Wir danken Prof. Kazuki Saito in Riken PSC und Dr. Björn Usadel in MPIMP für hilfreiche Diskussionen. TT wird durch ein Stipendium der Alexander von Humboldt-Stiftung unterstützt.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Pflanzenmaterialien werden geerntet und sofort eingefroren. </li><li> Gefrorene pflanzlichen Materialien werden von Schwingmühle pulverisiert (oder Mörtel) und in Falcon-Röhrchen oder Eppendorf-Röhrchen bei -80 ° C </li></ol> 2. Extraction für Metabolite Profiling <ol><li> Aliquot gefrorene Pflanzenmaterial in einem 2 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> 5 l der Extraktionspuffer pro Milligramm Frischgewicht von gefrorenem Pflanzenmaterial. </li><li> Fügen Sie ein Metall (oder gilconia) Kugel und homogenisieren von gefrorenen Pulver mit dem Mixer Mill für 2 min bei 25 ls -1. </li><li> Zentrifuge 10 min bei 12.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Den Überstand in Zentrifugalfilter Nanosep. </li><li> 2 min zentrifugieren bei 4.000 min. </li><li> Den Überstand in neues Eppendorf-Röhrchen, und bei -20 ° C bis zum Gebrauch. </li></ol> 3. Metabolite Profiling mittels LC-MS <ol><li> Richten Sie HPLC und prüfen Temperatur von Säulenofen und Probenteller. </li><li> Richten Sie MS Zustand und überprüfen Sie den Zustand des Vakuums und Heizung Kapillare. </li><li> Führen m / z Kalibrierung von MS-Detektor. </li><li> Übertragen von 50 ul von Extrakten zu Glasfläschchen für LC-MS. </li><li> Injizieren Sie 5 ul der Extrakte zu LC-MS. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Konfigurieren Sie Xcalibur oder Metalign 4 und wählen Sie die Datenanalyse verarbeitet werden sollen. </li><li> Bereiten Sie eine Tabelle der detektierten Peaks, die Sie interessieren in Übereinstimmung mit Verbindungsklasse in Tabelle I. </li><li> Ursache von Spitzen, die durch Co-Elution von Standard-Compounds. </li><li> Anmerken detektierten Peaks mit MS-Analyse 2, Literaturrecherche, Metabolit-Datenbank suchen (Abbildung 2, 12,13). </li></ol> 5. Vorhersage von Stoffwechselwegen <ol><li> Konstruieren Sie einen möglichen Weg mit Verbindungen erkannt. Vorhersage des Pfades mit Anmerkungen Peak sollte von der chemischen Struktur der erkannten Verbindung beruhens durch die Vorhersage Verknüpfung enzymatischen Funktionen auf dem Stoffwechselweg 13. Strukturierung Biosyntheseschritte sollte mit präzisen Peak-Annotation durchgeführt werden. Aber Bestimmung detaillierte chemische Struktur, zum Beispiel Zucker-Einheit, ist in diesem Schritt nicht unverzichtbar, da Vorhersage Zuckereinheit und adduziert nur sehr schwer von MS-Analyse identifiziert. Bestimmung von Zucker-Typ, wie hexoside und pentoside wird durch enzymatische Assay Zuckerdonor im letzten Schritt des Projekts identifiziert werden. Teilweise Konstruktion der Vorhersage des Pfades ist als kleines Molekül Zwischenprodukt der größeren Molekül außer in den einigen Fällen, wie Dehydratisierungsreaktion durchgeführt werden. Liste der atomaren Molekulargewicht, zum Beispiel 16 m / z-Differenz zwischen H und-OH-Gruppe (Oxidation), 14 m / z (C-Atom) für den Unterschied zwischen-OH und-OMe (Methylierung) und 162 m / z ( MW-H 2 O) Hexose (Glykosylierung), ist nützlich für die Vorhersage. Bestimmung derModifikation Typ mit Korrelationsanalyse von Geweben Besonderheiten hilft Vorhersage der Stoffwechselweg. Datenbank der allgemeinen Stoffwechselweg wie KEGG Datenbank ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) und PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), ist sehr effektiv für die Vorhersage von Stoffwechselwegen, die Sie interessieren. </li></ol> 6. Vorbereitung der Gene-Liste mit Arabidopsis orthologen Gen-ID <ol><li> Download-Gen-ID-Liste aus genomischen Datenbank. </li><li> In Arabidopsis-Gen-ID des orthologen Gens, bei Ihrer Zielgruppe Pflanze ist nicht Arabidopsis. </li><li> Bereiten Sie eine Liste von Genen, die in Ihrem Pfad-of-Interest. Annotation von Arabidopsis-Weg-Daten und Daten-Gen-Familie sind in TAIR Website (verfügbar <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Wenn Sie eine Liste von Arabidopsis orthologen Genen vorbereitet haben, können Sie anschließend Kombine ihnen. </li></ol> 7. Co-exprimiert Gene Analysis <ol><li> Testen Sie mit dem vorbereiteten Gen-ID-Liste, um beste Datenbank für Ihren Weg durch die Überprüfung der Korrelation mit bekannten Gen-Paare in Ihrem Pfad-of-Interest (Tabelle II) zu suchen. Wenn die Co-Expression Datenbank oder Genexpression Datenbank nicht verfügbar sind in der Anlage, die Sie interessieren, sollten Arabidopsis Coexpression Datenbank mit einer Liste von Arabidopsis orthologen Genen verwendet werden. Bei Gerste, Reis kann, Pappel, Weizen, Medicago und Soja, Co-Expression Analyse verwendeten Pflanzenspezies (Tabelle II). </li><li> Konstruieren Sie den Rahmen für Ihre Zielgruppe Koexpression Netzwerk auf die Verbindungen von den bekannten Genen in Ihrem Pfad-of-Interest basiert. </li><li> Fügen Sie korrelierten Kandidatengene (r &lt;0,4 ~ 0,90, innerhalb ungefähre Wert des Koeffizienten-Wert zwischen den Anschlüssen der bekannten Gene, die in Ihrem Pfad-of-Interest) und überprüfen Sie ihre Gen-Annotation in Ihre PRedicted Familien zu den Verbindungen dieses Netzwerks für die Suche nach besten Kandidaten-Gene (Abbildung 3). Threshold of Koeffizientenwert sollte nach Netzwerk Struktur und Dichte von korrelierten Genen koordiniert werden. </li><li> Machen Liste von Genen, die Sie in der Lage zu verengen als spezialisierter Weg zu Ihrem Ziel. </li><li> Überprüfen Sie Genexpression der Orgel Besonderheiten und Stressreaktionen Ihrer Kandidatengene. </li></ol> 8. Integration aller Informationen, neue Wege zu Predict <ol><li> In gut charakterisierte Gene, die für die Abfrage von Co-Expressions-Analyse wurden vorhergesagt Stoffwechselweg verwendet. </li><li> Prüfen uncharakterisierten Teile in diesem Weg, zum Beispiel enzymatischer Schritte, Transportproteine ​​und Transkriptionsfaktoren charakterisierte. </li><li> Predict am besten geeigneten Gen-Annotation für diese fehlende uncharakterisierte Schritte. </li><li> Kombinieren Sie die Ergebnisse der Metaboliten-Profiling und Kandidatengene der In-silico-GEne Ausdruck auf der Basis von prognostizierten Pfad. </li><li> Ordnen Sie Kandidatengene auf der vorhergesagten Weg nach Anspruch Genfunktion, beispielsweise für Acetyltransferase acetylierten Metaboliten, Glycosyltransferase für Glycosid, P450 für oxidierten Verbindung. Phylogenetischen Baum Analyse der Aminosäure-Sequenzen ist für einige große Genfamilie wie P450 und Glycosyltransferase nützlich. </li><li> Überprüfen Sie die Konsistenz des Gewebes Besonderheiten oder Stress-Reaktionen zwischen Metabolit Akkumulation und Genexpression Niveau von Kandidatengenen. </li><li> Überprüfen Sie die Verbindungen zu anderen Stoffwechsel für die Bereitstellung von Substrat-und Stress-responsive Gene. </li></ol> 9. Experimente für Genidentifikation Verwendung von Bio-Ressourcen <ol><li> Prüfen Sie die Verfügbarkeit von Bioressourcen zur Erleichterung des Experiments zur Identifikation Kandidatengen. </li><li> Führen Sie ein Experiment zur Identifizierung der Genfunktion mit Bio-Ressourcen, wie KO Mutanten-Bibliothek und in voller Länge cDNA-Bibliothek. Texperimentiert er für die funktionelle Identifizierung von Genen mit der Vorbereitung der Überexpression Pflanzen und Knockout-Mutanten, enzymatischen Assays und Förderer Bindungsassay, müssen nach den besten Kandidaten-Gene in Ihre Vorhersage durchgeführt werden. Rekombinantes Protein Assay zur Charakterisierung von Protein-Eigenschaften und die Herstellung von Überexpression Pflanzen besser, sich nach Bestätigung der Metaboliten-Profil mit KO-Mutante, da es wesentlich länger dauert, bis rekombinanten Proteins und Klonierung von Genen für die Transformation vorzubereiten durchgeführt werden. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Das Verfahren der integrierten Analyse in diesem Protokoll beschrieben ist, hat viele Möglichkeiten, je nach angegebenen experimentellen Zweck und die Wahl der biologischen und analytischen Kombinationen. Auswahl der Verfahren und experimentellen Designs sollte ordnungsgemäß auf der Grundlage Ihrer Zielgruppe Weg, Verbindungen und Pflanzenarten durchgeführt. Die Integrationsstrategie in diesem Protokoll beschriebenen ist foc<html> Verwendung an Annotation von Pflanzen-Gen-Funktion und die Entdeckung neuer Genfunktionen mit einer effizienten Nutzung von mehreren Bio-und Daten-Ressource. Erwartetes Ergebnis wird versprochen, mit dem einzigen Fall von schlüssige Vorhersage liefern. Diese Tatsache zeigt, dass, wenn genügend Beweise können nicht durch Kombination Profile gegeben werden, Experiment nicht gestartet werden soll. Aus diesem Grund ist in allen Fällen können zusätzliche Vorversuchen wie gezielte Genexpressionsanalysen mittels RT-PCR, unterstützen Ihre Vorhersagen von Genfunktionen. Fehlerfreiheit und Genauigkeit der Vorhersage korreliert höher je nach qualitativen Unterschied und die Anzahl der Variation der Kombination. Darüber hinaus können gute Kandidaten und gültige Ergebnisse nur genaue Vorhersage der Wege kommen. Peak-Annotation sollte durch Kombination mehrerer Ansätze durchgeführt werden, zum Beispiel Literaturstudie, Referenz Pflanzenextrakt, MS n Analyse, Organspezifität und Mutanten-Analyse 13. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Übersicht über die experimentellen Strömung von Gen-Annotation über kombinierten Ansatz. In einigen Fällen beginnen Projekte mit der Entdeckung einer neuen Spitze, die im besonderen Bedingungen oder Gewebe erkannt wird, und dem Wunsch, ihre Rolle innerhalb ihres Stoffwechsels zu verstehen. In anderen Fällen der Zweck des Projektes ist die Identifizierung Gen oder Entdeckung von wichtigen regulatorischen Faktoren wie Transkriptionsfaktoren. Design of Experiment sollte mit einem Datensatz, der deutliche Unterschiede von Metaboliten in Ihrem Ziel-Weg, über eine breite Palette von Gewebeproben aus verschiedenen Organen zeigt gehobelt werden, und für unterschiedlich aufgewachsenen Pflanzen oder Pflanzen, die Stress ausgesetzt Bedingungen, und das Material einer Metabolite Profiling. Mutant und transgenen Pflanzen sowie QTL Beherbergung Zuchtmaterial stellen auch geeignete genetische Material für diese Studien. Vorhersage neuer Weg sollte sorgfältig durchgeführt werden, mit genauenHöhepunkt Annotation und Kombination Ansatz mit unterschiedlichen Art der metabolotype wie Orgel Wertpapiere und Stressreaktionen nach Genexpressionsdaten Ihrer Weg-of-Interest. Im letzten Schritt sollte Metabolit und Transkript-Profiling durchgeführt, welche schließlich, wenn sie mit In-silico-Analyse von Web-Ressourcen und In-vitro-Charakterisierung der Genexpression über heterologe Expression kombiniert, um die Bestätigung des Kandidaten-Gens und die Aufklärung ihrer Funktion führen werden und die Position innerhalb eines Stoffwechselweges. Abkürzungen: QTL, Quantitative Trait Loci. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Abbildung 2. Arbeitsablauf der kombinatorischen Ansatz zur Spitze Kommentierung bereitgestellt. Ein Verfahren für die Identifizierung der Peaks und Kommentierung durch den Standard-Verbindung, Vergleich von Wildtyp-und Knockout-Mutanten unter Berufung mehrdimensionale Massenspektrometrie des Ziel-Gipfel, um Massenspektren der reinen comPfund aus den Datenbanken 12. Abkürzungen: DB, Datenbank, KO, Knock-out, 1-D, eindimensional, 2-D, zweidimensionale, NMR-, Kernresonanz-, IR-, Infrarot-, MS n, Masse-Masse spectrometries. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispiel Ko-Regulierung Netzwerk Analyse der Anthocyan-Weg. Koexpression Analysen wurden mit dem PRIME ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) auf den Daten der Basis-Version eingestellt ATTEDII 3 8,2 mit der Pajek Programm ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Positive Korrelationen (r &lt;0,5) werden verwendet, um Netzwerk-Verbindungen herzustellen. Red Knoten: Zwölf Anthocyan enzymatischen Gene (At5g13930, CHS, TT4, Chalkonsynthase; At3g55120, CHALLO, TT5, Chalkon isomerisieren, At3g51240, F3H, TT6, Flavanon 3-Hydroxylase; At5g07990, F3&#39;H, TT7, Flavonoid 3&#39;-Hydroxylase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, Flavonoid-3 - O-Glucosyltransferase; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, Dihydroflavonolreduktase; At4g22880, ANS / LDOX, TT18, Anthocyanidin synthese; At4g14090, A5GT, Anthocyan 5 - O-Glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 &quot;XT, vermeintliche Anthocyan 3 - O-Glucosid 2&quot; - O - Xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, Anthocyan 5 - O-glucosid 6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, Anthocyan 3 - O-glucosid 6 &quot;- O - p-coumaroyltransferase) und zwei Transkriptionsfaktoren für die Anthocyan-Produktion (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) wurde für Benutzer Kandidatengene verwendet Kandidatengene wurden durch einen &quot;Durchschnitt von Mengen&quot; found Suche mit einem Schwellenwert mit einem Koeffizienten von r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 durch Kreuzung der Sätze von allen abgefragten Gene (Vierzehn Anthocyan Biosynthesegene) abgefragt. Eine Co-Expression Netzwerk, einschließlich korrelierten Kandidatengene (68 Gene) und abgefragt Gene (14 Gene), war von einer &quot;Verknüpfung der Sätze&quot; re-konstruiert Suche mit r&gt; 0,50 mit dem PRIME-Datenbank. Die Ausgabe-Dateien, die mit einem &#39;. Net&#39; Datei aus dem Prime-Datenbank und Netzwerke formatiert wurden gezeichnet wurden mit Pajek Software. Blau zeigt an Knoten Kandidatengene, die mit Anthocyan-Gene korreliert. <table border="1"><tbody><tr><td> Spezies </td><td> Dominierenden Sekundärstoffe </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolate, Flavonol, Anthocyan, sinapoyl derivativen </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonol, Anthocyan, Salicylat derivativen </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonol, Anthocyan, Tannin, Stilben </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonol, Anthocyan, Glycoalkaloid, chrologenate verwandten, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonol, Anthocyan, nicotianamide, chrologenate verwandten, acylsugar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, Anthocyan, Sterolderivate </td></tr><tr><td> Zea may </td><td> Glycoflavone, Anthocyan, Benzoxazinon, Sterolderivate </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavone, Anthocyane, Saponin, </td></tr><tr><td> Lotus japonica </td><td> Isoflavone, Flavonol, Anthocyan, Saponin, </td></tr></tbody></table> Tabelle I. Wichtige sekundäre Pflanzenstoffe im Modell Pflanzenarten. <table border="1"><tbody><tr><td> Die Co-Expression Datenbank </td><td> Adresse </td></tr><tr><td> Anlagenbau Kreuz species </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Pflanzenarten </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> HANDELN </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Reis Reihe Datenbank </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabelle II. Erhältlich Genexpression Datenbank für In-silico-Co-Expression-Analyse.

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	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Da Transcriptomics und Metabolomics-Technologien für mehrere Jahre verwendet worden, der Prozess der Datenintegration für Metabolomik unterstützt Gen Annotation beginnt in der Regel mit der Identifizierung eines neuen Peak entspricht einer unbekannten Metaboliten. Diese Tatsache führt zu der nächsten Stufe, die quantitative Varianz in Metabolit Gipfel oder die neuartige Kandidatengene als verantwortlich für ihre Biosynthese zu bewerten ist. Die Strategie in diesem Protokoll beschrieben, jedoch hat drei große Probleme i) Schwierigkeiten bei der Peak-Annotation, ii) Komplexität der Weg Vorhersage, iii) Auflösung von Gen-Informationen und die Qualität der Genexpressionsdaten. Um das erste Problem zu begegnen, sollte Gipfel Annotation mit Co-Elution von Standard-Verbindungen oder kombinatorische Ansatz unter Verwendung von Informationen aus MS n Analyse, Referenz-Extrakt, mutierte Analyse, Metabolit-Datenbank suchen und Literaturstudie (Abbildung 2, 12) durchgeführt werden. Für die sZWEITEN Problem kann nur durch Weg Vorhersage richtig Peak Annotation erreicht werden. Allerdings Metabolite Profiling von Gewebsspezifität auch Unterstützung Gipfel Annotation sein, denn mit den Metaboliten Anhäufung Genexpression von Genen korreliert werden sollte. Daher Kombinationsprofile verschiedener Gewebe und Wachstumsbedingungen kann hilfreich sein für dieses zweite Problem. Das dritte Problem bezüglich der Auflösung von Gen-Informationen hängt von den Fortschritten der Sequenzdaten. Bei der Modellpflanze ohne Abschluss der Genomsequenz, ist Co-Expression-Analyse mit orthologen Genen in anderen Modell Pflanzen nützlich. Detaillierte Ausrichtung Vergleich und Stammbaum-Analyse der Aminosäuresequenz unterstützen können, um Modell-Organismen auf andere Arten zu verbinden. Dieses Protokoll eignet sich für alle Stoffwechsel. Am effektivsten ist es in der Analyse von Zwischen-und sekundären Stoffwechsel, die gut charakterisiert sind, dass die starken transkriptionellen controlle 1,5,11,16. In einigen Beispielen, die Co-Expression-Analyse gelang es, in Schwefel-Assimilation durchgeführt werden, Gene für die β-Oxidation, verzweigtkettige Aminosäure Abbau, Chlorophyll-Abbau und die Lysin-Katabolismus 3, Zellwand 10,7 Stoffwechsel und Licht Signalkaskade 14. Annotation von Genfunktion über kombinierte Genomik, Metabolomik und Informatik ist nicht nur für Biosynthesegencluster und direkter Regulator der Transkriptionsfaktor, sondern auch für das Verständnis physiologischer Vorgang und Response (siehe Beispiel Abbildung 3. 14). Um diesen Ansatz von Modell-Anlagen zu entwickeln Kulturpflanzen, ist Stoffwechsel-Vergleich von über Pflanzenarten, leistungsfähigste Ansatz in einigen allgemeinen Stoffwechsel. Zum Beispiel, wenn dieselbe Verbindung in verschiedenen Pflanzenarten nachgewiesen wird, und einige orthologen Genen in diesen Pflanzenarten gefunden werden, können von Spezies Co-Expression-Analyse mit orthologen Gene liefern strong Unterstützung für Ihre Vorhersage. Dieser Ansatz kann in Arabidopsis durchgeführt werden, Pappel, Medicago, neben wichtigen Kulturen wie Gerste, Reis, Weizen und Soja, durch Co-Expressions-Analyse von Pflanzenarten (6, PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,, 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> ; sehen Sie ein Beispiel, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser ULC / MS-grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitril (ACN) ULC / MS-Klasse </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Methanol (MeOH) ULC / MS-Klasse </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Ameisensäure (HCOOH) ULC / MS-Klasse für die Flüssigchromatographie </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Standard-Verbindungen </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Linearen Ionenfalle (IT) ESI-MS-System Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-System Surveyor </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analytische Säule Luna C18 (2), 2,0 mm Durchmesser, 150 mm Länge, 100 Å PorengrößeGröße und sphärischen Partikeln von 3 mm </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur Software </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

Angesichts der stetig wachsenden Anzahl von Pflanzenarten Modell, für das vollständige Genom-Sequenzen zur Verfügung und die Fülle der Bio-Ressourcen wie Knockout-Mutanten, wilde Beitritte und Fortgeschrittene Populationen gibt es eine steigende Belastung für die Gen-funktionellen Annotation. In diesem Protokoll Annotation von Pflanzen-Gen-Funktion mit kombinierten Co-Expression Genanalyse wird Metabolomik und Informatik zur Verfügung gestellt (Abbildung 1). Dieser Ansatz basiert auf der Theorie der Verwendung von Ziel-Genen bekannter Funktion, damit die Kennzeichnung von nicht-annotierte Gene wahrscheinlich in einem bestimmten Stoffwechsel-Prozess eingebunden werden, mit der Identifizierung von Zielverbindungen über Metabolomics basiert. Strategien freuen für die Anwendung dieser Informationen auf die Bevölkerung von beiden Forward-und Reverse Genetik Ansätze trotz keiner von ihnen erzeugten setzen sind mühelos. Nach Korollar Dieser Ansatz kann auch als ein Ansatz verwendet werden, um unbekannte Peaks für neue oder spezifische se charakterisierendäre Metaboliten in den Geweben begrenzt, Pflanzenart oder Stress-Behandlung, die derzeit die wichtigste Studie zum Verständnis der pflanzlichen Stoffwechsel.

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Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Kombination von Genomics, Co-Expression Gen-Analyse und die Identifizierung von Zielverbindungen über Stoffwechsel-Gen geben funktionellen Annotation.

Annotation of Plant Gene-Funktion über Kombinierte Genomics, Metabolomik und Informatik

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

19.6K Aufrufe.  Max-Planck-Institut. Kombination von Genomics, Co-Expression Gen-Analyse und die Identifizierung von Zielverbindungen über Stoffwechsel-Gen geben funktionellen Annotation.

Serie: Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Forschung

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Eine β-Glucuronidase (GUS) Basierend Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental inputs into stress tolerance, pathogenicity, and other key components of fitness. This manuscript describes a microscope-based assay that tracks approximately 105&#160;Saccharomyces cerevisiae microcolonies per experiment. After automated time-lapse imaging of yeast immobilized in a multiwell plate, microcolony growth rates are easily analyzed with custom image-analysis software. For each microcolony, expression and localization of fluorescent proteins and survival of acute stress can also be monitored. This assay allows precise estimation of strains&#39; average growth rates, as well as comprehensive measurement of heterogeneity in growth, gene expression, and stress tolerance within clonal populations.

Yeast growth phenotypes are precisely measured through highly parallel time-lapse imaging of immobilized cells growing into microcolonies. Simultaneously, stress tolerance, protein expression, and protein localization can be monitored, generating integrated datasets to study how environmental and genetic differences, as well as gene-expression heterogeneity among isogenic cells, modulate growth.

High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of gene expression, miRNAs play key roles in various cellular pathways, including both development and response to a/biotic stress, such as drought and diseases. Having high-quality reference genome sequences enabled identification and annotation of miRNAs in several plant species, where miRNA sequences are highly conserved. As computational miRNA identification and annotation processes are mostly error-prone processes, homology-based predictions increase prediction accuracy. We developed and have improved the miRNA annotation pipeline, SUmir, in the last decade, which has been used for several plant genomes since then. 
This study presents a fully automated, new miRNA pipeline, mirMachine (miRNA Machine), by (i) adding an additional filtering step on the secondary structure predictions, (ii) making it fully automated, and (iii) introducing new options to predict either known miRNA based on homology or novel miRNAs based on small RNA sequencing reads using the previous pipeline. The new miRNA pipeline, mirMachine, was tested using The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, release of the Arabidopsis genome and the International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) wheat reference genome v2.

Herein, we present a new and fully automated miRNA pipeline, mirMachine that 1) can identify known and novel miRNAs more accurately and 2) is fully automated and freely available. Users can now execute a short submission script to run the fully automated mirMachine pipeline.

mirMachine: Ein One-Stop-Shop für pflanzliche miRNA-Annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

Bestimmung der dreigliedrigen Wechselwirkung zwischen zwei Monomeren eines MADS-Box-Transkriptionsfaktors und eines Calcium-Sensorproteins mittels BiFC-FRET-FLIM-Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...