Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

Aktuelle Maßnahmen zur Erkennung von Eierstockkrebs sind unspezifisch und mangelhafte Erkennung von zirkulierenden Tumorzellen. Unser photoakustisches Strömungssystem ermöglicht die Untersuchung von Patientenproben auf spezifische Eierstockkrebsmarker im Blutkreislauf. Dieses Verfahren bietet eine einzigartige Plattformtechnologie mit Verbesserungen gegenüber den aktuellen Techniken in Bezug auf Einfachheit, niedrige Kosten, vielversprechende Erkennungsgrenzen und die Fähigkeit, auf breite Anwendungen angewendet zu werden.

Mit dieser Arbeit wollen wir unser gezieltes Nanopartikelsystem für Eierstockkrebs aufbauen, um ex vivo Patientenproben auf CTCs zu testen. Dieses äußerst vielseitige PAFC-System ist in der Lage, für den klinischen Einsatz zu erweitern und das Vorhandensein einer breiten Palette von Biomarkern im Blut zu testen. Die richtige optische Ausrichtung ist entscheidend für die Detektion von Zielen innerhalb des photoakustischen Durchflusszytometriesystems.

Um eine ordnungsgemäße akustische Kopplung zu gewährleisten, stellen Sie außerdem sicher, dass sich keine Blasen zwischen Glasschlitten und Messumformer befinden. Aufgrund der benutzerdefinierten Natur des Strömungssystems und seiner Komponenten ist die Visualisierung der Methode für eine genaue Reproduktion von Vorteil. In einer belüfteten chemischen Rauchhaube etwa 300 Milliliter entionisiertes Wasser durch einen sterilen 0,2 Mikrometer-Filter filtern.

Fügen Sie 0,0134 Gramm Kupferchlorid und 100 Milliliter entionisiertes Wasser in einen sauberen 250 Milliliter runden Bodenkolben, um eine einMillimolar Kupferchloridlösung zu schaffen. Fügen Sie 0,015 Gramm Folsäure in den Kolben und verwenden Sie eine magnetische Rührstange, um die Lösung für etwa fünf Minuten zu mischen. Dann mischen Sie 0,024 Gramm Natriumsulfid-Nonahydrat mit 100 Mikroliter entionisiertem Wasser.

Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um diese Lösung langsam über eine Dauer von etwa 10 Sekunden in das Reaktionsgemisch einzutragen. Begrenzen Sie das Reaktionsgefäß. Legen Sie das Gefäß in ein Ölbad, das auf 90 Grad Celsius eingestellt ist, und rühren Sie weiter.

Nach ca. 15 Minuten oder wenn das Ölbad den Temperaturbereich zwischen 85 und 90 Grad Celsius erreicht hat, lassen Sie die Reaktion für eine weitere Stunde ablaufen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie das Reaktionsgefäß aus dem Ölbad und lassen Sie es bei Raumtemperatur 10 bis 15 Minuten abkühlen, bevor Sie es in ein Eisbad übertragen. Sobald die Reaktion abgekühlt ist, stellen Sie den pH-Wert mit einem Mol-Natriumhydroxid auf ca. 10 an.

Fügen Sie die Mischung in einer 30-Kilodalton-Zentrifugationskolore in 15-Milliliter-Chargen und Zentrifuge bei 3, 082 mal g für 15 Minuten hinzu, um das Reaktionsgemisch zu reinigen. Mischen Sie zunächst die Folsäure-kupfersulfid-Nanopartikel in der richtigen Konzentration in frischen RPMI-Medien. Fügen Sie diese Nanopartikellösung zu jedem Brunnen der vorbereiteten 24-Well-Platte hinzu, die SK-OV-3-Zellen mit einer Konzentration von 400 Mikrogramm pro Milliliter enthält.

Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für zwei Stunden inkubieren. Danach versuchen, die Zellen mit 0,5 Milliliter von 0,25%Trypsin und EDTA. Um das Trypsin zu neutralisieren, fügen Sie mindestens einen Milliliter folsäurefreien RPMI 1640 komplette Wachstumsmedien hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen sechs Minuten lang bei 123 mal g.

Um die Zellen zu waschen, entfernen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen in zwei Milliliter PBS und Zentrifuge bei 123 mal g für sechs Minuten. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, um ungebundene Nanopartikel zu entfernen. Setzen Sie dann die Zellen mit einem bis zwei Millilitern einer 2%Tween-Lösung in PBS wieder aus.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypan Blue. Verdünnen Sie die Zellen in einer Lösung von 2%Tween in PBS auf die gewählte Konzentration zur Detektion. Verwenden Sie die mitgelieferte dreidimensionale STL-Datei, um den Durchflussbehälter mit ABS-Thermoplast oder PLA-Kunststoff zu drucken.

Nach dem Drucken des Tanks, reinigen und montieren Sie das System für den Einsatz. Glasabdeckungen über den ein Millimeter mal drei Millimeter langen Schlitz und das ein Zentimeter lange Loch in das Strömungssystem legen und vorsichtig mit Silikon versiegeln, um Leckagen zu vermeiden. Als nächstes passen Sie das Kapillarrohr in die silikongehärteten Rohre.

Setzen Sie die Rohre durch die Seite des Durchflussbehälters so in die Strömungskammer ein, dass sich das Glaskapillarrohr direkt über und vor dem Drei-Millimeter-Schlitz und dem ein Zentimeter langen Loch befindet. Versiegeln Sie die Schläuche mit Silikon. Schließen Sie dann den Messumformer an einen Ultraschallpulser und Empfänger an.

Verstärken Sie das Signal mit einer 59-Dezibel-Verstärkung. Schließen Sie den Ausgang des Filters an ein vielseitiges, rekonfigurierbares Oszilloskop mit integriertem, programmierbaren Feld-Gate-Array an. Verbinden Sie eines der Rohre, die aus der Durchflusskammer kommen, an eine T-Verbindung, die an jedem Zweig mit zwei Spritzenpumpen verbunden ist.

Füllen Sie eine der Spritzenpumpen mit Luft und die andere Pumpe mit der zu analysierenden Probe. Stellen Sie die Luftmenge auf einen Durchfluss von 40 Mikroliter pro Minute ein und stellen Sie die Pumpe, die die Probe enthält, auf einen Durchfluss von 20 Mikroliter pro Minute. Als Nächstes verbinden Sie das verbleibende Rohr, das das Durchflusssystem verlässt, mit einem Behälter mit 10% Bleichmittel, um Zellen zu entsorgen, nachdem sie das Durchflusssystem verlassen haben.

Platzieren Sie den Abschnitt des Quarzkapillarrohres in direkter Ausrichtung mit dem Messumformer in der Feldansicht des Mikroskops, um eine sorgfältige Platzierung der optischen Faser über der Probe zu ermöglichen, so dass sie die gesamte Breite des Rohres beleuchtet. Bestrahlen Sie die Probe mit einer optischen Faser, die einen diodengepumpten Festkörperlaser kanalisiert, der mit einer Wellenlänge von 1 053 Nanometern arbeitet. Verwenden Sie eine mit dem Mikroskop montierte Kamera, um den Durchfluss, das Abfeuern des Lasers und den Durchgang von Proben durch das Durchflusssystem aufzuzeichnen.

In dieser Studie werden die photoakustische Durchflusszytometrie und das gezielte Kupfersulfid-Targeting-Mittel verwendet, um zirkulierende Tumorzellen zu detektieren. Ein typisches TEM-Bild der synthetisierten Nanopartikel zeigt, dass die durchschnittliche Größe eines typischen Nanopartikels etwa 8,6 Nanometer beträgt. Die horizontalen und vertikalen Durchmesser jedes Teilchens werden dann senkrecht zueinander gemessen und weiter gemittelt.

Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser für diese Partikel beträgt 73,6 Nanometer. Kupfersulfid-Nanopartikel haben eine charakteristische Absorptionskurve, die sich bis ins Nahinfrarot erstreckt. Es gibt ein leichtes Artefakt um 850 Nanometer, das durch das Schalten von Lasern durch das Spektralphotometer verursacht wird.

Fluoreszenzmikroskopiebilder von Zellen, die mit fluoreszierend markierten Nanopartikeln inkubiert werden, zeigen, dass die Nanopartikelaufnahme durch das Vorhandensein von Fluoreszenz in der Zelle visualisiert werden kann. Zellen, die nicht mit Nanopartikeln inkubiert werden, zeigen kein fluoreszierendes Signal. Das Vorhandensein dieses fluoreszierenden Signals zeigt die erfolgreiche Aufnahme der Partikel und ihre Fähigkeit, im Strömungssystem detektiert zu werden.

Beispiele für typische Datenerfassungssignale werden hier gezeigt. Die Rohdaten zeigen die Signalunterschiede zwischen den nanopartikelmarkierten Zellen, PBS und Folsäure-kupfersulfid-Nanopartikeln an. Unter Verwendung der benutzerdefinierten Laboransicht und MATLAB-Software werden Bildrekonstruktionen von positiven und negativen Kontrollen in Echtzeit bzw. nach der Erfassung durchgeführt.

Einzelne Umschläge werden anschließend in Pixelwerte konvertiert und als unabhängige Spalten angezeigt. Deutliche Unterschiede im photoakustischen Signal treten zwischen PBS und den Folsäure-kupfersulfid-Nanopartikeln in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter auf. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, den Ultraschallwandler, das Mikroskop und die Faseroptik innerhalb des photoakustischen Durchflusszytometriesystems richtig auszurichten.

Bestätigen Sie die Systemausrichtung, indem Sie positive und negative Kontrollen testen. Aufgrund der Vielseitigkeit der photoakustischen Targeting-Techniken und der vielfältigen Einsatzmöglichkeiten mit PAFC ebnet diese Technik den Weg für translational wichtige klinische und Forschungsanwendungen. Um die klinische Anwendung zu gewährleisten, sollten sich weitere Studien auf die Prüfung von Patientenproben und die Reduzierung der Verfahrensschritte konzentrieren.

Die Synthese der Nanopartikel sollte in einer chemischen Rauchhaube unter Verwendung der richtigen Schutzausrüstung erfolgen. Menschliche Zelllinien müssen gemäß den Richtlinien Ihrer Institution behandelt werden. Der Einsatz des Lasers erfordert ein Strahlensicherheitstraining und entsprechende PSA.

Lasernutzung und photoakustische Tests sollten nur von hochqualifiziertem Personal durchgeführt werden.