Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) zu MM unterstützt. Unser Artikel ist teilweise von Carl Zeiss MicroImaging GmbH unterstützt.

Reaktive Sauerstoffspezies können in lebende Zellen mit Oxidations-Farbstoffen (1 &amp; 2) oder unter Verwendung von Plasmid-Sensoren (3 &amp; 4) durch konfokale Mikroskopie gemessen werden. 1. Visualisierung der cytosolischen ROS in J774-Zellen <ol><li> Wachsen J774.1 Maus Monozyten-Makrophagen (10 6 Zellen / ml) auf Glasboden 35-mm-Platten (Harvard Apparatus) für 48 h. </li><li> Challenge-Zellen mit TLR-Agonisten (2 pg / ml, Lipo-Teichonsäure-TLR2-Agonist, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3 Agonist, 1 pg / ml LPS-TLR4-Agonist) für 6 h bei 37 ° C. Hinweis: Makrophagen unter ähnlichen Bedingungen behandelt wurden, für die Co-Kultur-Modell Ca 2 + Mobilisierung eingesetzt. </li><li> Fügen Sie die Oxidations-Farbstoff H 2 DCF-DA (Invitrogen) in einer Endkonzentration von 10 uM in ECM (extrazelluläre Medium zu geben: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10mM Glucose und 2,0% Dextran, pH 7,4; alle von Sigma) mit 2% BSA, Gerichte und inkubieren Zellen für 20 min vor der Anzeige unter der konfokalen Mikroskopie. </li><li> Nach Farbstoff Laden, visualisieren Zellen auf eine Temperatur gesteuerte Phase der eine entsprechende Imaging-System gelegt. Wir verwenden Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System mit Argon-Ionen-Laser-Quelle bei einer Anregung von 488 nm für die DCF-Fluoreszenz mit 40x Öl-Objektiv 13 (Abb. 1A und D) gekoppelt. </li><li> Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1,44), frei verfügbare Software von der National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. Visualisierung der MROS in J774-Zellen <ol><li> Wachsen J774.1 Maus Monozyten-Makrophagen (10 6 Zellen / ml) auf Glasboden 35-mm-Platten (Harvard Apparatus) für 48 h. </li><li>Fordern Sie die Zellen mit TLR-Liganden an die Meldestelle zu induzieren (2 pg / ml, Lipo-Teichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. </li><li> Add mitochondrialen Superoxid-Indikator MitoSOX Red (Invitrogen) in einer Endkonzentration von 5 uM in ECM mit 2% BSA, Gerichte und inkubieren Zellen für 30 min bei 37 ° C, damit geben Laden MitoSOX Red. </li><li> Nach Farbstoff Laden, visualisieren Zellen auf eine Temperatur gesteuerte Phase eines Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System Paar mit Argon-Ionen-Laser-Quelle bei einer Anregung von 561 nm für MitoSOX Red-Fluoreszenz mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 1B und E). </li><li> Zur Kontrolle Experimente nach Farbstoff zum Laden PBS oder DMSO (negative Kontrolle) oder 2 um Antimycin A (als mitochondriale Superoxid-Generator-positive Kontrolle), um Zellen vor der Bild der Probe in 2,4 (Abb. 1C) beschrieben. </li><li> Analysieren Sie die Bilder mit ImageJ Software (1,44). </li></ol> 3. Visualizatiauf der cytosolischen ROS in stabilen Hyper-Zyto MPMVECs <ol><li> Wir verwenden Phyper-Zyto (Evrogen) eine Säugerexpressionsvektor Kodierung eines fluoreszierenden Sensor HyPer, dass in das Zytoplasma und speziell Sinne submikromolaren Konzentration von H 2 O 2 14 lokalisiert. </li><li> Transfizieren Murine Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen (MPMVECs) mit Phyper-Zyto-Vektor entweder Elektroporation oder Transfektionsreagenzien. Wir verwenden 10 x 10 6 Zellen und transfizieren mit 10 ug von Phyper-Zyto via Elektroporation mit BioRad Gene Pulser Elektroporator System (250V, 500 mF). Kultur MPMVECs in DMEM Medium mit 10% FBS, essentielle Aminosäuren, endothelial growth ergänzen und Antibiotika. Hinweis: Nach der Transfektion Platte Zellen bei geringer Dichte Kolonie Wachstum zu erleichtern. </li><li> Ersetzen Medium mit komplettem Kulturmedium mit 500 pg / ml G418, 48 Stunden nach Transfektion ergänzt. Screen für Klone, die höchsten Prozentsatz von H haben<html> yper positive Zellen und Passage HyPer positive Klone, die Anzahl von Hyper-positiven Zellen (Abb. 2) zu erhöhen. Hinweis: Wir verwenden Verdünnungsreihe von Zellen für die klonale Selektion einzelner Zellen und Bildschirm für eine stabile Zellen hochexprimierenden HyPer. </li><li> Wachsen stabil Hyper-Zyto MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete Deckgläser (80% Konfluenz). Am nächsten Tag Herausforderung Zellen mit TLR-Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. Unbehandelte Zellen dienen als Kontrolle. </li><li> Nach der Behandlung, montieren Sie die Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). 1ml von pre erwärmt Hanks balanced salt solution (HBSS) in die Kammer und Ort der Kammer auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System. Visualisieren und Bild Fluoreszenz ändern bei einer Anregung von 488 nm mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 3A und D). </li><li> Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6). </li></ol>itel &quot;&gt; 4. Visualisierung der mitochondrialen ROS in stabilen Hyper-dMito MPMVECs <ol><li> Wir verwenden Phyper-dMito (Evrogen) eine Säugerexpressionsvektor Kodierung Mitochondrien gezielte HyPer, dass in den Mitochondrien und speziell Sinne submikromolaren Konzentration von H 2 O 2 lokalisiert. </li><li> Transfizieren MPMVECs mit Phyper-dMito und generieren stabile Hyper-dMito MPMVECs folgenden Schritte in Abschnitt 3,2-3,3 beschrieben. </li><li> Wachsen stabil Hyper-dMito MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete Deckgläser (80% Konfluenz). </li><li> Am nächsten Tag Herausforderung Zellen mit TLR-Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. Unbehandelte Zellen dienen als negative Kontrolle. Add 2 um Antimycin A (mitochondriale Superoxid-Induktor-positive Kontrolle) vor der Visualisierung Probe. </li><li> Nach der Behandlung, montieren Sie die Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). Add 1 ml vorgewärmten Hanks balanced salt solution (HBSS) in die KammerOrt und die Kammer auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System. Visualisieren und Bild Fluoreszenz ändern bei einer Anregung von 488 nm mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 3B, C und E). </li><li> Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6). </li></ol> 5. Co-Kultur-Modell zur Visualisierung von parakrine-derived ROS ausgelöst Ca 2 +-Signalisierung in Endothelzellen Für die Visualisierung und Messung von [Ca 2 +] i Änderungen, die wir verwenden eine Ca 2 + Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM (Invitrogen). <ol><li> Wachsen MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete 25 mm Deckgläser (80% Konfluenz). </li><li> Inkubieren Sie die Zellen auf Deckgläsern bei Raumtemperatur gewachsen für 30 min in ECM mit 2% BSA und 0,003% Pluronsäure mit 5 uM Fluo-4 AM (Invitrogen) Endkonzentration zu ermöglichen Beladung von Fluo-4 AM. Nach dem Laden, waschen Sie die Zellen mit experimentellen Imaging-Lösung (ECM mit 0.25% BSA) mit Sulfinpyrazon zu färben Verlust zu minimieren. </li><li> Nach dem Laden Fluo-4, mount Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). Fügen Sie 800μl der pre erwärmt experimentellen Imaging-Lösung in die Kammer und legen Sie es auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System. </li><li> Mäuse (Behandlung mit LPS für 6 Stunden) mit Zell-tracker rot CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) in ECM mit 2% BSA - In einem separaten Röhrchen beschriften Sie die aktivierten oder aktivierte Makrophagen entweder von Wildtyp-oder gp91 phox-/ isoliert und 0,003% Pluronsäure. Waschen und die Zellen mit 200 ul der experimentellen Imaging-Lösung. </li><li> Add gekennzeichnet Makrophagen an fluo-4 AM beladen MPMVECs in die Kammeranordnung. </li><li> Notieren Sie die grüne und rote Fluoreszenz alle 3s für 10-20 min mit Carl Zeiss LSM510 Meta konfokalen Imaging-System mit einem Argon-Ionen-Laser-Quelle mit einer Anregung bei 488 und 561 nm für die Fluo-4 AM-und Zell-tracker rote Fluoreszenz respectively (Abb. 4 AC). Hinweis: Alternativ J774.1 Zelllinie verwendet werden, um MPMVECs Ca 2 + Mobilisierung auslösen werden. </li><li> Analysieren Fluo-4 Fluoreszenz-Intensität Änderungen mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6). </li></ol> 6. Datenanalyse mit ImageJ Software Übertragen Sie die Bilder aus dem konfokalen System als. Lsm Formatdatei für die Datenanalyse erhalten. ZEN 2009 und ZEN 2010 Software mit LSM 510 Meta konfokalen Mikroskop LSM oder zur Verfügung gestellt 710 Multiphotonen konfokalen Mikroskop bzw. speichert Dateien in. Lsm Format. Wir empfehlen, diese native. Lsm Dateien für die Bildanalyse als ursprüngliche Qualität erhalten bleibt. Dieses Dateiformat kann direkt in der Bildanalyse-Programm Bild J. geöffnet werden Die folgenden Schritte bieten ein Beispiel quantitative Analyse der einzelnen Bildes. Keine zusätzlichen Plugins sind für diese Datenanalyse benötigt. <ol><li> Open. Lsm oder. TIFF-Datei in Image J-Programm mit Datei&gt; Öffnen </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte BILD&gt; COLOR&gt; SPLIT Kanäle und spaltete die grüne und DIC-Kanäle. Verwenden Sie das Bild aus dem grünen Kanal für die spätere Analyse. </li><li> Doppelklicken Sie auf und wählen Sie die &quot;elliptische Pinsel Auswahl&quot; und stellen die Pixel-Wert auf 20. </li><li> Für Hyper-Zyto Bilder, auf einer einzigen Zelle, um die kreisförmige Fläche von Messung zu definieren klicken. Dann drücken Sie &quot;M&quot;-Taste, um die Intensität des ausgewählten Bereichs zu messen. Die Werte werden in einem neuen Fenster Ergebnisse erhalten. </li><li> Next by holding &quot;Shift&quot;-Taste klicken Sie auf eine andere Zelle in einen anderen Bereich, mit der Taste &quot;M&quot;-Taste gefolgt wählen. Die Intensität wird in das Ergebnis-Fenster aufgezeichnet. Wiederholen Sie die Schritte 4-5 auf 50 verschiedenen Zellen. </li><li> Für Hyper d-mito Bilder, stellen Sie die Pixel-Wert auf 10 in den Elliptical Pinsel Auswahl. Region of Interest (ROI) muss manuell mit den Mitochondrien von bestimmten Zellen zurückgeführt werden. </li><li> Mit Freehand, verfolgen Sie die Region rund um den Mitochondrien und drücken Sie dann die &quot;M&quot;. Wiederholen Sie die Schritte 6-7 auf 50 verschiedenen Zellen. </li><li> Kopieren Sie die mich<html> und Werte aus dem Ergebnis-Fenster und fügen Sie ihn in einem Excel-Sheet oder eine Software, um die Ergebnisse Grundstück. Wir verwenden entweder SigmaPlot oder Graphpad PRISM, um die Daten als Grafik Grundstück. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt zytosolischen und mitochondrialen ROS-Produktion nach Herausforderung mit TLR-Liganden. Vertreter konfokalen Aufnahmen zeigen Zunahme von DCF (cytosolische) und MitoSOX Red (Mitochondrien) Fluoreszenz nach 6 h Stimulation. Fluoreszenz-Änderungen wurden normalisiert und als facher ausgedrückt. Abbildung 2 zeigt die Erzeugung von stabilen Hyper-Zyto-und Hyper-dMito Endothelzellen. Maus-Endothelzellen wurden mit Phyper-Zyto oder Phyper-dMito Plasmid-Konstrukte mittels Elektroporation transfiziert. Cells stabil exprimieren Plasmide wurden mit G418 für zwei Wochen gewählt. Nach der Selektion wurden verdünnten Zellen in 96-Well-Platten ausgesät. Einzelne Kolonien wurden isoliert und bebildert für homogene Ausdruck. e_content &quot;&gt; Abbildung 3 zeigt die Messung der Endothelfunktion zytosolischen und mitochondrialen H 2 O 2 Ebenen. Representative konfokalen Aufnahmen zeigen Zunahme der Hyper-Zyto (cytosolische) und Hyper-dMito (Mitochondrien) Fluoreszenz nach 6 h Stimulation. Fluoreszenzintensität Veränderungen normalisiert wurden und als-fache Veränderung zum Ausdruck gebracht. Abbildung 4 zeigt die Bewertung der Makrophagen-abgeleitete ROS induzierte endotheliale cytosolischen Ca 2 +-Mobilisierung. LPS-stimulierte Makrophagen wurden auf pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVEC), die zuvor mit der intrazellulären Ca 2 geladen hatte hinzugefügt + ([Ca 2 +] i) Indikatorfarbstoff Fluo-4. Die Anwendung des Wildtyp-LPS-aktivierten Makrophagen hervorgerufen ein [Ca 2 +] i Anstieg in PMVECs dass abgeschwächt durch Knockout von funktionellen NADPH-Oxidase wurde (gp91 phox-/ -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Visualizatiauf der Makrophagen generiert zelluläre ROS und der mitochondrialen Superoxid. J774.1 Zellen wurden mit TLR2, 3 und 4 Liganden in Frage gestellt (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4). 6 h bei 37 ° C. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit geladenen (A) zelluläre ROS-Indikator (H 2 DCF-DA; grüne Fluoreszenz) oder (B) mitochondrialen Superoxid-Indikator (MitoSOX Red, rote Fluoreszenz). (C) Antimycin A wurde als positive Kontrolle für mitochondriale ROS-Produktion verwendet. Fluoreszenzintensität Veränderungen wurden anhand der konfokalen Mikroskopie. (D) und (E) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz ändern. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Generierung von stabilen Expression von endothelialen Zellen zytosolischen und mitochondrialen ROS Indikatoren. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. V. isualisierung der endothelialen zytosolischen und mitochondrialen H 2 O 2 Ebenen MPMVECs stabil exprimieren (A) Hyper-Zyto oder (B) Hyper-dMito wurden mit TLR2, 3 und 4 Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2 herausgefordert; 10 ug / ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. (C) Antimycin A wurde als positive Kontrolle für mitochondriale ROS-Produktion verwendet. Nach der Behandlung wurden Fluoreszenzintensität Veränderungen beurteilt mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. (D) und (E) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz ändern. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Makrophagen-abgeleitete ROS entlocken beeinträchtigt Endothelzellen Ca 2 +-Mobilisierung. (A) Schematische Darstellung von Endothelzellen / Makrophagen-Co-Kultur-Modell zu studieren. (B) Frisch isolierte murine Makrophagen sowohl aus WT und gp91phox null Mäuse (The Jackson Laboratory) wurden von 1 pg / ml LPS für 6 h aktiviert MacropHages wurden mit Zell-tracker Red (rot) markiert und fügte hinzu, auf Fluo-4 beladen PMVECs (grün) bis parakrine O 2 • zu beurteilen, -. Signalisierung (C) LPS-aktivierten Makrophagen von WT Mäusen isoliert ausgelöst große und schnelle Ca 2 +-Mobilisierung in PMVECs zu Makrophagen aus gp91phox null Mäusen verglichen. Validierung von Makrophagen-Aktivierung wurde bereits unter Beweis gestellt.

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	<li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis.">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li><li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes.">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .</li><li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis.">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li><li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release.">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li><li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidants+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing.">Oxidants oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li><li>Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies in lebenden Zellen entweder durch Oxidation Farbstoffe oder Plasmid-Sensoren. Agonisten der TLRs (Toll-like-Rezeptoren) sind Verbindungen, die Zellen durch die TLRs präsentieren auf der Zelloberfläche zu stimulieren und lösen die nachgeschalteten Signalwege 15. In unserem Protokoll haben wir drei verschiedene TLR-Agonisten nämlich, Lipo-Teichonsäure-TLR2-Agonist, Poly (I: C). TLR3-Agonist, LPS...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Attofluor Zellkammer </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM Low Glucose-Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> Endothelial Growth Factor ergänzen (ECGS) </td><td> Upstate </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Red </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I Reduzierte Serum Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> Phyper-Zyto </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> Phyper-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poly (I: C) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Prism Software 5.0 </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11,0 </td><td> Systat Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 Flaschen </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T-75 Flaschen </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96-Loch-TC Mikro-Well-Platte </td><td> BD Falcon </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Zen 2009 Software </td><td> Carl Zeiss 510 META konfokale Mikroskopie </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

Oxidativer Stress ist in einer Reihe von pathologischen Bedingungen, einschließlich Ischämie / Reperfusionsschaden und Sepsis in Verbindung gebracht. Das Konzept von oxidativem Stress bezieht sich auf die abweichende Bildung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies), die O 2 • gehören -, H 2 O 2 und Hydroxylradikale. Reaktive Sauerstoffspezies beeinflusst eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Signaltransduktion, Zellproliferation und Zelltod 1-6. ROS haben das Potenzial, Gefäß-und Organ-Zellen direkt schädigen, und kann sekundäre chemische Reaktionen und genetischen Veränderungen, die letztlich zu einer Verstärkung der ersten ROS-vermittelte Gewebeschäden führen zu initiieren. Ein wichtiger Bestandteil der Verstärkung Kaskade, die irreversible Gewebeschäden verschärft wird die Rekrutierung und Aktivierung von zirkulierenden Entzündungszellen. Während einer Entzündung, entzündliche Zellen Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) und Interleukin-1, dieaktivieren Endothelzellen (EC) und Epithelzellen und weiteren ergänzen die entzündliche Antwort 7. Vaskuläre endotheliale Dysfunktion ist ein fester Bestandteil der akuten Entzündung. Makrophagen dazu beitragen, die endotheliale Dysfunktion bei Entzündungen, die durch Mechanismen, die unklar bleiben. Die Aktivierung von Makrophagen Ergebnisse in der extrazellulären Freisetzung von O 2 • - und verschiedene pro-inflammatorische Zytokine, die pathologischen Signalisierung in benachbarten Zellen 8 auslöst. NADPH-Oxidasen sind die wichtigsten und primären Quelle von ROS in den meisten Zelltypen. In jüngster Zeit ist es von uns und anderen gezeigt, dass 9,10 ROS durch NADPH-Oxidasen produziert der mitochondrialen ROS-Produktion bei vielen pathophysiologischen Bedingungen zu induzieren. Daher Messung der mitochondrialen ROS-Produktion ebenso wichtig ist neben der Messung cytosolische ROS. Makrophagen produzieren ROS durch die Flavoprotein Enzym NADPH-Oxidase, die eine primäre Rolle bei Entzündungen spielt. Einmal aktiviert,phagocytic NADPH-Oxidase produziert reichlich O 2 • -, die wichtig sind in der Abwehrmechanismus des Wirts 11,12. Obwohl parakrine-derived O 2 • - spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Gefäßerkrankungen, Visualisierung von parakrine ROS-induzierte intrazelluläre Signalwege wie Ca 2 +-Mobilisierung ist noch Hypothese. Um ein Signal zu benachbarten Endothelzellen transduzieren - Wir haben ein Modell, in dem aktivierten Makrophagen als Quelle von O 2 • verwendet werden entwickelt. Mit diesem Modell zeigen wir, dass Makrophagen-derived O 2 • - auf Calcium-Signalgebung in angrenzenden Endothelzellen führen.

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Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Eine effiziente Methode, um Einblicke in die Visualisierung der parakrine-derived ROS-Induktion von endothelialen Ca2 + Signal-Verstärkung wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Messung parakrine abgeleitete ROS ausgelöst Ca2 +-Mobilisierung in vaskulären Endothelzellen in einer Co-Kultur-Modell.

Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

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JoVE Journal

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Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

15.4K Aufrufe.  Temple University. Eine effiziente Methode, um Einblicke in die Visualisierung der parakrine-derived ROS-Induktion von endothelialen Ca2 + Signal-Verstärkung wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Messung parakrine abgeleitete ROS ausgelöst Ca2 +-Mobilisierung in vaskulären Endothelzellen in einer Co-Kultur-Modell.

Serie: Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Forschung

Biologie

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Eine proximale Kultur-Methode zu studieren, Parakrine Signale zwischen Zellen

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells downstream of pattern recognition receptors. Best studied are the Dectin-1 and Dectin-2 members of the C-type lectin-like receptor family that induce a SYK- and CARD9-dependent signaling cascade leading to NF-&#954;B activation, in a MALT1-dependent manner. By contrast, Toll-like receptors (TLR), such as TLR-4, propagate NF-&#954;B activation but signal via an MYD88/IRAK-dependent cascade. Nonetheless, whether MALT1 might contribute to TLR-4 signaling has remained unclear. Recent evidence with MLT-827, a potent and selective inhibitor of MALT1 paracaspase activity, indicates that TNF- production downstream of TLR-4 in human myeloid cells is independent of MALT1, as opposed to TNF- production downstream of Dectin-1, which is MALT1 dependent. Here, we addressed the selective involvement of MALT1 in pattern recognition sensing further, using a variety of human and mouse cellular preparations, and stimulation of Dectin-1, MINCLE or TLR-4 pathways. We also provided additional insights by exploring cytokines beyond TNF-, and by comparing MLT-827 to a SYK inhibitor (Cpd11) and to an IKK inhibitor (AFN700). Collectively, the data provided further evidence for the MALT1-dependency of C-type lectin-like receptor &#8212;signaling by contrast to TLR-signaling.

MALT1 regulates innate immunity but how this occurs remains ill-defined. We used the selective MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 to unravel the contribution of MALT1 to innate signaling downstream of Toll-like or C-type lectin-like receptors, demonstrating that MALT1 regulates the production of myeloid cytokines, and downstream of C-type lectin-like receptors, selectively.

Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...