Wir erkennen die Unterstützung des Department of Biological Engineering und Christopher S. Bond Life Sciences Center der University of Missouri. Wir erkennen an Zuschüssen aus Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 und NIH R21CA139186-0. Wir danken auch den Life Sciences Undergraduate Research Opportunity Program an der University of Missouri, der University of Missouri Molekulare Zytologie Core, und der University of Missouri College of Engineering für die finanzielle Unterstützung.

1. Blut Probenvorbereitung <ol><li> Zeichnen Sie ca. 10 ml Vollblut aus einer Stage IV Cancer Patient in zwei 5 ml Vacutainer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 10 Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute (rpm). </li><li> Die Blutprobe wird in drei verschiedenen Schichten zu trennen: die unterste Schicht besteht aus den Erythrozyten, die mittlere Schicht, auch genannt der Buffy-Coat, enthält Leukozyten und Melanom-Zellen, und die oberste Schicht enthält Plasma und Thrombozyten. Entfernen Sie so viel Plasma wie möglich, ohne den Buffy-Coat. </li><li> Legen Sie 250 ul Histopaque 1077 in zwei 1 mL Wintrobe Röhren. </li><li> Mit einem 9 &quot;Pasteur Pipette, extrahieren Sie die verbleibende Plasma, das gesamte Buffy-Coat, und sogar die oberste Schicht der Erythrozyten, achten Sie darauf, &lt;500 ul zu sammeln. </li><li> Legen Sie die Lösung der Spitze der Histopaque Schicht und zentrifugieren Wintrobe Röhren in 15 ml konische Röhrchen für 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Das Blut wird wiedertrennen, aber dieses Mal den Erythrozyten wird durch die Histopaque getrennt werden, erlaubt eine einfache Extraktion der Buffy-Coat. Verwenden Sie eine 9 &quot;Pasteur Pipette auf die gesamte Buffy-Coat erhalten und legen Sie es in ein 2 ml-Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Suspend der Buffy-Coat in 1,5 ml PBS mit 2% v / v Tween 20. </li></ol> 2. Flusskammer Construction <ol><li> Erhalten Sie Acryl-Zylinder, 20 mm Außendurchmesser, 17 mm Innendurchmesser und 8 mm hoch. Bohren Sie drei 5 mm Durchmesser Löcher durch die Seite des Zylinders bei 90 Grad-Winkel voneinander ab. Cut drei Stücke von Polymer-Schlauch (1,6 mm Innendurchmesser, 5 mm Außendurchmesser), und legen Sie sie in die gebohrten Löcher. </li><li> Stretch Parafilm über den unteren Rand der Acryl-Ring, um eine wasserdichte Abdichtung zu machen. Der Parafilm bildet eine flache Schüssel mit der Acryl-Ring und die Acrylamid-Lösung, die eine Strömungskammer Form halten wird. </li><li> Suspend einem 1,6 mm Durchmesser Draht durch die Schlauchstücke, dass gegenüber sindeinander, um sicherzustellen, dass der Draht allein sichtbar durch die Mitte des Rings. Füllen Sie das dritte Stück Schlauch mit einem 1,6 mm Draht mit einem Durchmesser und Position der Röhre 1 mm von der abgehängten Draht. Diese Drähte zu verhindern Acrylamid vom Betreten des Schlauch. Nach dem Acrylamid erstarrt, die Drähte werden extrahiert werden, wobei ein zylindrischer Strömungsweg und einen Ort, eine optische Faser Position konzentriert sich auf den Strömungsweg. </li><li> 5 ml vorbereitet Acrylamid [20 g Acrylamid (Sigma Aldrich), 0,7 g Bisacrylamid (Sigma Aldrich), 100 ml destilliertem Wasser], um einen kleinen Becher. Messen Sie 0,02 g Ammoniumpersulfat (Sigma) und fügen Sie ihn in das Becherglas. Mix mit einem Rührstab für 3 Minuten. Add 20 uL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) in das Becherglas. Schnell gießen Sie die Mischung in die Acryl-, Befüllen an die Spitze. Nach ein paar Sekunden, wird die Lösung Gel, wodurch eine Strömungskammer Form. Ziehen Sie das Kabel aus, was sicher nicht auf die Acrylamid-Gel zu stören. Der Fluss Chamber ist nun einsatzbereit. </li></ol> 3. Photoakustische Flowmetrie Set-up <ol><li> Akustisch Paar eine Polyvinylidenfluorid piezoelektrischen Wandler (Panametrics), um eine Flusskammer mit Ultraschall-Gel direkt über dem Strömungsweg. </li><li> Mit einem Bajonett Neill-Concelman (BNC)-Kabel, schließen Sie den Sensor an den Eingang eines RITEC Broadband Receiver-640A (Tiefpassfilter: out, Hochpassfilter: 1 MHz, Eingangsimpedanz: 50 Ohm, Verstärkung: 35 dB). Verbinden Sie den Ausgang des Filters mit dem Oszilloskop (Tektronix TDS 2024B). Zum Auslösen des Oszilloskops ist eine Photodiode (Thorlabs) in der Nähe des Wandlers eingestellt und wird in das Oszilloskop mit einem BNC-Kabel eingesteckt. </li><li> Ein T-Stecker (Small Parts) ist es, einen Arm des Flusses Kammer befestigt. Zwei Spritzenpumpen (Braintree Scientific) auf die anderen Zweige der Stecker angeschlossen. Eine Spritze enthält Luft, während die andere die Zellsuspension in Teil 1 hergestellt enthalten wird. Stellen Sie den Durchfluss zu100 ul / Minute. </li><li> Extrahieren Sie die kleinen Schlauch der Flusskammer, bis eine kleine Luftblase bildet, und legen Sie eine 1 mm Kerndurchmesser optische Faser mit einem 0,37 numerischer Apertur in diesem Slot. Füllen Sie die Tasche mit Wasser-Schnittstelle Signale zu reduzieren und erhöhen die Menge des Laserlichts angewendet, um den Fluss Weg. Aufgrund der numerischen Apertur der optischen Faser und kurze Entfernung zu den Strömungsweg, wird der Laser nur bestrahlen ein Schluck Probe jederzeit sichergestellt, dass die Probe direkt vor der Laser die gleiche Probe zu schaffen photoakustischen Signale. Die Laserenergie sollte ca. 28 mJ / cm 2 mit einem Spot-Größe von 7 mm 2. </li><li> Drehen Sie die beiden Spritzenpumpen auf. Wenn die beiden nicht mischbaren Flüssigkeiten der T-Kreuzung erreichen sie in homogene Schnecken und Strom an den Wandler partitioniert werden. </li><li> Bestrahlen die fließende Probe mit einem Nanosekunden gepulsten Laser zu photoakustische Wellen in der Melanom-Zellen zu erzeugen. Da Melanin ist ein broadbund optische Absorber können alle sichtbaren Laser-Wellenlänge verwendet werden. </li><li> Wenn ein Signal auf dem Oszilloskop, wenn eine Schnecke befindet sich auf dem Wandler enthält die slug Melanom, und sollte durch das System bis zum Ablegen in eine Sammlung Fläschchen verfolgt werden. </li></ol> 4. Immunzytochemie <ol><li> Nehmen Sie die gefangenen Schnecken zu einem Cytospin 4 Zentrifuge (Thermo Scientific), um sie zu Glasträger zu fixieren. Legen Sie Glasträger in Cytofunnels (Shandon EZ Einzelzimmer Cytofunnel mit Brown Filter Karte Thermo Scientific) und laden Sie sie in die Cytospin 4 Zentrifuge. Legen Sie 100 ul 1% Rinderserumalbumin (Sigma) in PBS in jedes Trichter und dann Zentrifuge bei 600 rpm für 3 Minuten, um die aufgenommenen Zellen Stick an die Glasträger. </li><li> Nach Zentrifugation, fügen Sie die Zellproben, die Cytofunnels und dann Zentrifuge bei 600 rpm für 3 Minuten. Dann sprühen die Folien mit einem Ethanol-Fixiermittel. </li><li> Waschen Sie die Folien in PBS für 10 Minuten zweimal. </li><li&gt; So blockieren Sie eine unspezifische Bindung, inkubieren jede Folie mit einer Mischung von 10 ul Ziegenserum (Sigma) und 90 &amp;mgr; l PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Inkubation, dekantieren die Folien und inkubieren mit dem Primärantikörper-Lösung für 1 Stunde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Jede Folie sollte 1% MART-1-Antikörper in Kaninchen angehoben, 1% CD-45 Antikörper in der Maus erhöht, 10% Ziegenserum und 89% PBS. </li><li> Nach der Inkubation der Objektträger in PBS für 10 Minuten dreimal. </li><li> Die Folien werden dann in einem zweiten Antikörper-Lösung, die Fluorophor an die Antikörper gebunden hat inkubiert. Die Mischung enthält 0,05% Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, 0,05% Ziege-anti-Maus-Antikörper, 0,1% Ziegenserum und 99% PBS. Die Folien sind in der Dunkelheit für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. </li><li> Nach der Inkubation, dekantieren Waschen der Objektträger in PBS für 5 Minuten dreimal. </li><li> Um Flecken für einen Kern, inkubieren Sie die Zellen mit 0,1 ug / ml DAPI (Invitrogen) für1 Minute. Dann abgießen die Folien und waschen in PBS. </li><li> Montieren Sie ein Deckglas über die Zelle Probe mit 20 mL einer Harz-Basis Eindeckmittel pro Folie. Deckglasränder mit klarem Nagellack, um die Folie zu erhalten. Jetzt die Folien sind bereit, mit einem Fluoreszenz-Mikroskop abgebildet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die photoakustische Wellenformen von weißen Blutkörperchen und Melanomzellen werden hier gezeigt. Die weißen Blutkörperchen, die keine inhärente Pigmentierung, erzeugen keine photoakustische Wellen und manifestieren sich als eine flache Linie von elektronischem Rauschen (links). Die pigmentierten Melanomzellen produziert einen robusten photoakustischen Welle (rechts). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Nach immunzytochemische Färbung zeigen kultivierten Melanomzellen DAPI Signale in blue während MART1 ist grün markiert. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Überlagerung Bilder für DAPI und MART1, wie in Abbildung 2, mit CD45 als ein Indikator für Leukozyten, zeigt diese Figur Melanomzellen unter mehreren weißen Blutkörperchen.

<ol>
	<li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells.">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li><li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+approaches+to+isolation+and+characterization.">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li><li>Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+melanoma+cells+in+human+blood+using+photoacoustic+flowmetry.">Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry.</a> , 106-109 (1985).</li><li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system.">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li><li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction.">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li><li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li><li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li><li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma:+clinical+implications.">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li><li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers:+a+review.">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li><li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance.">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li></ol>

John A. Viator ist Gründer und Präsident von Viator Technologies Inc, ein Unternehmen gegründet, um photoakustische Technologien für die Verbesserung der menschlichen Gesundheit zu vermarkten.

Erkennen CTC ist immer noch eine forschungsintensive Bereich mit sehr wenigen klinischen Anwendungen durch das schwierige Problem der Isolierung der seltenen Tumorzellen. Viele andere Techniken werden für CTC Nachweis, einschließlich der RT-PCR, mikrofluidische Zelle zu erfassen, immunomagnetische zu erfassen, und andere Methoden 8-12 bewertet. Allerdings versprechen photoakustischen Detektion von CMC zeigt, wie es Etikett ist kostenlos und bietet eine schnelle und genaue Möglichkeit, um kleine, Licht absorbierenden Partikeln zu erfassen. Das Protokoll beschriebenen weißen Blutkörperchen zu isolieren ist hoch effizient, noch eine geringe Anzahl von roten Blutkörperchen in der Probe vorhanden sind. Diese rouge kontaminierenden Zellen absorbieren auch Laserlicht, aber mit einer deutlich verringerten Niveau. Um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen nicht mit unseren Melanom Detection System stören, wurden fünf gesunde Patientenproben durch das System eingeführt und keiner gab ein Signal, was darauf hinweist, dass rote Blutkörperchen vorhanden sind, bei ausreichend niedrigen Konzentrationen zuwerden nicht berücksichtigt. Eine Reihe von Konzentration Studien wurden durchgeführt unter Verwendung von kultivierten Melanomzellen und die photoakustische Flow System empfindlich auf 1 Zelle / ul (unveröffentlichte Daten) bewährt. Diese Studien sind im Gange und wird bald auch Studien mit Krebspatienten Proben. Diese photoakustischen Technik wird auch für den Einsatz in nicht-pigmentierten CTC, wie Brust-und Prostatakrebs durch das Anbringen exogene Chromophore ausgewertet. Wir haben Vorarbeiten mit Gold-Nanopartikeln auf Krebs cells13 durchgeführt. Diese Tests haben gezeigt, dass Nanopartikel können die notwendigen optischen Absorption liefern, um photoakustische Wellen erzeugen. Die übrigen technischen Herausforderung besteht darin, solche Partikel, um Krebszellen gezielt an.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of circulating melanoma cells using photoacoustic flowmetry

Zirkulierender Tumorzellen (CTC) sind jene Zellen, die aus einer makroskopischen Tumor getrennt haben und die Verbreitung durch die Blut-und Lymphsystem, Saatgut Zweittumoren 1,2,3. CTC sind Indikatoren für metastasierte Erkrankung und deren Nachweis in Blutproben verwendet werden, um Krebs zu diagnostizieren und zu überwachen das Ansprechen eines Patienten auf die Therapie sein. Da CTC selten sind, bestehend aus etwa einer Tumorzelle unter Milliarden von normalen Blutzellen in fortgeschrittenen Krebspatienten, deren Nachweis und die Zählung ist eine schwierige Aufgabe. Wir nutzen die Anwesenheit von Pigment in den meisten Melanomzellen zu generieren photoakustische oder laserinduzierten Ultraschallwellen in einem benutzerdefinierten Durchflusszytometer für den Nachweis von zirkulierenden Melanomzellen (CMC) 4,5. Dieser Prozess beinhaltet die Trennung einer Vollblut-Probe durch Zentrifugation und Gewinnung der weißen Blutkörperchen Schicht. Wenn im Vollblut, wird CMC mit der weißen Blutkörperchen aufgrund ähnlicher Dichte zu trennen. Diese Zellen sind in resuspendiertPhosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und in die Durchflussmesser. Anstatt einen kontinuierlichen Fluss des Blutes Zellsuspension induzierten wir Zweiphasenströmung, um diese Zellen für eine weitere Studie zu erfassen. In zwei Phase-flow, zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten in einem mikrofluidischen System an einer Kreuzung und bilden abwechselnd Schnecken von flüssigem 6,7 entsprechen. PBS suspendiert weißen Blutkörperchen und Luft bilden Mikroliter Schnecken, die nacheinander mit Laserlicht bestrahlt werden. Die Zugabe eines Tensids in die flüssige Phase ermöglicht eine einheitliche slug Bildung und der Anwender kann in verschiedenen Größen Schnecken durch die Veränderung der Volumenströme der beiden Phasen zu schaffen. Slugs von Luft und Schnecken von PBS mit weißen Blutkörperchen enthalten keine Licht-Absorber und damit nicht produzieren photoakustische Wellen. Allerdings absorbieren Nacktschnecken der weißen Blutkörperchen, die sogar einzelne CMCs enthalten Laserlicht und produzieren hochfrequente Schallwellen. Diese Schnecken, die photoakustische Wellen erzeugen werden abgetrennt und gesammelt für cytochemische Färbung für EichATION von CMC.

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry at JoVE.com

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Wir haben ein Durchflusszytometer mit laserinduzierten Ultraschall zu erkennen zirkulierenden Melanomzellen als Frühindikator von Metastasen entwickelt.

Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K Aufrufe.  University of Missouri. Wir haben ein Durchflusszytometer mit laserinduzierten Ultraschall zu erkennen zirkulierenden Melanomzellen als Frühindikator von Metastasen entwickelt.

Serie: Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary tumors at distant sites. CTC count can be used to follow disease progression based on the correlation between CTC concentration in blood and disease severity1. As a treatment tool, CTC could be studied in the laboratory to develop personalized therapies. To this end, CTC isolation must cause no cellular damage, and contamination by other cell types, particularly leukocytes, must be avoided as much as possible2. Many of the current techniques, including the sole FDA-approved device for CTC enumeration, destroy CTC as part of the isolation process (for more information see Ref. 2). A microfluidic device to capture viable CTC is described, consisting of a surface functionalized with E-selectin glycoprotein in addition to antibodies against epithelial markers3. To enhance device performance a nanoparticle coating was applied consisting of halloysite nanotubes, an aluminosilicate nanoparticle harvested from clay4. The E-selectin molecules provide a means to capture fast moving CTC that are pumped through the device, lending an advantage over alternative microfluidic devices wherein longer processing times are necessary to provide target cells with sufficient time to interact with a surface. The antibodies to epithelial targets provide CTC-specificity to the device, as well as provide a readily adjustable parameter to tune isolation. Finally, the halloysite nanotube coating allows significantly enhanced isolation compared to other techniques by helping to capture fast moving cells, providing increased surface area for protein adsorption, and repelling contaminating leukocytes3,4. This device is produced by a straightforward technique using off-the-shelf materials, and has been successfully used to capture cancer cells from the blood of metastatic cancer patients. Captured cells are maintained for up to 15 days in culture following isolation, and these samples typically consist of &gt;50% viable primary cancer cells from each patient. This device has been used to capture viable CTC from both diluted whole blood and buffy coat samples. Ultimately, we present a technique with functionality in a clinical setting to develop personalized cancer therapies.

Circulating tumor cells are isolated from the blood of cancer patients without inflicting cellular damage. Isolation of tumor cells is accomplished using a bimolecular surface of E-selectin in addition to antibodies against epithelial markers. A nanotube coating specifically promotes cancer cell adhesion resulting in high capture purities.

Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Integrierte Photoakustische Ophthalmoskopie und Spectral-Domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

Photoakustische Zystographie

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Vorbereitung und photoakustische Analyse von Zell Fahrzeuge, die Gold-Nanostäbchen

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the optical mean free path (~1 mm in skin) with high resolution. By combining optical absorption contrast with the high spatial resolution of ultrasound in a single modality, this technique can penetrate deep tissues. Photoacoustic microscopy systems can have either a low acoustic resolution and probe deeply or a high optical resolution and probe shallowly. It is challenging to achieve high spatial resolution and large depth penetration with a single system. This work presents an AR-OR-PAM system capable of both high-resolution imaging at shallow depths and low-resolution deep-tissue imaging of the same sample in vivo. A lateral resolution of 4 &#181;m with 1.4 mm imaging depth using optical focusing and a lateral resolution of 45 &#181;m with 7.8 mm imaging depth using acoustic focusing were successfully demonstrated using the combined system. Here,&#160;in vivo&#160;small-animal blood vasculature imaging is performed to demonstrate its biological imaging capability.

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Here a switchable acoustic resolution (AR) and optical resolution (OR) photoacoustic microscopy (AR-OR-PAM) system capable of both high resolution imaging at shallow depth and low resolution deep tissue imaging on the same sample in vivo is demonstrated.

Umschaltbare akustische und optische Auflösung Photoakustische Mikroskopie für<em&gt; In vivo</em&gt; Kleintier-Blut-Vaskulatur-Bildgebung

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...