untersuchen verwendet werden. Wir zeigen zunächst, dass ein Glutamat-Rezeptor-Agonist Farbstoff Internalisierung erhöhen kann (ein Marker der Endozytose) und zweitens, dass Farbstoff verloren wieder mit Latrotoxin (ein Stimulans der Exozytose). Die Bedeutung dieser preparatIon und Technik ist , dass es auf lebende Haut mechanosenory Terminals in situ für die Bildgebung Experimente Man erhält einzigartige Möglichkeiten für die optische Überwachung von Terminal - Funktion, Struktur und deren Beziehungen untereinander einen ausgezeichneten Zugang bietet. Zu diesem letzteren Zweck haben wir entwickelt es auch weiter für den Einsatz in kombinierten optischen / elektrophysiologische Untersuchungen (siehe Schwester JoVE Artikel für weitere Details).

Mechanosensorischen Nervenenden sind in der Regel klein, diffus verteilt und schwer zugänglichen in situ, da sie in der Regel tief in die Haut oder andere umgebende Gewebe eingebettet sind. Visualisieren sie daher durch eine verlängerte Immunmarkierung / Färbungszeit oder die Verzögerung und die Kosten des Erhaltens Mauslinien mit genetischen Expression von Fluoreszenzmarkierungen, wie grün oder gelb fluoreszierende Protein (GFP / YFP) 1 gefolgt erfordert in der Regel sectioning. Hier zeigen wir eine bequeme Gewebe und eine schnelle und einfache Methode , den Zugang zu einer großen Anzahl von Haarfollikel Afferenzen für das Studium zu gewinnen, und wie sie schnell zur optischen Überwachung von Terminal - Funktion 2 markiert werden. Mit etwas Übung kann die gesamte Technik von Dissektion Bildgebung in weniger als 2 Stunden abgeschlossen sein. Die lanceolate Terminals sensorischer Axone innervieren Haarfollikel in Säugetieren Palisaden um das Epithel der Haarbalg bilden, mit jeweilsKlemme zwischen Glia / Schwann - Zellen sandwichartig verarbeitet 2-4. Der Zweck der Klemmen ist die mechanische Verschiebung der Haare zu erfassen, sie umgeben. Sie sind eine Mischung von schnell und langsam Anpassung Enden, aber sie produzieren überwiegend kurze Ausbrüche von Aktivität in Reaktion auf Haarbewegung. Typischerweise stoppt die Zündung sehr schnell, wenn die Bewegung aufhört, auch in Gegenwart von fort Verschiebung. Dieses murine Ohrmuschel Modell für die Untersuchung lanceolate Terminals durch optische Verfahren hat viele vorteilhafte Merkmale für die Struktur und Funktion dieser Digungen studieren. Die Ohrmuschel ist vorwiegend zwei Schichten der Haut angelagert back-to-back, mit nur einer geringen Menge von Knorpelgewebe dazwischen. Die Haut ist sehr dünn und leicht durch minimale Mengen von Klebstoff schwach Bindegewebe relativ zu anderen Regionen des Körpers präpariert. Die leicht getrennt Hautschichten, daher geben einen guten Zugang zu den Follikeln und Terminals. Die Innervationleicht zugänglich und erkennbar ist. Die Haarfollikel mehr sind spärlich verteilt als in anderen Hautregionen, die Abbildung einzelner oder kleiner Gruppen von Follikeln zu erleichtern. Die dünne darunter liegende Hautschicht ergibt eine gute Zugänglichkeit zu Farbstoffe und pharmakologische Medikamente, so ist ideal für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie ohne weitere Verarbeitung. Die Darstellung von markierten Terminals können entweder von lebenden Terminals oder, wenn eine fixierbare Farbstoff analog unter Verwendung von nach dem Fixieren und weitere histologische Verarbeitung. Wir haben dieses Präparat verwendet , dass die Membran zu zeigen , das Recycling in den lanceolate Endungen auftritt, belegt durch die Aufnahme (Endozytose) und Release (Exozytose) eines Styrylpyridinium- Farbstoff (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromid). Der Farbstoff nicht tut, scheint jedoch deutlich die Investition Schwann Zelle 2 verarbeitet zu beschriften. Wir zeigten auch, dass dieser Farbstoff-Aufnahme / Freisetzung und damit r MembraneCycling, unterliegt glutamatergen Modulation durch eine atypische (Phospholipase D-gekoppelt) metabotropen Glutamatrezeptor. Die Ergebnisse der einfachen Stimulation und Analyseprotokolle dargestellt sind, und gemeinsame Potenzialanalyse Probleme werden ebenfalls hervorgehoben.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td></tr><tr><td>No. 3 Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&amp;amp; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image Analysis Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Image capture and analysis software.</td></tr></tbody></table>

optical monitoring of living nerve terminal labeling in hair follicle lanceolate endings of the ex vivo mouse ear skin

Eine neuartige Dissektion und Aufzeichnungstechnik wird zur optischen Überwachung Färbung und de-Färbung von lanceolate Terminals umgebenden Haarfollikel in der Haut der Ohrmuschel der Maus beschrieben. Die Herstellung ist einfach und relativ schnell, zuverlässig umfangreiche Regionen von mehreren markierten Einheiten von lebenden Nervenendigungen Nachgeben extensiv in Studien der Vesikelrecycling verwendet zu untersuchen Aufnahme und Abgabe von Styryl pyridinium-Farbstoffe. Unterteilen der Vorbereitungen vor der Markierung ermöglicht Test vs. Kontrolle Vergleiche im gleichen Ohr von einem einzelnen Individuum. Hilfreiche Tipps für die Verbesserung der Qualität der Zubereitung, die Kennzeichnung und die Abbildungsparameter gegeben. Dieses neue System ist geeignet für pharmakologisch Untersuchung und mechanisch induzierte Aufnahme und Freisetzung dieser Vitalfarbstoffe in lanceolate Terminals sowohl in Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere. Beispiele für modulierende Einflüsse auf die Markierungsintensität gegeben.

Die Haarfollikel in dieser Ohrmuschel Herstellung sind unter Durchleuchtung ohne Fluoreszenz (Abbildung 1A) leicht zu erkennen ist , welche die hauchdünne Art der Zubereitung und der relativen Leichtigkeit der Zugänglichkeit es um diese mechanosensorischen Terminals bietet. Jeder wird durch die prominente Haarschaft Basisdurchdringen der dunklen Mondsichel der Talgdrüse typisiert. Unter Epifluoreszenz- werden die markierten lanceolate Terminals jedes Haarfollikel umgebenden deutlich zu sehen und zeigen die typisch robust spontane Styrylfarbstoffs Aufnahme (1B). Dies geschieht ohne auferlegte Bewegung. Die lanceolate Klemmen sind zu sehen in den Haarschaft zu umgeben, obwohl der Umfang der Umfassung ist variabel 6. Ein Großteil der Markierung ist punctata (spots) eher als die lineare Anordnung, die erwartet werden könnte. Die punktierte Muster reflektiert Terminals in einer optischen Ebene entlang der Länge des Anschlusses beobachtet wird. This Präparat erhielten keine weitere Verarbeitung zur Visualisierung nach der Markierung, wurde es einfach zu einem Mikroskoptisch überführt und in situ abgebildet werden , was wiederum die Einfachheit dieser Herstellung veranschaulicht. Beispiel Versuche diese neue Zubereitung , an die geeignet sind , in Figur 3 gezeigt. Es kann verwendet werden , um sowohl die Endozytose und Exozytose in lebenden Terminals zu studieren, sowie deren Modulation. So kann Endozytose, Glutamat - Rezeptor - Agonisten die Markierungsintensität zu erhöhen, während Ca 2+ -Kanäle Blockierung mit Liganden oder Kationen wie Mg 2+, Ni 2+ oder Cd 2+ verringert sie 2. Alternativ kann diese Zubereitung auch die Kinetik der Exozytose zu studieren verwendet werden, wie in 3C gezeigt. Zuerst wird ein markierter terminal de Färbung spontan gesehen. Jedoch ist diese entfärben durch die Exozytose Stimulans beschleunigt Latrotoxin. Mehr details der Versuchsergebnisse können in Banks, RW et al. 2 ersichtlich ist. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig1.jpg" /> Abbildung 1. Robuste Styrylfarbstoffs Labeling Aufgenommen in der Maus Pinna. (A) Teil einer unmarkierten Ohrmuschel Vorbereitung in Hellfeldbeleuchtung, die zeigt , wie deutlich Haarfollikel in Bereichen erscheinen geräumt areolar / Fettgewebe liegt. Die dunklen, in der Regel zweilappig sind Sichelformen Talgdrüsen die zentrale Haarschaft umgibt. (B) Ein ähnliches Bereich bei einer etwas höheren Vergrößerung und mit Epifluoreszenz abgebildet, zeigt lanceolate Digungen mit Styryl - Farbstoff markiert. Maßstabsbalken -. 40 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analyse der Styrylfarbstoffs Markierungsintensität. (A) Typische Kreismuster des Haarfollikels Markierung mit Styrylfarbstoffs, zentriert auf dem Haarschaft (nicht im Bild sichtbar). (B) Die &quot;Region of Interest&quot; Hauptanalyse (ROI) wird durch einen Standard Anulus auf die Position der Palisade von lanceolate Nervenenden rings um die Follikel lagert definiert. Dieser ROI konstant gehalten wird, in Form und Fläche für jedes einzelne Experiment Markierungsintensität zu gewährleisten, kann ziemlich zwischen Zubereitungen und über alle Behandlungen verglichen werden. Nettointensität jedes ROI wird durch Subtrahieren der Intensität eines benachbarten quadratischen oder kreisförmigen Hintergrundbereich (~ 400 &amp; mgr; m 2) berechnet. Auch dieser quadratischen Hintergrund Bereich konstant in Form und Fläche in ganz einem bestimmten Experiment gehalten.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig3.jpg" /> Abbildung 3. Markierungsintensität des Haarfollikels Afferent Lanceloate Endings nicht normalverteilt und kann verwendet werden , um zu untersuchen Sowohl Endo- und Exocytose. Typische Daten aus Styrylfarbstoffs Intensitätsmessungen in spontan markierten lanceolate Terminals die Analyse oben beschriebenen Methode. (A) Labeling Intensität unter Kontrollbedingungen (54 Follikel, 4 Ohren) und 1 mM Glutamat (42 Follikel, 4 Ohren). Die Intensitätswerte der einzelnen Endungen werden als Cluster-Dot-Plots angezeigt. Jeder Punkt repräsentiert die Intensität eines Anschlusses Palisaden um einen Follikel. Beachten Sie, dass auch unter Kontrollbedingungen wenige Datenpunkte (Follikel) sind extrem intensiv, während die meisten bei geringeren Intensitäten gruppiert sind. Der erste Punkt bei einer bestimmten intenskeit wird in der Mitte und nachfolgende Datenpunkte der gleichen Intensität aufgetragen progressiv seitlich auf beiden Seiten aufgetragen. Somit stellt seitliche Ausbreitung der Häufigkeit der Follikel eines bestimmten Markierungsintensität. Die horizontalen Linien stellen Median ± 25% Quartilsabstand. Inkubation mit 1 mM Glutamat erhöht die mittlere Intensität von ~ 50% (*** P &lt;0,001, Mann-Whitney), aber Markierung kann um 200 erhöht werden - 300% in einigen Terminals. (B) Bilder Glutamat-vermittelte verbesserte Farbstoffaufnahme demonstriert (Endozytose). Inkubation des Haarfollikels Zubereitung in Glutamat (1 mM) deutlich erhöht styryl Farbstoffaufnahme, wie durch die erhöhte Markierungsintensität dargestellt. Maßstabsbalken 20 um. (C) Enhancing Farbstofffreisetzung (Exozytose). Nach der Markierung wird Styrylfarbstoffs wieder spontan freigesetzt, wie die Kennzeichnung bei 0 min deutlich heller als bei 60 min ist, auch nach Abzug des Hintergrunds für Photobleaching zu steuern. Diese Version ist stark potentiated von Latrotoxin, Bestandteil eine schwarze Witwe Spinnengift, die Exozytose unkontrollierte Vesikel auslöst. Nach 60 min in Toxin ist terminale Markierung fast nicht nachweisbar. Diese Reversibilität der Styrylfarbstoffs Kennzeichnung unterstützt die Hypothese, dass Terminal Fluoreszenz Internalisierung während der lokalen Recycling synaptischer Vesikel-ähnlichen zurückzuführen ist. Maßstabsbalken 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus-Ohr-Haut

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

optical-monitoring-living-nerve-terminal-labeling-hair-follicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

7.4K Aufrufe.  University of Aberdeen. Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Serie: Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Forschung

Neurowissenschaften

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Entwicklungsbiologie

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of the understanding of their distributional and chemical characteristics comes from conventional histochemical and immunohistochemical staining on thin tissue sections. With the development of the tissue clearing technique, it has become possible to view the cutaneous nerve fibers on thicker tissue sections. The present protocol describes multiple fluorescent staining on tissue sections at a thickness of 300 &#181;m from the plantar and dorsal skin of rat hindfoot, the two typical hairy and glabrous skin sites. Here, the calcitonin gene-related peptide labels the sensory nerve fibers, while phalloidin and lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 label the blood and lymphatic vessels, respectively. Under a confocal microscope, the labeled sensory nerve fibers were followed completely at a longer distance, running in bundles in the deep cutaneous layer and freestyle in the superficial layer. These nerve fibers ran in parallel to or surrounded the blood vessels, and lymphatic vessels formed a three-dimensional (3D) network in the hairy and glabrous skin. The current protocol provides a more effective approach to studying skin innervation than the existing conventional methods from the methodology perspective.

The thickness of tissue sections limited the morphological study of the skin innervation. The present protocol describes a unique tissue clearing technique to visualize cutaneous nerve fibers in thick 300 &#181;m tissue sections under confocal microscopy.

Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles

Source: Bewick, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53854">Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the combined recording of mechanically stimulated afferent output and nerve terminal labeling in the hair follicles of a mouse pinna. It outlines the steps involved in the mechanical stimulation of hair follicle nerve terminals before and after exposure to a fluorescent membrane dye, electrophysiology recording of the generated action potentials, and visualization of the nerve terminal labeling in the hair follicles.

Kombinierte Aufzeichnung der mechanisch stimulierten afferenten Ausgabe und der Markierung der Nervenenden in Haarfollikeln von Mäusen

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Electrophysiological Recording ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Stimulation and Modulation Techniques

Recording Neural Activity in Freely Moving Mice Using Fiber Photometry

Begin by inspecting the distal end of the fibers of the patch cord by eye, and with a mini fiber microscope. If the surface of the fibers is scratched, repolish the fibers using fiber polishing film with fine grit. Then, clean the distal ends of the patch cord with 70% ethanol and a cotton-tip applicator. Clean the fiber optic cannulas using 70% ethanol and a cotton-tip applicator.
Connect the ferrule end of the patch cord to the implanted fiber using a ceramic split sleeve covered with a black shrink tube. During the connection, make sure that the sleeve is tight. Allow the animal to recover for a few minutes, then, start recording the optical signal and run the experiment. While recording, keep a careful eye on the live trace to ensure quality recordings, and watch for any jumps in signal indicating the sleeve is not tight enough.

Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der

Zusammenfassung

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