We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. Fucci Transduktion und Zellkultur <ol><li> Fucci Transduktion <ol><li> Erstellen Zelllinien stabil exprimieren die Fucci Konstrukte mKO2-hCdt1 (30-120) und Mag-hGem (1-100) 15 mit Lentivirus-Cotransduktion wie zuvor beschrieben 7. Hinweis: Die Fucci System ist jetzt im Handel erhältlich. </li><li> Generieren Unter Klone mit heller Fluoreszenz durch Einzelzellsortierung. Sortier einzelnen Zellen positiv für beide AG und KO (gelb) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung in eine 96-Well-Platte wie oben beschrieben 7,16. </li></ol></li><li> Melanom-Zellkultur <ol><li> Kultur C8161 menschlichen Melanomzellen, wie zuvor beschrieben 7,17. </li></ol></li></ol> 2. 3D-Sphäroidbildung (wie zuvor beschrieben 3,9) <ol><li> Agaroseplatte Vorbereitung <ol><li> Aufzulösen 1,5% Agarose (oder Edel Agar) in 100 ml ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) oder Phosphat Buffered Kochsalzlösung (PBS) durch Kochen in der Mikrowelle für 3-5 min unter Schwenken. Achten Sie darauf, die Agarose vollständig gelöst ist. </li><li> Unmittelbar Verteilen von 100 ul der Agarose-Lösung pro Vertiefung auf eine Flachboden-96-Well-Gewebekulturplatte unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Hinweis: Agarose kann in den Spitzen nach einer kurzen Zeit zu verfestigen, um dieses Problem zu überwinden Spitzen müssen zwischen den Platten geändert werden, wenn die mehr als einen Agarose-Platte. </li><li> Lassen Sie 96-Well-Platte auf einer ebenen Fläche, für mindestens 1 Stunde aushärten Agarose. </li></ol></li><li> Zellpräparation und Overlay auf Agarose <ol><li> Wachsen Zellen auf etwa 80% Konfluenz in einer T75-Flasche. Mit 10 ml HBSS waschen. </li><li> Lösen Zellen unter Verwendung von 1,5 ml 0,05% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und resuspendieren in 10 ml Normalmedium. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer 18 oder andere automatisierte Zählweise. </li><li> Die Zellen in einer Endkonzentration von 25.000 Zellen / ml in normal Medium. </li><li> Lagern Agarose Vertiefungen mit 200 ul der Zellsuspension für eine endgültige Anzahl von 5.000 Zellen pro Well. </li><li> Rückplatten zu der Zellkultur-Inkubator (5% CO 2 und 37 ° C), um Sphäroide zu bilden über etwa 3 Tagen. Anmerkung: Die Zeit, die ein Sphäroid zu bilden, variiert zwischen verschiedenen Zelllinien. Einige Zelllinien sind nicht Sphäroiden mit dieser Methode überhaupt. </li><li> Bild Sphäroid Morphologie mit einem inversen Mikroskop mit einem 4X Objektiv und eine Phasenkontrastfilter. Eine Zelllinie, die erfolgreich bildet Sphäroiden wird kompakt, annähernd kugelförmige Zellaggregate zu produzieren, und es sollte nur ein Sphäroid pro Vertiefung sein. Anmerkung: Optional: Sobald Sphäroide gebildet haben, können sie in Kollagen oder anderen Matrix zur weiteren Analyse des Wachstums und der Invasion 3,7,17 ​​transplantiert werden. Sphäroide aus Kollagen zu entfernen, Behandlung mit 500 ul 2 mg / ml Collagenase bei 37 ° C, bis das Kollagen genug für die spher gelösteoids zu kommen kostenlos in die Medien (ca. 30 min). Sphäroiden mit einer 1 ml Pipette vorsichtig entfernen. </li><li> Zum Schneiden / Imaging fix Sphäroiden (entweder isoliert von Kollagen oder für 3-5 Tage auf Agarose gezüchtet) in 10% neutral gepuffertem Formalin (ACHTUNG: Formalin sollte im Abzug verwendet werden) für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht (O / N) bei 4 ° C. Sphäroide in HBSS bei 4 ° C für mehrere Tage gelagert werden. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratom Schnitte <ol><li> Aufzulösen 5 g niedrigschmelzender Agarose in 100 ml HBSS in einer 500 ml Glasflasche in einer Mikrowelle. Verwenden Sie eine mittlere Heizstufe mit wirbelnden. ACHTUNG: Halten Sie den Deckel lose bei Kochen der Lösung, so dass der Druck freigegeben werden kann. Verwenden Sie hitzebeständige Schutzhandschuhe, um die Hände vor Verbrennungen zu schützen beim Umgang mit dem heißen Glasflasche. </li><li> Warten Sie, bis die Agarose kühlt leicht - so die Flasche berührt werden können, ohne zu brennen Händen. </li><li> Gießen Sie approximadig 2 ml Agaroselösung in den Boden eines Coulter-Counters Tasse oder ähnlichen Kunststoffform. Sofort absaugen eine feste Sphäroid (siehe Abschnitt 2.2.8) unter Verwendung einer 1 ml Pipette in der kleinsten Flüssigkeitsvolumen möglich. Sphäroid hinzuzufügen, um die Agarose. Einige Sphäroide (bis zu 10) pro Schale zugegeben werden. </li><li> Decken Sie die Sphäroide mit 2 ml mehr aus Agarose. Tun dies schnell, um die Agarose Aushärtung zu vermeiden, bevor die zweite Schicht hinzugefügt wird. </li><li> Ermöglichen die Agarose bei RT im Dunkeln für mindestens 3 Stunden aushärten. An dieser Stelle kann Cups für eine kurze Zeit bei 4 ° C mit 2-3 gespeichert ml HBSS überlagert, um eine Austrocknung zu verhindern. </li><li> Entfernen Agarose aus der Tasse. Schneiden Sie die Agarose mit den Sphäroiden, so dass es auf die Vibratom Metallblock passt, und Sphäroiden sind in der Nähe der Spitze der Agarose. Sphäroiden können als kleine weiße Gegenstände in der Agarose zu sehen. Superkleber die Agarose auf den Block. </li><li> Füllen Sie das Vibratom mit destilliertem Wasser und montieren Sie den Block in der Vibratom. Stellen Sie dieVibratom 100 um Abschnitte mit geringer Geschwindigkeit (Einstellung 2) und hohe Vibrations (Einstellung 8) zu schneiden. Stellen Sie die Schneideklinge Winkel bis 16 °. Schalten Vibratom auf, schalten Sie die Vibratom Licht und Zuschnitte von der Spitze der Agarose, bis 100 &amp; mgr; m Sphäroid Abschnitte geschnitten. Zeigen geschnitten Sphäroid Abschnitte in HBSS in einem 24-Well-Platte. </li><li> Wählen Mittelabschnitte zur Bildanalyse. Berg Schnitte auf Objektträgern durch die Übertragung der Abschnitt flach auf den Objektträger mit einer Pinzette. Füllen Sie eine 10 ml Spritzenzylinder mit Vakuumfett; fügen Sie eine dünne Linie der Vakuumfett um die Ränder des Abschnitts, um die Befestigungsmittel aus läuft die Kanten des Schlittens zu verhindern und helfen, dichten den Abschnitt unter dem Deckglas. Bedecken Sie den Abschnitt mit Eindeckmittel und einem Deckglas. Siegel Kanten des Deckglases mit Nagellack. Objektträger bei 4 ° C vor der Bilderzeugung. </li></ol> 4. Die konfokale Bildaufnahme <ol><li> Werfen Sie einen z-Scheibe Bild einer mittleren Fucci Sphäroid Abschnitt mit einem 10Xoder 20x-Objektiv wie zuvor beschrieben 7. Achten Sie darauf, zwischen dem Kusabira Orange2 und Azami Grün keine Überlappung oder Übersprechen auftritt. Wenn einem Vergleich der Bildanalyse zwischen mehreren Sphäroid Abschnitte, halten Laserleistung und andere Einstellungen das gleiche zwischen den Proben. </li></ol> 5. Hoechst Dye Diffusion Assay für Fluss Sortierung <ol><li> Übertragen Sie Live-Sphäroiden (3-5 Tage nach Agarose-seeding) auf einen 15-ml-Tube. Lassen Sphäroide Schwerkraft zu dem Boden des Röhrchens absetzen. Mehrere Sphäroiden können pro Röhrchen gefärbt werden. Etwa 20 Sphäroide notwendig sind, um ausreichende Zellzahlen für die Durchflusszytometrie zu gewinnen. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Medium und 1 ml von 10 &amp; mgr; M Hoechst in Normalmedium verdünnt. Sphäroide bei 37 ° C für ca. 1 Std. Schon flicking, um die Kügelchen während der Inkubation einmal oder zweimal zu resuspendieren. Anmerkung: Die Inkubationszeit variiert werden kann, um zu ändern, wie weit der Hoechst-Farbstoff in die Sphäroide eindringt. Dies wird auf variierendas Sphäroid Größe, Dichte und Zelllinie. Für einige große / dichte Kügelchen kann es zu einer maximalen Durchfärbung, die weniger als 100% sein. </li><li> Vorsichtig mit 5 ml HBSS mit Schwerkraftabsetzung Waschen Sie die Sphäroiden. <ol><li> Optional: Für die Bildgebung der Farbeindringprüfung: Fix Sphäroiden mit 10% neutral gepuffertem Formalin für mindestens 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. Bereiten Vibratom Abschnitte, Mount auf Dias und Bild auf der konfokalen wie in Schritt 3 und 4 oben beschrieben. </li></ol></li><li> Um Zellen für die Strömung mit 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA bei 37 ° C etwa 30 min mit Ausklopfen alle 10 min bis der Sphäroide auseinanderzubrechen vorzubereiten Zytometrie trypsinize Sphäroide. Anmerkung: Sphäroide schwierig in Einzelzellsuspension zu erhalten, müssen Bedingungen, die optimiert werden. Lebensfähigkeit C8161 4 Tage alte Sphäroide nach diesem Prozeß beträgt ca. 95%. </li><li> Stain-Zellen mit einem Nah-Infrarot-Live / Dead-Färbung nach dem Protokoll des Herstellers. Waschen mit HBSS dann mit 1 fixml 10% neutral gepuffertem Formalin für ca. 30 min. Zellen können in HBSS bei 4 ° C mehrere Tage vor Flussanalyse gespeichert werden. </li></ol> 6. Durchflusszytometrie Analyse von Hoechst Stained Fucci Spheroids <ol><li> Sicherzustellen Zellen nicht miteinander, indem sie durch ein Zellsieb verklumpt. Resuspendieren der Hoechst gefärbt Fucci Sphäroiden in eiskaltem Wasch FACS (PBS mit 5% fötales Kälberserum) in einer Konzentration von 1-5 × 10 6 Zellen / ml. Übertragen Sie 200 ul der Probe auf 5 ml Rundbodenröhrchen. </li><li> Bereiten Sie die folgenden einzelnen Farbkontrollproben wie in 6.1 beschrieben: un-angefärbt Melanomzellen; haft Melanom-Zellen mit 10 &amp; mgr; M Hoechst 1 Stunde gefärbt; Azami Grün nur ausdrücken Melanomzellen; und Kusabira orange nur ausdrücken Melanomzellen. Hinweis: Einzelne Farbe Kontrollen können in Formalin fixiert und in FACS gespeichert werden abwaschen mit 0,1% Natriumazid bei 4 ° C für Wochen oder sogar Monate. </li><li> Führen Sie Einzelzellsuspensionen ona Durchflusszytometrie Analysator mit geeigneten Lasern und einzelne Farbe / ungefärbten Kontrolle wie vorher beschrieben 7,16. </li><li> Verwenden kommerziellen Zytometrie Software wie FlowJo zur Analyse der inneren vs. Außen Sphäroid-Zellen wie folgt: <ol><li> Entfernen Sie die Ablagerungen durch Gating auf der Hauptzellpopulation im Vorwärtsstreulicht (FSC) gegen Seitwärtsstreulichts (SSC). </li><li> Dubletten entfernen durch Gating an einzelnen Zellen unter Verwendung von FSC (Region) vs. FSC (Höhe) </li><li> Tor für lebende Zellen durch Gating auf dem Live / Dead geringer Bevölkerungs. </li><li> Definieren Hoechst High-Zellen, bezogen auf das positive Signal von der adhärenten Zellen mit Hoechst gefärbt gated, als &quot;äußere&quot; Zellen. </li><li> Definieren Hoechst niedrigen oder negativen Zellen, basierend auf dem Signal von dem nicht-gefärbten Steuer gated, als &quot;innere&quot; Zellen. </li><li> Nach Gating für den inneren und äußeren Populationen können Zellen weiter Fucci rot (G1), gelb (frühe S), Grün (S / G2 / M) oder negativ (frühen G1) ausgeblendet werden. Anmerkung: Compensation mit den einzelnen Farbsteuerung erforderlich sein, um die Fucci rot, gelb, grün und negativen Populationen richtig zu definieren. </li></ol></li><li> Nachdem der Assay wurde optimiert und Hoechst Eindringen über die konfokale Mikroskopie bestätigt, laufen Zellen ohne Fixierung auf eine Fließzellsortierer, wie zuvor beschrieben 7,16 für die weitere Analyse der Lebendzellunterpopulationen. </li></ol> 7. Bildanalyse von Fucci Spheroid Sections <ol><li> Offene Software zB. Volocity, wählen Sie die Quantifizierung NUR Konfiguration. </li><li> Erstellen Sie eine neue Bibliothek. Importieren Sie die Fucci Sphäroid konfokale Bilddatei in die Software, indem Sie die Rohdatendatei von der konfokalen in die Bibliothek. Alternativ können Sie den Befehl Datei&gt; Importieren. </li><li> Gehen Sie zur Registerkarte Messungen, um eine Bildanalyse-Protokoll zu bauen. Das Protokoll wird per Drag &amp; Drop die entsprechenden Befehle in der richtigen Reihenfolge, wie im Protokoll Fenster folgt aufgebaut. </li><li> Finden objECTS im grünen Kanal: Ziehen Sie das Suchen von Objekten Befehl (in &quot;Finding &#39;gefunden) in das Protokollfenster, wählen Sie den richtigen Kanal in der gewünschten Objekte protocol.Add einen offenen Befehl (in&quot; Verarbeitung &quot;gefunden), dann ein separater berührende Objekte Befehl (in &quot;Verarbeitung&quot; gefunden - dies Zellen zu trennen). Objekte Größe &lt;50 &amp; mgr; m auszuschließen sind (in &#39;Filtering&#39; gefunden - dies kleine nicht-zelluläre Objekte auszuschließen). Hinweis: Variablen wie dem Suchen von Objekten Schwelle, Anzahl der offenen Iterationen, um die Größe von Objekten getrennt werden und die Größe der Objekte ausschließen müssen manuell optimiert werden, bis die Objektmasken passen Sie das Bild. </li><li> Suchen von Objekten im roten Kanal: Wiederholen Objekte, wie oben für den roten Kanal zu finden. Grüne und rote Protokolle müssen separat eingestellt werden. Hinweis: Aufgrund der Kerne als in G2, sind grün Kerne oft etwas größer. </li><li> Bestätigen gefundenen Objekte sind genau bestätigen rote und grüne Objekte entsprechen denrote und grüne Kerne in dem Bild, das durch Aus- und Einschalten der grünen und roten Kanälen (mit dem ein- oder ausblenden Kanalbefehl), während die Anzeige der roten und grünen Masken durch das Protokoll gefunden. Feedback-Optionen (Measurements&gt; Feedback-Optionen) können verwendet werden, um das Erscheinungsbild der Objektmasken ändern. </li><li> Finden gelbe Objekte (frühen S-Phase-Zellen): Um gelben Zellen zu finden, fügen Sie einen schneiden Rot mit grünen Zellen-Befehl (in &quot;Die Kombination&quot; gefunden). Objekte nach Größe (&lt;50 um, in &#39;Filtering&#39; gefunden), um kleine nicht-zelluläre Objekte auszuschließen auszuschließen. </li><li> Finden Sie ausschließlich rote Objekte (G1-Phase-Zellen): Um ausschließlich roten Kerne zu finden, subtrahieren Sie die gelben Zellen von den roten Blutzellen (in &quot;Die Kombination&quot; gefunden). Objekte ausschließen, indem Größe &lt;50 &amp; mgr; m (in &#39;Filtering&#39; gefunden), um kleine nicht-zelluläre erstellte Objekte zu entfernen. </li><li> Finden Sie ausschließlich grüne Objekte (S / G2 / M-Phasen-Zellen): Wiederholung für den grünen Kanal ausschließlich grün zu finden. Neinte: Wenn es immer noch nicht-zelluläre Objekte verbleibenden, ein Filter Bevölkerung Befehl kann zur exklusiven grün oder rot Exclusive-Protokolle (in &#39;Filtering&#39; gefunden), nur zu halten hinzugefügt werden Objekte mit einem Formfaktor größer als 0,25. Dies wird nicht kreisförmige Objekte zu entfernen. </li><li> Finden Sie die Sphäroid Gliederung: Finden Sie die Sphäroid Umriss mit einem Fundobjekte Befehl mit der grünen oder roten Kanal (je nachdem, was mehr Zellen am Rand des Sphäroids ist) (in &quot;Finding&quot; gefunden). Eine viel niedrigere Schwelle (in der find gefundenen Objekte Variablen) müssen verwendet werden, um das Sphäroid Umrisse im Vergleich zu einzelnen Zellen zu finden. <ol><li> Verwenden Sie einen Schließbefehl an Objekten (in &quot;Verarbeitung&quot; gefunden) anzuschließen, dann füllen Sie Löcher in Objekten (in der &quot;Verarbeitung&quot; gefunden), dann mit einem Feinfilter (in &#39;Filtering&#39; gefunden), um Lärm von Objekten zu entfernen. Schließlich schließen Objekte nach Größe, um kleinere Gegenstände &lt;30.000 &amp; mgr; m (abhängig von der Sphäroid Größe) zu entfernen. Notiz: Dieses Protokoll müssen manuell optimiert, bis das Sphäroid Umrisse korrekt werden. Ein Hellfeld Bild können auch verwendet werden - allerdings ist dies in der Regel weniger genau mit einem Sphäroid Schnitt und einer Invert-Befehl (in &quot;Die Kombination &#39;gefunden) müssen verwendet werden. </li></ol></li><li> Entfernungen messen von Kernen zum Sphäroid Gliederung: Messen Sie Abstände von den gelben, grünen und ausschließlich exklusiv roten Populationen aus der Zelle Schwerpunkt an den Rand des Sphäroids outline.To die Mindestabstände zu visualisieren (in &#39;Bezogen&#39; gefunden), die aus dem sein sollte Zelle zur nächsten Sphäroid Kante, schalten Sie zeigen Wege auf der Registerkarte Beziehungen in Feedback-Optionen (Measurements&gt; Feedback-Optionen&gt; Beziehungen). </li><li> Speichern Sie das Protokoll. Dieses Protokoll kann auf andere Bilder mit den Messungen erneut angewendet werden&gt; Protokollbefehl wiederherstellen. </li><li> Erstellen Sie einen Messpunkt (Measurements&gt; Make Mess Artikel). Daten können unter Verwendung der Analyse analysiert werden,Funktionen. <ol><li> Gehen Sie auf die Registerkarte Analyse im Messpunkt. Zum Menü Analyse (Analysis&gt; Analyze) und Analyse der Mindestabstand von der Zellenschwerpunkt (rot, grün oder gelb) an das Sphäroid Kante, von Graf zusammengefasst und durch die Bevölkerung organisiert. </li><li> Um die Anzahl der Zellen in einem bestimmten Abstand von der Kante gefunden zählen erstellen Sie einen Filter (Analyse&gt; Filter). Der Filter für Mindestabstand in Figur 2 ist an Hoechst Eindringen basiert (zB minimale Abstand kleiner als 80 gibt die &quot;äußeren&quot; Bevölkerung). Alternativ Export von Rohdaten in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse. </li></ol></li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li><li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent.">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique.">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li></ol>

PerkinElmer contributed to the costs of publication.

Halbautomatische Bildanalyse identifizierte die Sphäroid Innen G1 festgenommen Region und wuchernden äußeren Schichten. Dieses Verfahren kann auf Live-Sphäroiden mit einem optischen Abschnitt verwendet werden, oder in festen Sphäroid Abschnitte, auf Veränderungen nicht nur des Zellzyklus, sondern Markerexpression (über Immunfluoreszenz), Zelltod oder Zellmorphologie in diesen verschiedenen Regionen zu identifizieren. Zellbeweglichkeit in verschiedenen Regionen Sphäroid kann auch quantifiziert werden -, wenn Live...

Mehrzelligen Sphäroiden 3D haben als Tumor-Modell seit Jahrzehnten bekannt, aber es ist erst vor kurzem, dass sie in häufiger Verwendung als in vitro-Modell für viele soliden Tumoren kommen. Sie werden zunehmend in Hochdurchsatz-Wirkstoffsuche Bildschirme als Vermittler zwischen komplex, teuer und zeitaufwendig in vivo-Modelle und die einfache, kostengünstige 2D-Einzelschicht-Modell 1-6 verwendet. Studies in 2D Kultur sind oft nicht in der Lage, um in vivo repliziert werden. Spheroid Modelle von vielen Arten von Krebs in der Lage, die Wachstumseigenschaften, Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, Drogen-Penetration, Zell-Zell-Interaktionen, eingeschränkte Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen und die Entwicklung der Nekrose, die in vivo in soliden Tumoren 6-11 zu sehen ist zu imitieren. Sphäroide Entwicklung einer nekrotischen Kern, eine ruhende oder G1 verhaftet Umgebung des Kerns und proliferierenden Zellen in der Peripherie des Sphäroids 7. Die Entwicklung dieser Regionenkann abhängig von der Zelldichte, der Proliferationsrate und der Größe des Sphäroids 12 variieren. Es wurde vermutet, dass die zelluläre Heterogenität in diesen verschiedenen Teilbereiche ersichtlich kann in der Krebstherapie Widerstand 13,14 beizutragen. Deshalb separat ist die Fähigkeit, Zellen in diesen Bereichen zu analysieren entscheidend für das Verständnis Tumorarzneimittelreaktionen. Und Grün (Azami Green - AG) Fluoreszenzmarkierung von Cdt1 und Geminin, die in verschiedenen Phasen des Zellzyklus 15 abgebaut werden - die Fluoreszenz Ubiquitinierung Zellzyklus-Anzeigesystem (Fucci) auf dem roten (KO Kusabira orange) basiert. So Zellkerne erscheinen rot in G1, gelb in der frühen S und S / G2 / M Phase grün. Wir beschreiben hier zwei sich ergänzende Methoden sowohl mit Fucci den Zellzyklus zu identifizieren, zusammen mit der Verwendung von Bildbearbeitungssoftware oder ein Farbstoffdiffusions Durchflusscytometrieassay um zu bestimmen, ob die Zellen befinden sich in der G1 verhaftet Mitte oder den äußeren proliferating Rings und der Abstand der einzelnen Zellen von der Kante des Sphäroids. Diese Verfahren wurden in unserer früheren Veröffentlichung, wo wir gezeigt, dass Melanomzellen in hypoxischen Regionen in der Mitte des Sphäroids entwickelt und / oder in Gegenwart von zielgerichtete Therapien sind in der Lage, in die G1-Arretierung für längere Zeit zu bleiben, und kann RE- geben Sie den Zellzyklus, wenn günstigere Bedingungen entstehen 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose low melting point</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>noble agar&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5431</td>
			<td>For making spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose for spheroids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>For making spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5014-1CS</td>
			<td>CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do &#160;not breath fumes (open in a fume cupboard).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead near IR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibratome</td>
			<td>Technical Products International, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coulture cup</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SIE936</td>
			<td>Mold for sectioning spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Invitro</td>
			<td>FAL353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer analyser</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flowjo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccuum grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCCI (commercial constructs)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36238</td>
			<td>Transient transfection only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 um</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom 5 mL tubes (sterile)</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom 5 mL tubes (non-sterile)</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3d melanoma spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Es gibt mehrere Verfahren zur Herstellung Tumorsphäroide Dieses Protokoll verwendet die nicht-haftenden Wachstumsverfahren, bei dem Zellen auf Agar oder Agarose 3,7,9 kultiviert werden. 1 zeigt ein Beispiel eines C8161-Melanom Sphäroid nach 3 Tagen auf Agar. C8161 Sphäroide bilden regelmäßige Größe Sphäroiden mit einem Durchmesser von 500 bis 600 &amp; mgr; m (Mittelwert = 565, SD = 19, n = 3) nach 3 Tagen. Andere Melanom-Zelllinien, die Sphäroide bilden gehören: WM793, WM983C, WM98...

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K Aufrufe.  The Centenary Institute. We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids. 

Serie: Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for atherosclerosis research. They are used to study the impact of a various genetic factors and different cell types on atherosclerotic lesion formation and as well as test the development of new therapies. Isolation, excision of the whole aorta, and quantification of Oil Red O-stained atherosclerotic lesions are basic morphometric methods used to evaluate atherosclerotic burden. The goal of this protocol is to describe an optimized, step-by-step surgical method to dissect, perfuse-fix, isolate, stain, image and analyze atherosclerotic lesions in mouse aortas with Oil Red O. Because atherosclerotic lesions can form anywhere in the entire aortic tree, this whole aorta Oil Red O staining method has the advantage of evaluating lipid-laden plaques in the entire aorta and all branches in a single mouse. In addition to Oil Red O staining, fresh isolated whole aortas can be used for variety of in vitro and in vivo experiments and cell isolations.

This protocol provides a step-by-step procedure to analyze atherosclerotic burden in mice. Investigators can use this protocol to compare the abundance, location, and size of atherosclerotic lesions in different animals.