Diese Arbeit wurde vom NIH Forschungsstipendien K01AR053210, R01AR061484 und einen Zuschuss von der National Psoriasis Foundation finanziert.

1. Hintergrundinformationen Die Hefe-Zwei-Hybrid-System ist eine leistungsfähige genetische Technik verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen 16, 17 zu entdecken. Mehrere Arten von 2-Hybrid-Systeme, wie lexA-basierte Systeme, die Sos Recruitment System, und Bakterien-oder Säugetierzellen basierenden 2-Hybriden sind kommerziell verfügbar, dieses Papier konzentriert sich insbesondere auf die Änderungen der am häufigsten verwendeten GAL4 Basis Hefe 2-Hybrid-System. Kurz gesagt, ist die Methode, auf die Eigenschaften der Hefe GAL4-Protein, das von trennbaren Domänen verantwortlich für die DNA-Bindung und Transkriptionsaktivierung zusammensetzt. Der Köder-Protein als Fusionsprotein mit der GAL4 DNA-bindende Domäne (DNA-BD) exprimiert, während die Beute Proteine ​​als Fusionen mit der GAL4-Aktivierungsdomäne (AD) ausgedrückt werden. Die Interaktion zwischen Köder und Beute Fusionsproteinen führt zur transkriptionellen Aktivierung des GAL4-Bindungsstellen, die Reporter-Gene, die in der Hefe g integriert sindenome. Das Prinzip der Y2H ist in Abb. dargestellt. 1 und das experimentelle Vorgehen ist in Abb. zusammengefasst. 2. 2. Benötigte Materialien und Lösungen <ol><li> YPD Growth Medium (eine Mischung aus Pepton, Hefeextrakt und Dextrose in optimalen Proportionen für den Anbau von den meisten Saccharomyces cerevisiae-Stämme). </li><li> Minimal SD Bases (Minimal synthetischen definiert (SD)-Basen gehören ein Hefestickstoffbase, Ammoniumsulfat und eine Kohlenstoffquelle, Dextrose. Dropout (DO) Ergänzungen zu den Minimal SD Base kann hinzugefügt werden, um ein synthetisches, definiert Medium ohne die angegebene machen Nährstoffe). </li><li> Leu /-Trp Dropout (DO) zu ergänzen (mit allen essentiellen Aminosäuren außer Leucin und Tryptophan) </li><li> -His/-Leu/-Trp/-Ura Dropout (DO) Supplement (enthält alle essentiellen Aminosäuren außer Leucin, Tryptophan, Histidin und Uracil) </li><li> Luria Broth (LB) (Trypton 10 g / L, Hefeextrakt 5 g / L, NaCl 5 g / L) </li><li> X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-galactopyranosid) Lösung: vorbereitet als 20 mg / ml Stammlösung in N, N-Dimethylformamid </li><li> 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, autoklaviert) </li><li> Beschallt Herings-oder Lachssperma DNA, gekocht (10 mg / ml) </li><li> 10X LiAc (1 M Lithium-Acetat, autoklaviert) </li><li> 50% PEG-3350-Lösung, Filter-sterilisiert </li><li> 3-Amino-1, 2, 4-Triazol (3AT) </li><li> Kanamycin </li><li> Ampicillin </li><li> ElectroMax DH5 Zellen </li><li> Z-Puffer: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (oder 8,52 g wasserfrei), 5,5 g NaH2PO4 H2O (oder 4,8 ganhydrous), 0,75 g KCl, 0,246 g MgSO4 7H2O (oder 0,12 g wasserfrei), in 1 L autoklaviert, destilliertem Wasser gelöst und auf pH-Wert 7,0. </li></ol> 3. Bait Generation (pDBLeu-PGRN) Ein cDNA-Fragment, das PGRN fehlt Signalpeptid (aa21-588) wurde gerichtet in die Sal I-Not I Stellen des pDBLeu Vektor (die ProQuest Two-Hybrid System, Invitrogen) kloniert,Beibehaltung der Übersetzung Leseraster wie die GAL4 DNA-bindende Domäne zu pDBLeu-PGRN generieren. <ol><li> Amplify der cDNA-Fragment von PGRN oben beschrieben durch PCR mit Oligonukleotid-Primer entworfen, um Restriktionsschnittstellen (Sal I am 5&#39;-Ende und Not I am 3&#39;-Ende), um in-frame-Fusion ermöglichen enthalten. </li><li> Gel reinigt die PCR-Produkt, Endonukleasen verdaut mit Einschränkung Sal I und Not I Bereiten Sie den DB-Vektor pDBLeu durch Doppelklick Restriktionsverdau mit den gleichen Restriktionsendonukleasen. </li><li> Ligieren die Beschränkung PGRN Fragment in den linearisierten Vektor pDBLeu und verwandeln sich in DH5 mit Auswahl für LB + Kanamycin bei 25 pg / ml. </li><li> Überprüfen Sie, ob die Korrektur des Konstrukts durch DNA-Sequenzierung. </li></ol> 4. Kleine Transformation der Köder-Plasmid <ol><li> Inoculate 5 ml YPD mit einer Kolonie von Mav203 (Invitrogen), schütteln über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Verdünnen Sie die Übernacht-Kultur in 50 ml YPD. Wachsen Sie ein Additional 2-4 Stunden. </li><li> Pellet die Zellen bei 3000 rpm für 5 min bei RT. Das Pellet in 40 ml autoklaviertem, destilliertem Wasser. </li><li> Re-Pellet den Zellen. Resuspendieren in 2 ml Lösung I, bei RT 10 min inkubieren. Lösung I: 0,5 ml 10xLiAc, 0,5 ml 10xTE, 4 ml H 2 O </li><li> Dispense die DNA zu Röhren: 2-3 pl pDBLeu-PGRN (0.25μg/μl) und 10 ul denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA (10μg/μl). Add 100 &amp;mgr; Hefezellen, gut mischen. </li><li> Fügen Sie 700μl Lösung II, gut mischen. Inkubation bei 30 ° C für 30 min. Lösung II: 0,2 ml 10xLiAc, 0,2 ml 10xTE, 1,6 ml 50% PEG3350. </li><li> Hitzeschock bei 42 ° C für 15 min. </li><li> Pellet für 2 min. Überstand verwerfen. Das Pellet in 200 ul autoklaviert, destilliertes Wasser. </li><li> Platte der Suspension auf SD-Leu-Platten mit Verdünnungsreihen. Die Platte bei 30 ° C für 2-3 Tage. </li></ol> 5. Bait-Validierung Vor der Durchführung yeast-Zwei-Hybrid-Bildschirm Test pDBLeu-PGRN zur Selbsthilfe Aktivierung und bestimmen die basale Expression des HIS3-Reportergens. Dieser Test bestimmt, ob Köder Transkription zu aktivieren und ob die Selbst-Aktivierung kann durch Inhibitoren neutralisiert werden. 3-Amino-1, 2, 4-triazol (3-AT) ist ein kompetitiver Inhibitor des HIS3-Gen-Produkt und kann verwendet werden, um das Mindestniveau der HIS3 Ausdruck für das Wachstum auf Histidin-defizienten Medien erforderlich titriert werden. <ol><li> Transformieren Sie die pDBLeu-PGRN in Hefe Mav203 Stamm, Platte der Transformation auf SD-Leu-Platten und Inkubation für 48-72 h bei 30 ° C. </li><li> Patch-Kolonien von jeder Transformation mit Hilfe von Zahnstochern auf autoklaviert SD-Leu-His-Platten mit 3-AT bei Konzentrationen von 10 mm, 25 mm, 50 mm, 75 mm und 100 mM. 3-AT ist ein kompetitiver Inhibitor des HIS3 Enzym und nur Köder, die Selbst-Aktivierung aufweisen können, in der Gegenwart des 3-AT wachsen. </li><li> Bait-Stämme, die auf den Platten containi wachsenng 100 mM 3-AT sind nicht geeignet für den Einsatz im Zwei-Hybrid-Screen. Für Köder, die verwendet werden können, verwenden Sie den niedrigsten 3-AT Konzentration, die das Zellwachstum hemmt. In vielen Fällen ist 25 mM 3-AT für das Screening verwendet. </li></ol> 6. cDNA-Bank-Screening Die pDBLeu-PGRN Plasmid in MaV203 eingeführt mit einer kleinen Veränderung, wie oben beschrieben. Zur Einführung pPC86-Bibliothek (Invitrogen) in MaV203 (pDBLeu-PGRN), das nachstehend beschriebene Verfahren in der Regel gibt ~ 4 x 10 4 Kolonien mit 0,5 ug Plasmid-Bibliothek DNA. Daher werden 2,5 x 10 6 Hefetransformanten erfordern ~ 30,0 pg pPC86-cDNA-Bibliothek Plasmid-DNA, 25 Transformationen und fünfzig 10-cm-Platten (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT). <ol><li> Bereiten Sie die entsprechende Anzahl von 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT-Platten (50 für das Verfahren weiter unten). Bereiten Sie zudem mindestens vier 10-cm SD-Leu-Trp-Platten für die Schätzung der Zahl der Transformanten. </li><li> Transformieren Sie die Bibliothek indie MaV203 mit pDBLeu-PGRN nach dem unten beschriebenen Verfahren. <ol><li> Suspend mehrere isolierte Kolonien MaV203 (pDBLeu-PGRN) in ~ 100 &amp;mgr; autoklaviert, destilliertem Wasser und breitete sie auf einen 10-cm SD-Leu Platte. Wiederholen Sie den Vorgang für eine zweite SD-Leu Platte. Inkubieren beide Platten für 18-24 h bei 30 ° C. </li><li> Kratzen und vollständig die Zellen in 10 ml autoklaviert, destilliertes Wasser. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen an Zellsuspension zu 500 ml Flüssigkeit YPD-Medium in einem Kolben bis zu einer OD 600 von ~ 0,1 geben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die OD ~ 0,1 ist nach der Impfung. </li><li> Schütteln bei 30 ° C, bis die OD 600 ~ 0,4 erreicht. </li><li> Bereiten Sie frisch: <ol type="a"><li> 110 ml 1X TE / LiAc durch die Kombination von 11 ml 10X TE, 11 ml 10X LiAc, und 88 ml Wasser autoklaviert. </li><li> 16 ml PEG / LiAc durch die Kombination von 1,6 ml 10X TE, 1,6 ml 10X LiAc und 12,8 ml 50% PEG-3350. </li></ol></li><li> Pellet die Zellen bei 3000g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Discard ter Überstände und sanft das Pellet durch Auf-und Abpipettieren in 100 ml autoklaviert, destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugation bei 3000 g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand der zentrifugierten Zellen und Zellpellet in 50 ml 1X TE / LiAc Lösung. </li><li> Zentrifugation bei 3000 g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die Überstände und das Pellet in einem Endvolumen von 2,5 ml 1X TE / LiAc Lösung. </li><li> Führen Sie 25-Transformationen. Kombinieren Sie 2,5 ml Zellen, 125 ul (10μg/μl) denaturiert, gescherte Lachssperma DNA und 30 ug cDNA-Bibliothek. Vorsichtig mischen durch Auf-und Abpipettieren. 15 ml PEG / LiAc Lösung und vorsichtig mischen. Aliquot in 25 autoklaviert 1,5-ml Reaktionsgefäße von 700 ul jeder. </li><li> Inkubieren für 30 min in einem 30 ° C Wasserbad. </li><li> Hitzeschock für 15 min in einem 42 ° C Wasserbad. </li><li> Zentrifuge bei 6.000 g für 1 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig die supernatant. Vorsichtig resuspendieren jedes Pellet in 400 ul autoklaviert, destilliertem Wasser mit einer Pipette auf und ab. </li></ol></li><li> Plate 200 ul Transformation Mischung aus jeder Transformation auf einzelne 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT (3AT Konzentration: 25 mM)-Platten mit einem Spread bar, So 25 autoklaviert 1,5-ml Reaktionsgefäße kann 50 Platten machen (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT). </li><li> Die Platten für 5-10 Tage bei 30 ° C. </li><li> Werden auf SD-Leu-Trp ausplattiert; Um die Transformationseffizienz der Reaktion wurden serielle Verdünnungen von einer Reaktion (1:400 und 1:4000 1:40) zu schätzen. Nach Inkubation für 3 Tage bei 30 ° C, die Anzahl der Kolonien gezählt und die Gesamtzahl der Transformanten berechnet. </li></ol> 7. X-gal-Assay <ol><li> Transfer-Kolonien auf YPD Platte; inkubieren bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Gerundet Nitrozellulosemembran auf der YPD Platte; stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen zwischen der Membran und der YPD Platte. Nach 1-2 min, make, dass alle Kolonien sind an Membranen (Nitrocellulose-Papier) übertragen. </li><li> Legen Sie die Membran Kolonie Seite nach oben im Boot mit Alufolie Papier. </li><li> Legen Sie die Membran in flüssigen Stickstoff, warten Sie 20 Sekunden, und tauchen in flüssigen Stickstoff für ein paar Minuten. </li><li> Nehmen Sie Membran zu tauen. </li><li> Mittlerweile mischen die folgenden Reagenzien: 1,5 ml Z-Puffer 20 &amp;mgr; l X-gal (20 mg / ml) </li><li> Drop-Z-Puffer / X-gal in einer Petrischale, legen Whatman-Papier obendrein. </li><li> Vorsichtig Nitrocellulosepapier oben auf Whatman-Papier. </li><li> Bei 37 ° bis blaue Kolonien erscheinen. </li></ol> 8. Retransformation Test Prey-Fusionsproteine ​​(AD-Y) von Bibliotheks-Screening isoliert sollten weiterhin die Interaktion mit Köder-Fusionsprotein (DB-X), um den Bericht Gene zu induzieren, und die Rückverwandlung des Beute-Klone und Köder in Hefe-Konstrukt kann weitere beseitigen Fehlalarme und erleichtern hinzufügenitional Analyse. <ol><li> Isolieren Plasmid-DNA aus Hefe-Stämme potentiell interagierende Proteine ​​enthalten. </li><li> Transform-DNA in E. coli DH5 Zellen Platte die Transformationen auf LB 100 pg / ml Ampicillin-Platten, um selektiv isolieren pPC86-cDNA-Bibliothek, beimpft und über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Wählen Sie mehrere Kolonien von der Platte in LB setzen 100 ug / ml Ampicillin Brühe. </li><li> Bereiten Miniprep DNA und durch einen Doppelklick Restriktionsanalyse mit Sal I und Not I untersuchen </li><li> Co-Transformation die Beute Plasmid und Köder-Plasmid in MaV203, Platte der Transformation Mischungen auf SC-Leu-Trp-Platten und Inkubation für 2-3 Tage bei 30 ° C. </li><li> Wählen Sie drei verschiedene Kolonien von der SC-Leu-Trp Platte, führen X-gal-Assay. </li></ol> 9. Sequenzierung und bioinformatische Analyse Sequence die Plasmid-DNA, die aus wahrscheinlich wahre positive Klone isoliert wurde, vergleichen Sie diese Sequenzen wie in der GenBank unter Verwendung der BLAST-Programm, und diejenigen identifizieren, two-hybrid-Klone, die zu bekannten Genen entsprechen. Sequencing Daten zeigten, dass zwei von den 12 positiven oben erhaltenen Zelloberfläche TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b; Accession # NM_130426) wurden. Darüber hinaus wurde das Zusammenspiel zwischen PGRN und TNFR überprüft mittels verschiedener Protein-Protein Interaktion Assays, einschließlich In-vitro-Solid-Phase-Bindungsassay, Co-Immunpräzipitation, Surface-Plasmon-Resonanz-Analyse und Durchflusszytometrie-Assay 14. 10. Repräsentative Ergebnisse Der Ablaufplan des Screening ist in Abb. dargestellt. 3. In der Regel 50-100 positive Klon Kandidaten werden bei diesem Schritt erreicht werden. Wir haben uns zunächst isoliert 54 positive Klon Kandidaten unter 2,5 Millionen Transformanten mit dem PGRN Köder gezeigt. Positive Klon Kandidaten wurden dann durch Ausführen X-gal-Assay überprüft. Typischerweise sind etwa 50% falsch-positive Klone mittels X-gal-Assay entfernt. Wir erhalten 23 positiven Klon candid<html> Ates auf diesen Schritt für die PGRN Köder (Abb. 4). Rücktransformation der Beute Klone und Köder Konstrukt in Hefe weiter zu reduzieren False Positives und Klone, die noch aktivieren Sie die Reporter-Gene wahrscheinlich den wahren Positiven. Typischerweise werden etwa 50% positive Klon Kandidaten entfernt werden. Wir haben endlich isoliert 12 positive Klone, die mit PGRN in Hefe interagieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig1.jpg" /> Abbildung 1. Prinzip des Hefe-Zwei-Hybrid-System <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig2.jpg" /> Abbildung 2. Pipeline identifizieren Protein Bindungspartner mit Hefe-Zwei-Hybrid-System <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ablaufschema Screening Hefe-Zwei-Hybrid-Bibliothek.rge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; hier klicken, um einen Full-Size-Version dieses Bildes zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beta-Galactosidase Assay positiver Klon Kandidaten. A, Positive Klone aus der Bibliothek-Bildschirm erhalten wurden YPD-Platte transferiert und bei 30 ° C über Nacht; B, Alle Kolonien auf YPD-Platte wurden auf Nitrocellulose-Membranen übertragen und beta-Galaktosidase-Assay durchgeführt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hefe-Zwei-Hybrid-Screening hat sich als wirksames Instrument bei der Identifizierung von Protein-Interaktion 16, 17 sein. Im Vergleich mit anderen Ansätzen zur Identifizierung von Protein-Bindungspartner, wie biochemische co-Reinigungs-und Protein-Chips, Hefe-Zwei-Hybrid-System ist ein sensibler genetischer Ansatz, der für das Screening sehr hohe Zahl von kodierenden Sequenzen in einer relativ einfachen Experiment verwendet werden können; in Zudem erkennt es die in vivo Interaktion und braucht keine kompli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> ProQuest Two-Hybrid System </td><td> Invitrogen </td><td> 10835 </td></tr><tr><td> YPD Growth Medium </td><td> Clontech </td><td> 630409 </td></tr><tr><td> YPD Agar Medium </td><td> Clontech </td><td> 630410 </td></tr><tr><td> Minimal SD-Agar-Basis </td><td> Clontech </td><td> 630412 </td></tr><tr><td> -Leu DO Supplement </td><td> Clontech </td><td> 630414 </td></tr><tr><td> -Leu/-Trp DO Supplement </td><td> Clontech </td><td> 630417 </td></tr><tr><td> -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement </td><td> Clontech </td><td> 630425 </td></tr><tr><td> 3-Amino-1 ,2,4-triazol (3AT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8056 </td></tr><tr><td> Luria Broth (LB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> X-Gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-034 </td></tr><tr><td> Ultraschall behandelter Lachssperma DNA </td><td> Stratagene </td><td> 201190 </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> AMRESCO </td><td> 0339 </td></tr><tr><td> Kanamycinsulfat </td><td> Invitrogen </td><td> 11815-024 </td></tr><tr><td> Subklonierung Efficiency ™ DH5a ™ Competent Cells </td><td> Invitrogen </td><td> 18265-017 </td></tr><tr><td> Trizma ® base </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td></tr><tr><td> Lithium-Acetat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4158 </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> ED </td></tr><tr><td> Nitrocellulosemembran </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0115 </td></tr><tr><td> 10-cm-Petrischale </td><td> ITI Scientific </td><td> CT-903 </td></tr><tr><td> Incubator (30 ° C) </td><td> ATR (Ecotron) </td><td></td></tr></table>

modified yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with the growth factor progranulin

Progranulin (PGRN), auch als granulin epithelin Vorstufe (GEP) bekannt, ist ein 593-Aminosäuren-autokrine Wachstumsfaktor. PGRN ist bekannt, dass eine kritische Rolle in einer Vielzahl von physiologischen und Krankheitsprozessen spielen, einschließlich der frühen Embryogenese, Wundheilung 1, Entzündung 2, 3, und Host-Sicherheitsebene 4. PGRN auch als neurotrophen Faktor 5, und Mutationen in der PGRN Gens zu einer teilweisen Verlust der PGRN Protein verursachen frontotemporale Demenz 6, 7. Unsere jüngsten Studien haben auf die Isolierung von PGRN als ein wichtiger Regulator des Knorpels Entwicklung und Abbau 8-11 geführt. Obwohl PGRN, entdeckte vor fast zwei Jahrzehnten, spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, die Bemühungen um die Aktionen der PGRN nutzen und verstehen die beteiligten Mechanismen wurden erheblich durch unsere Unfähigkeit behindert, seine Bindung Rezeptor (en) zu identifizieren. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein modiFied Hefe-Zwei-Hybrid (MY2H) Ansatz, der auf die am häufigsten verwendeten GAL4 basierten 2-Hybrid-System. Gegenüber der konventionellen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen, MY2H verkürzt den Bildschirm und reduziert die Anzahl der falsch-positiven Klone. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig, und wir haben erfolgreich dieses System bei der Isolierung der Proteine ​​aus verschiedenen Ködern, darunter Ionenkanal 12, extrazellulären Matrix Protein 10, 13, und Wachstumsfaktor 14 verwendet. In diesem Papier beschreiben wir diese MY2H experimentellen Verfahren im Detail mit PGRN als ein Beispiel, das zur Identifizierung von TNFR2 als der erste bekannte PGRN-assoziierten Rezeptors 14, 15 geführt.

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Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Wir haben die konventionelle Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, ein wirksames Instrument bei der Identifizierung genetischer Protein-Interaktion verändert. Diese Modifikation deutlich verkürzt den Prozess, reduziert den Arbeitsaufwand und vor allem, reduziert die Anzahl von Fehlalarmen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig.

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

modified-yeast-two-hybrid-system-to-identify-proteins-interacting

Research

JoVE Journal

Biology

28.6K Aufrufe.  NYU Hospital for Joint Diseases. Wir haben die konventionelle Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, ein wirksames Instrument bei der Identifizierung genetischer Protein-Interaktion verändert. Diese Modifikation deutlich verkürzt den Prozess, reduziert den Arbeitsaufwand und vor allem, reduziert die Anzahl von Fehlalarmen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig.

Serie: Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

This video demonstrates two methods for preparing and placing beads, which have been coated with growth factor, on explants of the developing cerebral cortex. These beads can be used to induce spatially restricted gene expression on developing neural tissue such as forebrain explants. Methods are given for using both Affi-Gel beads and heparin acryllic beads.

Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

Forschung

Biologie

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Capture Compound Mass Spectrometry - Ein leistungsfähiges Tool zum Identifizieren Novel c-di-GMP Effektorproteinen

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine ​​interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren

Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren