Diese Arbeit wurde von der Medical Research Council und der Marie-Curie International Reintegration Grants Schema (zum JKV) unterstützt.

Ein. Picking cDNA Expression Clones <ol><li> Die cDNA-Bibliothek wird als einziges Bakterienklone in Glycerinstammkulturen in einer 96-Well-Format bereitgestellt. Verwendung des Rearray Befehl im Menü des Picker Norgen CP7200, Pick Bakterienklone von der Quelle Platte und Inokulat in 1,5 ml LB / amp in einer 96-Deepwell (1 ml well) Platte. </li><li> Verschließen Sie die Deepwell-Platten mit einer gasdurchlässigen Dichtung und über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker. </li></ol> 2. Herstellung von cDNA-Expressionsbibliothek <ol><li> Drehen Sie die Deepwell-Platten, die die Bakterien bei 2.000 rpm für 20 min mit Platte Adapter in einer Tischzentrifuge. </li><li> Absaugen Medien aus dem Brunnen, verlassen das Bakterienpellet intakt. </li><li> Konfigurieren des Deck des Laborautomatisierung Arbeitsstation wie in Abbildung 2 dargestellt. Lösungen für Plasmid Herstellung sind in Tröge 1-5 verteilt und die Deepwell Platte auf dem Deck angeordnet ist. Mehrgefässanordnung Trog mit Elutionslösungplatziert ist benachbart zum Deepwell Platte. Trinkgelder sind in den Spitzenracks geladen. </li><li> Montieren Sie die Vakuumkammer. Das Plasmid Bindungsplatte ist im Inneren des Verteilers angeordnet ist und das Plasmid Filterplatte wird auf der Oberseite des Verteilers angeordnet. </li><li> Resuspendieren Pellets mit 250 ul Lösung 1 (Resuspensionspuffer) durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Lyse der Bakterien durch Zugabe von 250 ul Lösung 2 (Lysepuffer). Die Platte ist abgedichtet und invertiert, um vollständiges Mischen zu ermöglichen. </li><li> Start 2 min Timer. </li><li> Fügen Sie 350 ul Lösung 3 (Neutralisation Puffer). Verschließen Sie die Platte und invertieren 3 mal. </li><li> Übertragen Sie die Bakterienlysate den Plasmid Filterplatten. </li><li> Bewerben Vakuum 5 min. </li><li> Filterscheibe entnehmen und platzieren Sie die Bindungsplatte auf dem Verteiler. Bewerben Vakuum für 1 min. </li><li> Fügen Sie 500 ul zusätzliche Wäsche (AW) Puffer. </li><li> Bewerben Vakuum für 2 min. </li><li> Fügen Sie 900 ul Waschpuffer Solution 4. Bewerben Vakuum für 2 min. </li><li> Wiederholen step 2,14. Anwenden Vakuum für weitere 15 min. </li><li> Zeigen DNA Klingelbeutel innerhalb des Verteilers. Fügen Sie 100 ul Elutionspuffer auf die Bindungs-und inkubieren für 2 min. </li><li> Vakuum für 10 min. </li><li> Entfernen Klingelbeutel und messen DNA-Konzentration mit dem Nanodrop 8000. Typischerweise wird eine Ausbeute von ~ 100 ng / ul können mit dieser Methode zu erwarten. </li></ol> 3. Zellaussaat <ol><li> HEK293-Zellen werden trypsiniert und gezählt. </li><li> 2 x 10 4 Zellen in jede Vertiefung einer PerkinElmer Viewplate mit dem ThermoFisher 96-well Multidrop verzichtet. </li><li> Die Zellen werden über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 4. Transfektion <ol><li> Vorbereiten einer Mischung aus 100 ng GFP-Grb2 Plasmid DNA mit 100 ng der cDNA in 25 ul serumfreiem Medium pro Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte. </li><li> Fügen Sie 25 ul Serum-freie Medien mit 0,5 ul Transfectin pro Vertiefung. </li><li> Vermischen und Timer-for 30 min. </li><li> Übertragen 50 ul cDNA / Transfectin Mix, um Zellen mit einem sanften Dosierung. Alternativ kann die erste Transfektionsgemisch zu Platten verzichtet werden und dann Zellen zugegeben oben (umgekehrter Transfektion). </li><li> Inkubieren Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 5. Image Acquisition <ol><li> Starten Sie Opera Software. Ein Bildschirm-Schnappschuss des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 3 dargestellt. Wählen Sie die Registerkarte &quot;Konfiguration&quot; und wählen 20x-Objektiv und die richtige Plattentyp. Stellen Sie sicher, &quot;Kragen&quot; ist auf den korrekten Wert am Ziel gesetzt, für die Fokussierung mit verschiedenen Plattentypen ermöglichen. </li><li> Wählen Sie das &quot;Microscope&quot; tab. Definieren Exposition 1 als FITC (488 Laser) und Belichtung 2 als UV (365 Laser). Aktivieren Sie die UV-Filter auf beiden Belichtungen und weisen Exposition 1 auf die Kamera 1 und Exposition 2 zur Kamera 2. Set Belichtungszeiten bis 800 ms für die Exposition 1 und 40 ms für die Exposition 2. </li><li> Wählen Sie das &quot;Microscope&quot; tab. Definieren Sie exposure 1 als FITC (488 Laser) und Belichtung 2 als UV (365 Laser). Aktivieren Sie die UV-Filter auf beiden Belichtungen und weisen Exposition 1 auf die Kamera 1 und Exposition 2 zur Kamera 2. Set Belichtungszeiten bis 800 ms für die Exposition 1 und 40 ms für die Exposition 2. </li><li> Wählen Belichtung 1. Setzen Sie den Fokus Höhe auf 0 um. Wählen Sie &quot;Focus&quot;. Sobald konzentriert, setzen Kamera 1. Stellen Sie den Fokus Höhe, um den Belichtungsebene optimieren und klicken Sie auf &quot;Take Höhe&quot;. Ändern der Belichtungszeiten und Laserleistung auf einen maximalen Pixelintensität ~ 3.000 zu ergeben. Speichern Expositionsparameter. Wiederholen Sie für die Exposition 2. </li><li> Wählen Sie &quot;Experiment Definition&quot;. Neues Layout und sublayout. Ziehen Sie die entsprechenden Layout, Belichtung, Referenzbild, skewcrop Datei und sublayout. Speichern Experiment. </li><li> Wählen Sie &quot;Automatisch Experiment&quot; Registerkarte und Bilder aufzunehmen. </li></ol> 6. Image Analysis (auf ImageJ 1.46h-Version.) <ol><li> Konvertieren Sie die proprietären PerkinElmer. Flex Dateien Tagged Image Format. Tif-Datei mit demFlex2Volocity Acapella Skript. </li><li><ol><li> Importieren Bilder in ImageJ als Bildsequenz, was zu einem Stapel. </li><li> Wandeln Sie den Stapel in einem 2-Kanal-HyperStack, indem Sie die Image / HyperStack / Stack zu HyperStack Menüpunkt. Die Anzahl der Scheiben müssen zur Hälfte des eingeführten Stapel eingestellt werden. </li><li> Duplizieren Sie die GFP-Kanal mit dem Bild / Befehl Duplizieren: kreuzen Sie das Doppelte HyperStack Checkbox und geben Channels: 1-1. Jenseits verwenden vervielfältigt Stapel. </li></ol></li><li> Wählen Sie Process / Enhance Contrast mit 0,01% gesättigte Pixel, mit Stapel-Histogramm und konvertieren zu 8 Bit mit Image/Type/8-bit. </li><li> Definieren Sie eine 15 Pixelradius lokale adaptive Segmentierung mit den Bernsen Algorithmus mit Kontrastschwelle (Parameter 1) q = 30. Kreuzen Sie die Weiße Objekte auf schwarzem Hintergrund Checkbox in der Bild / Anpassen / Auto Local Threshold-Menü. </li><li> Segmentation Qualitätskontrolle: Erzeugung segmentierter Objektkontur Overlay auf den Originalbildern. </li><li> Feature Extraktion durch Analyse von Partikeln: Messbereich, Mittelwert und insgesamt Intensität jeder Organelle. Ergebnis speichern Dateien. </li><li> Öffnen Sie die Eigenschaften ergeben Datei in R und erzeugen ein Histogramm. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Unter normalen Bedingungen Grb2 wird während der gesamten Zelle lokalisiert. Bei Stimulierung eines Wachstumsfaktor-Rezeptors ist transloziert zur Plasmamembran und anschließend in Endosomen internalisierten wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Expression eines Zelloberflächen-Rezeptor binden kann Grb2 ist ausreichend, um die Translokation zu induzieren. In einem typischen Experiment Screening, wird keine Änderung in GFP-Grb2 Körperregion beobachtet. Wenn jedoch ein Protein exprimiert wird, dass ein Grb2 Rekruten subzelluläre Ort, gibt es eine Änderung in der Lokalisierung, die leicht sichtbar gemacht werden kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Zum Beispiel werden die Expression der EGFR führt Relokalisation von GFP-Grb2 um Endosom Strukturen (Abbildung4). Wenn somit Anwenden einer Genom-weiten Bibliothek, kann erwartet werden, dass neuartige Grb2-bindende Zelloberflächenproteine ​​identifiziert werden kann. Dieses Verfahren ist nicht auf die Detektion von Zelloberflächenproteinen begrenzt. Zum Beispiel induziert Dynamin2 eine Änderung in sub-zelluläre Lokalisation von GFP-Grb2 Anzeige Endosom-like Rekrutierung (Abbildung 5). Dynamin2 bindet an das C-terminale SH3-Domäne von Grb2 und in Endozytose dieses Komplexes 9,10 beteiligt. Somit ermöglicht dieser Ansatz die allgemeine Identifizierung von Protein-bindenden Komplexe und ist nicht auf die Identifikation der Interaktionspartner für die SH2-Domäne begrenzt. Mehrere verschiedene Typen von Translokation kann wie Lokalisierung zur Plasmamembran zu erwarten ist, um Endosomen anderen cytoplasmatischen vesikulären Strukturen oder den Zellkern. Daher ist es empfehlenswert, dass alle Bilder auch von Auge inspiziert. Allerdings, wenn Screening großer Mengen von cDNAs eine automatisierteBildanalyse-Algorithmus ist praktischer. In diesem Fall ist eine Kombination der Algorithmen wünschenswert, wie beispielsweise Winkel-Erkennung, um Endosomen Cytoplasma / Kern Detektion identifizieren nuklearen pendelt und allgemeinen morphologischen Algorithmen identifizieren, um zelluläre Formänderungen identifizieren. Die Verwendung dieser unterschiedlichen phänotypischen Nachweisverfahren hat an anderer Stelle 11 diskutiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Das Experiment Angaben eine komplette High-Content-Screening Workflow beginnend mit der Amplifikation und Präparation der cDNA-Bibliothek, die Transfektion von cDNA-Vektoren sowie Reporterkonstrukte, Bildaufnahme und Bildauswertung unter Verwendung des freien offenen Software imagej. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> FBBILDUNG 2. Konfiguration der Tecan Deck. (1) Auf der linken Seite, müssen fünf 100 ml Tröge mit Puffer 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) und A4 (100 ml) gefüllt. Trough A4 müssen einmal während des Verfahrens wieder gefüllt. (2) Der Vakuumverteiler an Position 14 in diesem Beispiel befindet. (3) Der Deepwell Platte mit bakteriellen Pellets auf Position 30, neben dem Elutionspuffer Trog mit 25 ml Elutionspuffer befindet. (4) Einweg-Tips für den 8-Kanal-Kopf müssen in den Spitzenracks auf der linken Seite und Tipps für die Mehrkanal-Kopf geladen werden müssen, auf Position 40 gefüllt werden. Die Tecan FreedomEvo Liquid Handler, die in diesem Experiment verwendet wird, wird mit 500 ul Spritzen ausgestattet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> Abbildung3. Automatisierung der Bildaufnahme über die Opera LX. A) Wählen Sie die Registerkarte Konfiguration (1). Aktivieren die Laserlinien zum Versuch (2) erforderlich. Wählen Sie die Kameras zur Bildaufnahme (3). Wählen des plattenförmigen und die Objektivlinse für das Experiment (4). B) Wählen Sie das Mikroskop Registerkarte (1). Definieren Sie die Lichtquelle und die Belichtungszeit für die Exposition 1 (2,3). Konzentrieren Sie sich auf ein gut und nehmen Höhe (4). C) Wählen Sie das Experiment Registerkarte Definition (1). Drag &amp; Drop Belichtung, skewcrop, Referenz, Layout und sublayout Dateien (2). Drag &amp; Drop das Experiment Datei (3). D) Wählen Sie Automatische Experiment (1). Drag &amp; Drop Experiment Datei (2). Bereitstellung angemessener Barcode (3). Starten Bildaufnahme, indem Sie auf die Start-Taste (4). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 4. GFP-Grb2-Translokation durch cDNA Ausdruck. GFP-Grb2 zieht aus einem überwiegenden cytoplasmatische Lokalisation an Endosom-ähnliche Strukturen auf Überexpression eines Transmembran Wachstumsfaktor-Rezeptor internalisiert und anschließend um Endosomen. Auf der linken Seite sind Mikroskopie-Aufnahmen von COS M6 Zellen gezeigt, dass wurden transient mit GFP-Grb2 (oben) oder GFP-Grb2 und EGFR (unten) transfiziert. Co-Expression von EGFR den Ergebnissen bei der Verlagerung von GFP-Grb2 um Endosom-ähnlichen Strukturen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiel cDNA-induzierte Translokation von GFP-Grb2. Die GTPase Dynamin2, die in Grb2 Endocytose beteiligt ist, verlagert, um GFP-Grb2 Endosom Strukturen (eingekreist). In diesem Experiment wurde GFP-Grb2 mit DNM2 in HEK293T-Zellen co-transfiziert. Die Zellen wurden mit Hoechst 33342 gefärbt nach 24 h und Bilder auf dem Ope erworben wurdenra LX. Einem Sichtfeld des grünen (GFP) Kanal und der UV (blau; Hoechst 33342) angezeigt wird.

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	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Expressionsklonierung ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das in der Vergangenheit verwendet wurde, um neuartige zellulären Komponenten wie Viren Rezeptoren und Blutzellen-Antigene 12 identifizieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die Identifikation von neuartigen putativen Signaltransduktion Rezeptoren binden, die Grb2 erleichtern. Es gibt ein paar wichtige Schritte im Protokoll. <ol><li> Für die automatisierte Plasmidpräparation ist es unbedingt erforderlich, um eine vollständige Resuspension des Bakterienpellet haben. Manchmal ist es notwendig, eine rigorose Schüttelschritt oder weitere Vermischung mit Pipetten umfassen. </li><li> Bei der Zugabe der Lösung 2 und 3, vollständige Vermischung notwendig und wir haben herausgefunden, dass der versiegelte manuell invertierenden Platte effizienter ist als die Verwendung eines automatisierten Schüttler ist. Pipettiervorrichtung sollte in diesem Schritt vermieden werden, da sie auf Scherung der DNA führen würde. </li><li> In allen Vakuumöffnungen Schritte, muss man sicherstellen, dass die Flüssigkeit vollständig entwässertvon der Platte. Ansonsten niedrigen Renditen zu erwarten sind. </li><li> Bei der Elution, ist es durchaus üblich, dass Eluat Form an der Unterseite des Plasmids Bindungsplatte abfällt. Diese Tropfen müssen in der Elution Platte gesammelt werden, so empfiehlt es sich, dass das Plasmid Bindungsplatte sorgfältig und hob alle restlichen Tropfen an der Unterseite sorgfältig zu dem Eluat Platte übertragen. </li><li> Während der Transfektion, ist die Zeit der Komplexbildung kritisch. Wir gehen normalerweise in 20-30 min halten. Längere Zeiten bis zu 1 h sind ohne Verringerung der Ausbeute in Ordnung, während kürzere Zeiten nicht empfohlen. </li><li> Für die Mikroskopie, ist die Wahl der Vergrösserung wichtig. Auf der Opera LX hier verwendete System ist die Auflösung bei 20x ausreichen, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Wenn Bilder mit höherer Auflösung erforderlich sind, das Ziel verändert werden kann, sondern um statistisch signifikante Anzahl von Zellen zu erhalten, werden eine größere Anzahl von Feldern und höheren Erfassungszeiten erforderlich. Im Allgemeinen streben wirauf mindestens 100 Zellen pro Vertiefung erhalten abgebildet. </li></ol> Der Assay wurde Grb2 Translokation von anderen Gruppen verwendet worden, um kleine Moleküle als Inhibitoren von EGFR-Kinase-Aktivierung 6 identifizieren. In diesem Fall wird die EGFR spezifisch mit Ligand Bewirken Rekrutierung von Grb2 zur Plasmamembran aktiviert. Disruption dieser Interaktion kann dann untersucht mit kleinen Molekülverbindungen werden. Ebenso kann vorgesehen sein, dass siRNA Screens eingesetzt werden können, um endogene Gene EGFR-Signalgebung Grb2 oder andere Grb2-bindenden Wachstumsfaktor-Rezeptoren, wie c-KIT oder Erythropoietin-Rezeptor beteiligt identifizieren. Somit gibt es mehrere mögliche Anwendungen für diese Technik. Ein analoger Ansatz könnte auf GFP-markierten Reporter für andere Adapter Moleküle wie Shc, Gab oder IRS angewendet werden. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung dieser zellbasierten Assay in Säugetierzellen ist, dass sie die Identifizierung von physiologisch rel ermöglichtvanten Interaktionen. Der Test ist ein Messwert für Protein-Komplex Bildung, aber noch wichtiger ist, die relevanten Wechselwirkungen an der richtigen subzellulären Ort überwacht. Diesbezüglich überwindet diese Technik Artefakte aus anderen Protein-Protein-Wechselwirkung Methoden wie Hefe-Zwei-Hybrid-oder in vitro-Assays. Es sollte allerdings angemerkt werden, dass indirekte Wechselwirkungen könnten auch Grb2 Einstellung führen. Ebenso kann die transkriptionelle Hochregulation von Bindungspartnern von cDNA-Expression induziert werden. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, ist es erforderlich, die entsprechenden sekundären Assays durchzuführen, um zwischen direkter und indirekter Bindung Wirkungen unterscheiden. Abschließend verspricht der GFP-Adaptormolekül Translokation Assay hohes Potenzial für genomweite Screening und Wirkstoffsuche Anwendungen.

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> cDNA-Bibliothek </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + Amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gasdurchlässigen Dichtungen </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin 96 Plasmid Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625,4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Freedom Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Mit Vakuum-Verteiler </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opera LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

Signaltransduktion durch Wachstumsfaktor-Rezeptoren ist wesentlich für Zellen zur Proliferation und Differenzierung zu halten und erfordert eine strenge Kontrolle. Signaltransduktion wird durch Bindung eines Liganden an einen externen Transmembranrezeptor und Aktivierung der nachgeschalteten Signalkaskaden initiiert. Ein wesentlicher Regulator von mitogener Signalgebung ist Grb2, eine modulare Protein eines internen SH2 (src-Homologie 2)-Domäne durch zwei SH3-Domänen, die enzymatische Aktivität fehlt flankiert zusammengesetzt. Grb2 konstitutiv mit der GTPase son-of-Sevenless (SOS) über seine N-terminale SH3-Domäne verbunden. Die SH2-Domäne von Grb2 bindet an Rezeptoren der Wachstumsfaktoren an phosphorylierte Tyrosinreste damit Kopplung Aktivierung des Rezeptors an die SOS-Ras-MAP-Kinase-Signalkaskade. Darüber hinaus haben weitere Rollen für Grb2 als positiver oder negativer Regulator der Signalisierung und Rezeptorendozytose beschrieben worden. Der modulare Aufbau der Grb2 legt nahe, dass es zu einer Vielzahl von Rezeptoren und Transduktion andockene signalisiert entlang einer Vielzahl verschiedener Wege 1-3. Beschrieben ist hier eine einfache Mikroskopie Assay, Rekrutierung von Grb2 überwacht an der Plasmamembran. Es ist aus einem Assay, der Änderungen in subzellulären Lokalisation von grün-fluoreszierende Protein (GFP)-tagged Grb2 in Reaktion auf einen Reiz 4-6 misst angepasst. Plasmamembran-Rezeptoren, wie Grb2 aktiviert Epidermal Growth Factor Receptor binden (EGFR) Rekrutenschule GFP-Grb2 zur Plasmamembran auf cDNA-Expressions und anschließend endosomalen Kompartimenten in der Zelle zu verlagern. Um in vivo-Protein-Komplexe von Grb2 identifizieren, kann diese Technik verwendet, um eine genomweite High-Content-Bildschirm auf Veränderungen in Grb2 subzelluläre Lokalisation basierend auszuführen. Die Herstellung von cDNA-Expressionsbibliothek Klone, Transfektion und Bildaufnahme werden im Folgenden ausführlich beschrieben. Im Vergleich zu anderen Methoden verwendet werden, um genomische Protein Interaktionspartner zu identifizieren, wie zB Hefe-Zwei-hybrid erlaubt diese Technik die Visualisierung von Proteinkomplexen in Säugerzellen im subzelluläre Ort der Interaktion mittels Mikroskopie-basierten Assay. Daher beide qualitativen Merkmale wie Muster der Lokalisierung kann beurteilt, sowie die quantitative Stärke der Wechselwirkung werden.

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung von neuartigen Signalisierung zuständigen Transmembranrezeptoren beschrieben. Diese Methode ist zugänglich für großflächige Automatisierung und ermöglicht Vorhersagen über<em&gt; In vivo</em&gt; Proteinbindung und die sub-zelluläre Lokalisation von Protein-Komplexen in Säugetierzellen.

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

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10.5K Aufrufe.  University College London. Ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung von neuartigen Signalisierung zuständigen Transmembranrezeptoren beschrieben. Diese Methode ist zugänglich für großflächige Automatisierung und ermöglicht Vorhersagen über In vivo Proteinbindung und die sub-zelluläre Lokalisation von Protein-Komplexen in Säugetierzellen.

Serie: A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

In-vitro-Analyse der PDZ-abhängigen CFTR Makromolekulare Signalkomplexe

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...