Die pMSCV-AID-I-Thy1.1 und pKat2 Vektoren wurden freundlicherweise von DG Schatz und die pVSV-G, pRSV-Rev und pMDLg / pRRE Vektoren wurden freundlicherweise von BR Cullen.

1. Probenvorbereitung und Zellen <ol><li> Führen Sie eine mittlere Vorbereitung von DNA (Midiprep) der Überexpression oder shRNA-haltigen Konstrukte und die retroviralen Vektors Verpackung pKat2 oder lentiviralen Verpackung Vektoren pVSV-G, pMDLg / pRRE und pRSV-Rev 25. Verwenden Sie 6 ug DNA für jedes Konstrukt und entweder 4 pg pKat2 (für retrovirale Infektionen) oder 1,5 ug DNA für jedes der pVSV-g, pMDLg / pRRE und pRSV-Rev Verpackung Vektoren (für lentiviralen Infektionen). </li><li> Bereiten Sie BOSC 23 Medien. Für die Transfektion mit beiden unverändert Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) sowie komplette DMEM. Um komplette DMEM, fügen Sie 1% HEPES-Puffer, 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PGS), und 10% Neugeborenen Kälberserum (NCS), um eine Flasche DMEM. </li><li> Bereiten Ramos Medien. Für die Infektion Schritt machen kompletten RPMI-1640 Medium (RPMI) durch Zugabe von 1% HEPES, 1% PGS, und 10% fötalem Rinderserum (FBS), um eine Flasche RPMI. Für einzelne Zelle Aussaat Schritt make &quot;konditioniert&quot; Medien durch die wachsende Ramos-Zellen in komplettem RPMI für 2 Tage, Abzentrifugieren der Zellen nach unten bei 400 X g für 4 Minuten und Filterung der Überstand mit einer 0,2 um Filter in eine sterile Flasche. Wie andere komplette Medien ist konditionierten Medien bei 4 ° C gelagert, bis sie benötigt. </li><li> Split 3 x 10 6 BOSC 23-Zellen in einen 100-mm-Platte in 10 mL kompletten DMEM Tag vor der Transfektion so dass die Zellen bei 50-60% Konfluenz Tag der Transfektion werden. Machen Sie eine Platte von Zellen für jeden Vektor Sie planen Transfektion. Es ist wichtig, dass die Zellen nicht in Kultur zu lange gehalten, die Nutzung niedrigen Durchgang Anzahl Zellen oder kürzlich aufgetauten Zellen sowohl für die Transfektion und Infektion vor, um einen guten Infektion zu versichern. </li><li> Fügen Sie Steuerelemente für Ihre Experimente. Für Transfektionen und Infektionen, erstellen Sie eine Negativ-Kontrolle (nicht transfizierte oder infizierte Zellen) und eine positive Kontrolle (Virus, das GFP und Puromycin Resistenzgen-Ausdruck). Für shRNA knock-down experiments, infizieren auch mit einem Rühr-oder irrelevant shRNA Kontrolle. </li></ol> 2. Transfektion BOSC 23-Zellen <ol><li> Wärmen Sie die Flaschen unverändert DMEM und vollständige DMEM bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus dem BOSC 23-Zellen und ersetzen mit 5 ml komplettem DMEM. Bringen Sie die Zellen auf eine 37 ° C Inkubator bis zur Verwendung in Schritt 2.6. </li><li> Wärmen Sie die Flasche FuGENE 6 bei Raumtemperatur für 5 Minuten dann kurz vortexen (&lt;1 Sekunde). </li><li> Aliquot 600 ul DMEM unverändert in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Verdünnen Sie 30 ul FuGENE 6 in die 600 ul DMEM unverändert, kurz vortexen (&lt;1 Sekunde) und dann bei Raumtemperatur inkubieren für fünf Minuten. Achten Sie darauf, direkt Pipette in den Medien. Lassen Sie sich nicht die FuGENE 6 Berühren Sie die Seiten des Rohres. </li><li> Add 6 ug konstruieren und entweder 4 ug pKat2 (retrovirale Infektionen) oder 1,5 ug jedes pVSV-G, pMDLg / pRRE und pRSV-Rev (lentiviralen Infektionen), die DMEM / FuGENE 6-Mix, Wirbel bri<html> eFly (&lt;1 Sekunde) und dann bei Raumtemperatur inkubieren für 25 Minuten. </li><li> Fügen Sie die DNA / DMEM / FuGENE 6 mischen, um die BOSC 23-Zellen und zu einer 37 ° C Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden, 5 ml komplettem DMEM auf die transfizierten Zellen und Rückkehr zu einer 37 ° C Inkubator für weitere 24 Stunden. </li></ol> 3. Harvesting Viruspartikel <ol><li> Ernten Sie die 10 ml Medium aus dem transfizierten BOSC 23 Zellen mit einer 10 ml-Spritze. </li><li> Bringen Sie ein 0,45 um-Filter bis zum Ende der Spritze und Filter der Medien in ein sauberes 15 ml Polypropylen-Röhrchen. </li><li> Verwenden Sie die viralen Medien sofort oder einfrieren als 1 mL Aliquots in 2 ml Kryoröhrchen bei -80 ° C. </li><li> Nach der Ernte der viralen Medien, bestätigen, dass effiziente Transfektion wurde in der positiven Kontrolle Zellen durch FACS aufgetreten. Dies kann auch für alle Proben durchgeführt werden, wenn das Konstrukt enthält entweder ein fluoreszierendes (zB GFP) oder ein Zelloberflächen-Marker (zB Thy1). </li></ol>itel &quot;&gt; 4. Infecting B-Zellen <ol><li> Seed 2 mL von 2 x 10 5 Zellen / ml Ramos-Zellen in komplettem RPMI in einer 6-Well-Platte 24 Stunden vor der Infektion. Auch hier achten Sie darauf, niedrigen Durchgang Anzahl Zellen oder kürzlich aufgetauten Zellen zu verwenden, um gute Infektion zu versichern. </li><li> Bei Verwendung von eingefrorenen Aliquots von Virus, tauen die virale Medien schnell bei 37 ° C. </li><li> Mix 1 mL viralen Medien mit 3 ul von 10 mg / mL Polybren. Die Endkonzentration von Polybren sollten 10 ug / ml in einem Gesamtvolumen von 3 mL werden. </li><li> Fügen Sie den Virus / Polybren Mix zu den Zellen und gut mischen durch Pipettieren. Wie bereits erwähnt, ein gut sollte einem nicht infizierten Kontrolle verwendet werden, fügen Sie 1 mL komplettem RPMI und 3 ul Polybren diese auch anstelle von 1 ml Virus. Achten Sie darauf, ein gut infizieren mit einem abgestimmten negative Kontrolle. Wir haben auch infizieren man gut mit einem GFP-enthaltenden Vektor, um Infektionen Effizienz durch FACS zu bestimmen. </li><li> Zentrifugieren Sie die 6-Well-Platte bei 3000 X g für 90 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bringen Sie die Platte37 ° C Inkubator für 48 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden, Spin-down der infizierten Zellen in einer 15 ml Polypropylen-Röhrchen bei 400 X g für 4 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Medien durch Aspiration, dass auf jeden Fall nicht stören das Zellpellet. Resuspendieren der Zellen in frischem RPMI. </li><li> Bestätigen Sie die Effizienz der Infektion in die positive Kontrollprobe durch FACS. Nach wie vor können Sie diese für Ihre Proben tun, wenn das Konstrukt enthält entweder ein fluoreszierendes (zB GFP) oder ein Zelloberflächen-Marker (zB Thy1). </li><li> Starten Sie eine Selektion von Zellen (wenn zutreffend). Unsere shRNA-haltigen Konstrukte enthalten alle eine Puromycin-Resistenz-Kassette. Wir wählen shRNA-infizierten Ramos-Zellen mit 0,25 pg / ml Puromycin. Wir finden, dass Derivate von Ramos-Zellen zeigen manchmal die Anfälligkeit für Puromycin verändert, und deshalb führen wir töten Kurven, um die Konzentration von Puromycin für jede Ableitung zu optimieren. Auch behandeln infizierten Kontroll-Zellen mit Puromycin, um zu bestätigen, dass die Auswahl wirksam ist. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Einzel-Zell-Aussaat Einzel Aussaat kann in einem von zwei Wegen durchgeführt werden: durch FACS-Sortierung oder manuell. <ol><li> FACS: Mit einem FACS-Sorter mit einem Adapter für Saatgut 1 Zelle / well in einer 96-Well-Platte mit 100 ul 40% RPMI/40% konditioniert media/20% FBS vorgefüllt. Diese Methode gibt eine Menge mehr einzelne Zellklone pro Platte. </li><li> Manuell: Zählen Sie die Zellen. Einen aliquoten von Zellen bis 10 Zellen / ml in 40% RPMI/40% konditioniert media/20% FBS. Verwenden Sie 10 mL der verdünnten Zellen für jedes gesetzte Platte. Verschiedene Klone variable Erholung in diesem Stadium zeigen daher sinnvoll, mehrere Platten in unterschiedlichen Konzentrationen (im Bereich von 3 bis 20 Zellen / ml). Verwenden Sie die eine, die weniger Auswüchse, um Klone, die aus mehreren Zellen zu vermeiden) produziert. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, Saatgut 96-well-Platten mit 100 ul der verdünnten Zellen. </li><li> Die Platte wird in einem 37 ° C Inkubator für 2 Wochen. </li><li> Prüfen Sie die einzelnen Vertiefungen under das Mikroskop auf das Vorhandensein von Zellen einen Tag nach Aussaat zu bestätigen. Einzelne Zellen können schwierig zu finden, durch die Notwendigkeit, auf die richtige Tiefe zu konzentrieren. Die Konzentration auf das Wohl Zahlen am unteren Rand der 96-Well-Platte eingeprägt sollte helfen. Die Zellen sind leichter zu finden, wenn durch die FACS-Sorter ausgesät, da die meisten Brunnen einer Zelle haben. </li><li> Nach 2 Wochen kann wachsende Kolonien kaum mit bloßem Auge werden, indem man die Platten von unten gesehen. Sie sind viel leichter zu unter dem Mikroskop zu sehen. Kolonien neigen dazu, an den Rändern des Brunnens und in der Regel die meisten Kolonien in einer Platte wachsen entlang der gleichen Kante in verschiedenen Vertiefungen wachsen. Mark Wells mit robusten Zelle Wachstum und die Übertragung der Zellen auf 24-Well-Platten in 1 ml RPMI und Rückkehr zu einer 37 ° C Inkubator. </li><li> Pflegen Sie Zellen mit 1 x 05 bis 1 Oktober x 10 6 Zellen / ml. Ändern Sie die Medien, durch Drehen der Zellen bei 400 X g für 4 Minuten bei Raumtemperatur und Entfernen von den Medien als notwendig. Ersetzen Sie mit 1 ml frisches RPMI. </li><li> Nach mehreren days des Wachstums, der Transfer der Zellen auf einer 6-Well-Platte und weiter wachsen in einem 37 ° C Inkubator. </li><li> Nach 3 Wochen, analysieren die Klone für IgM Verlust (wie unten beschrieben). </li><li> Weiter zu den Zellen für weitere 2 Wochen wachsen und dann analysieren die Klone wieder an der 5 Wochen Zeitpunkt. </li></ol> 6. Analyse: IgM Verlust (3 und 5 Wochen) <ol><li> Aliquot 5 x 10 5 Zellen aus jeder Vertiefung in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie die Zellen nach unten bei 400 X g für 4 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie Zellen, die aus jedem der Steuerung und shRNA-knock-down Brunnen, sowie eine Probe für eine ungefärbte Kontrolle. </li><li> Waschen Sie die Zellen in 1 ml PBS und dann wieder drehen sich mit 400 X g für 4 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren in 50 ul PBS (ungefärbte Kontrolle) oder PBS + 1:20 Verdünnung von PE-markiertem α-human-IgM-Antikörper. Inkubieren auf Eis für 1 Stunde. </li><li> Drehen Sie die Zellen nach unten bei 400 X g für 4 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die cEllen zweimal mit 1 ml PBS und Spin für 400 X g für 4 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 100 ul PBS. Übertragen Sie die resuspendiert gefärbten Zellen auf eine FACS-Röhrchen. </li><li> Analysieren Sie die Zellen mit Hilfe eines FACS-Maschine. </li><li> Vergleichen Sie den Prozentsatz der IgM - Zellen aus den Kontrollen im Vergleich zu den shRNA Boden geworfen Zellen. Wie bereits erwähnt, ist IgM Verlust durch FACS gemessen eine zuverlässige semi-quantitatives Maß für SHM in Ramos-Zellen. </li></ol> 7. Analyse: Bestätigen knock-down durch quantitative RT-PCR (5 Wochen) <ol><li> Aliquot 3 x 10 6 Zellen aus jeder Vertiefung und Spin-down bei 400 X g für 4 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten RNA aus den aliquoten Teilen von Zellen. Wir verwenden TRIzol nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Bereiten cDNA aus der RNA prep. Wir verwenden 2 pg RNA und Superscript II nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie eine quantitative PCR mit der cDNA zur Bestätigungm knock-down. Wir verwenden GAPDH als Normalisierung Kontrolle, und die SYBR FAST qPCR Kit in einem 10 ul Reaktionsvolumen. </li></ol> 8. Analyse: Direkte Sequenzierung (5 Wochen) <ol><li> Aliquot 5 x 10 6 Zellen aus jeder Vertiefung und Spin-down bei 400 X g für 4 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Isolieren von genomischer DNA aus diesen Zellen. Wir verwenden den Assistenten SV genomische DNA Purification Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> PCR zu amplifizieren der genomischen DNA für die Ig V-Gene 19 (Tabelle 1) und alle anderen Gene von Interesse mit dem KAPA HiFi-DNA-Polymerase. Wir verwenden diese Polymerase aufgrund ihrer geringen Fehler-Raten, aber keine High-Fidelity-PCR-Polymerase sollte akzeptabel sein. </li><li> Gel reinigt die PCR-Produkte auf einem 1% Agarosegel mit dem QIAquick Gel Extraction Kit. </li><li> Einige Polymerasen einen einzelnen Desoxyadenosin (A) Rest der 3 &#39;Enden der PCR-Produkte, während andere dies nicht tun. Diese 3 &#39;A Schwänze sind für den TOPO TA notwendigKlonierungsschritt. Die KAPA HiFi-Polymerase nicht verlassen 3 &#39;A Schwänze. A-Schwanz der PCR-Produkte durch Inkubation 25 ul Gel-gereinigtes PCR-Produkt mit 3 ul 10x Taq Reaktionspuffer, 1 ul 10 mM dNTPs und 1 Einheit Taq-Polymerase bei 72 ° C für 30 Minuten. </li><li> Clone dem Gel-gereinigten PCR-Produkte mit dem TOPO TA Cloning-Kit. Transformieren Sie die Produkte aus dem TOPO Reaktion in die dafür vorgesehenen E. coli DH5-T1 R kompetenten Zellen und Teller auf LB / Agarplatten mit 100 ug / ml Ampicillin und ergänzt mit 1,6 mg X-gal nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Send einzelnen Kolonien für die Sequenzierung. </li><li> Führen Sie die Sequenzanalyse, um Typen und Standorte von Mutationen zu bestimmen. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse: Wie bereits erwähnt, verwenden wir eine positive Kontrolle viraler Vektor, die sowohl GFP sowie eine Puromycin-Resistenz-Gen exprimiert. Wir sehen in der Regel 50-75% GFP +-Zellen 2 Tagenach der Transfektion. In unserem Infektionen, wir in der Regel 50-70% sehen Zellen sind GFP + 2 Tage nach der Infektion, aber vor der Auswahl. Nach der Auswahl abgeschlossen ist, sind&gt; 95% der Zellen GFP +. Als Vertreter Experimenten zeigen wir die Auswirkungen der Überexpression von AID oder umzuwerfen eine Reparatur Faktor in Ramos-Zellen. Insbesondere transfizierten wir eine retrovirale Überexpression Vektor für AID über ein IRES Site Thy1.1 zusammen mit dem retroviralen Vektors Verpackung pKat2 in BOSC 23-Zellen verknüpft. Virus-haltigen Medien wurde filtriert und anschließend verwendet, um Ramos-Zellen zu infizieren. Sowohl Wildtyp (WT) und AID-überexprimierenden (AID hallo)-Zellen wurden einzelne Zelle ausgesät und angebaut für 3 Wochen (Abbildung 3, an welcher Stelle sie für die Genexpression wurden durch qRT-PCR (Abbildung 2) und für IgM Verlust durch FACS analysiert ). Für die FACS-Färbung wurden die Zellen mit den beiden 1:20 verdünnt PE-markiertem α-human-IgM-Antikörper sowie 1:400 verdünnt FITC-markiertem α-Ratte CD90/mouse inkubiertCD90.1 (Thy1.1) Antikörper. In einem separaten Experiment wurden Lentiviren, die entweder eine irrelevante shRNA (Kontrolle) oder eine shRNA gegen einen High-Fidelity DNA-Reparatur-Faktor erwartet, dass gegen SHM schützen BOSC 23-Zellen gemacht, und dann infiziert zu einem AID hallo Klon von Ramos-Zellen. Wieder waren die Genexpression (Abbildung 4) und IgM-Verlust (Abbildung 5) in einzelne Zellklone nach 3 Wochen analysiert. Da die Reparatur Faktor ist gedacht zum Schutz vor Mutationen während SHM geben, sehen wir eine Erhöhung der IgM Verlust und SHM im Fehlen des Faktors. Wenn wir ein Faktor bei der Erzeugung von SHM-assoziierte Mutationen beteiligt war, zu Boden geworfen, hätten wir einen Rückgang der IgM Verlust gesehen, statt zu haben. Wie erwartet, zeigen unsere qRT-PCR-Ergebnisse eine deutliche Erhöhung der Entwicklungshilfe Ausdruck nach der Infektion von Zellen mit einem AID-Überexpression Vektor (Abbildung 2), während das Niveau der DNA-Reparatur-Faktor Drop in das Vorhandensein einer gezielten shRNA gegen diesen Faktor (Abbildung 4 ). Da in den einzelnen clones kann variieren, sehen Sie möglicherweise einige Variationen in der Genexpression Ebenen. Da Genexpression kann variieren, ist es notwendig, den Ausdruck in jedem Klon Ihnen bei der Planung auf die Analyse weiter zu bestätigen. Verschiedene shRNAs gegen das gleiche Gen können unterschiedliche Auswirkungen auf die Genexpression als auch, so sollten Sie mehrere shRNAs Bildschirm, um festzustellen, welche den größten Einfluss. Knockdown kann auch auf Protein-Ebene durch Immunoblot bestätigt werden. Ebenso können einzelne Klone stark variieren in Stufen von IgM-Verlust. Einige Klone könnten zeigen, ein &quot;Jackpot&quot;-Effekt, wo ein IgM-Mutation in einem der frühesten Zellteilungen eingetreten - zum Beispiel, werden Sie&gt; 50% IgM Verlust zu sehen, nur weil einer der Zellen IgM wurde - im Zwei-Zell-Stadium. Der Einfluss dieser Klone wird durch die Ermittlung des Medians für mehrere einzelne Zellklone minimiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematic für die transfection, Infektion und Analyse von IgM Verlust. Siehe Text für Details. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig2.jpg" /> Abbildung 2. AID-Überexpression in Ramos-Zellen. WT und AID hallo Ramos-Zellen wurden einzelne Zelle geklont gewachsen und für 3 Wochen, an welcher Stelle AID Expression in einzelnen Klone durch qRT-PCR gemessen wurde. GAPDH-Expression wurde zur Normalisierung verwendet. WT wurde auf 1 gesetzt. Der Medianwert angegeben. * Zeigt einen p-Wert von &lt;0,01, als One-tailed Student t-Test berechnet. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig3.jpg" /> Abbildung 3. Erhöhte IgM Verlust in AID hallo Zellen zu WT-Zellen verglichen. Oberflächen-IgM wurde durch FACS an der 3 Wochen Zeitpunkt gemessen, und der Prozentsatz der IgM Verlust war für WT und AID hallo Zellen berechnet. (A) Repräsentative FACS Handlung eines WT-Klon und ein AID hallo zu klonen. Die AID-Überexpression vektor hat Beihilfen in Verbindung mit Thy1.1 über ein IRES site, so Thy1.1 Ausdruck ist als Ersatz für AID Ausdruck verwendet. (B) Quantifizierung der IgM Verlust in mehreren WT und AID hallo Klone. Der Medianwert angegeben. * Zeigt einen p-Wert von &lt;0,01, als One-tailed Student t-Test berechnet. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig4.jpg" /> Abbildung 4. Knockdown einer Reparatur Faktor in AID hallo Zellen. Die Zellen wurden entweder mit einem irrelevanten shRNA (Steuerung) oder unsere shRNA von Interesse (shRNA), und einzelne Zelle seeded infiziert. Nach 3 Wochen wurde die Genexpression in einzelnen Klone durch qRT-PCR gemessen. GAPDH-Expression wurde zur Normalisierung verwendet. WT wurde auf 1 gesetzt. Der Medianwert angegeben. * Zeigt einen p-Wert von &lt;0,01, als One-tailed Student t-Test berechnet. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig5.jpg" /> Abbildung 5. Erhöhte IgM Verlustin AID hallo Zellen mit Boden geworfen Ebenen einer Reparatur Faktor. Oberflächen-IgM in mehrere Klone wurde durch FACS an der 3 Wochen Zeitpunkt gemessen, und der Prozentsatz der IgM Verlust war in Zellen noch überexprimierenden AID berechnet. Der Medianwert angegeben. * Zeigt einen p-Wert von &lt;0,01, als One-tailed Student t-Test berechnet. <img src="/files/ftp_upload/3573/3573table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> . Tabelle 1 Primer-Sequenzen für die Ig-Gene 19: die konstante Region Cμ, die schwere Kette V-Region (V H) und die leichte Kette V-Region (V L).

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line.">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li><li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines.">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li><li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes.">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li><li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position.">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt's+lymphoma+cell+line.">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li><li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a:T+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location.">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+class+switching+of+an+IgM++B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA++cells.">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells.">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wie bereits erläutert, haben Zelllinie Modelle für die Antikörper-Diversifizierung zu einem beliebten Ausgangspunkt, um neuartige Proteine, die verschiedene Schritte Einfluss während Antikörper Diversifizierung zu identifizieren. Wir stellen hier ein Verfahren zur Verwendung Virusinfektion entweder knock-down oder überexprimieren Proteine ​​in der Ramos B-Zell-Linie und dann die Auswirkungen auf SHM. Für diese Studien nutzen wir sowohl WT Ramos und AID hallo Ramos-Zelle...

Empfohlene Reagenzien - die meisten von ihnen kann mit ähnlichen Produkten anderer Hersteller ersetzt werden. <table border="1" ><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th > Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td > 6-well klaren TC-behandelten Platten </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mL BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-well klaren TC-behandelten Platten </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96-well deutlich flacher Boden Polystyrol TC-behandelten Mikrotiterplatten </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm TC-behandelten Kulturschalen </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Acrodisc Spritzenfilter, 0,45 um </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicillin </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / mL in Wasser </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > oder ähnliche </td></tr><tr><td> BD Falcon Rundboden Polystyrol-Röhrchen </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > für FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23-Zellen </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2-Inkubator in der Lage 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (fötales Rinderserum) </td><td > Gemini-Bio-Produkte </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-Ratte CD90/mouse CD90.1 Antikörper </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfektionsreagenz </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES-Pufferlösung </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi-DNA-Polymerase </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB Broth (Lysogenie Brühe - Luria) Pulver </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSION TRC shRNA bakterielle Glycerin Lager </td><td > Sigma </td><td ></td><td> shRNA-Vektoren </td></tr><tr><td > NCS (Neugeborenen Kälberserum) </td><td > Gemini-Bio-Produkte </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (Phosphat-gepufferte Lösung) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > verdünnt auf 1x im Wasser </td></tr><tr><td > PE α-human-IgM-Antikörper </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung) </td><td > Gemini-Bio-Produkte </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (Hexadimethrinbromid) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / mL in Wasser </td></tr><tr><td > PureYield Plasmid Midiprep-System </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 ug / mL in Wasser </td></tr><tr><td > QIAquick Gel Extraction Kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) Zellen </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 Medium </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > SuperScript II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR Kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA Polymerase </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Cloning Kit </td><td > Invitrogen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Wizard SV Genomic DNA Reinigungssystem </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-Brom-4-Chlor-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / mL in DMSO </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

B-Zellen beginnen ihr Leben mit niedriger Affinität Antikörper durch V (D) J-Rekombination erzeugt. Doch beim Erkennen eines Krankheitserregers, wird die Variable (V) Region eines Immunglobulins (Ig)-Gen etwa 100.000-fach stärker als der Rest des Genoms durch somatische Hypermutation (SHM), mutiert wodurch Antikörper mit hoher Affinität 1,2. Darüber hinaus produziert der Klasse Switch-Rekombination (CSR)-Antikörper mit verschiedenen Effektor-Funktionen, je nach Art der Immunantwort, die für einen bestimmten Erreger benötigt wird. Beide CSR und SHM durch activation-induced Cytidindeaminase (AID), die Cytosin-Reste in DNA um Uracile produzieren desaminiert eingeleitet. Diese Uracile sind fehleranfällig Formen der Reparaturwege verarbeitet, was schließlich zu Mutationen und Rekombination 1-3. Unser gegenwärtiges Verständnis der molekularen Details der SHM und CSR komme aus einer Kombination von Studien an Mäusen, primäre Zellen, Zelllinien und Zell-free Experimente. Mausmodelle bleiben den Goldstandard mit genetischen Knockouts zeigt eine entscheidende Rolle für viele Reparatur-Faktoren (zB Ung, MSH2, MSH6 Exo1 und Polymerase η) 4-10. Allerdings sind nicht alle Gene zugänglich für Knockout-Studien. Zum Beispiel sind Knockouts von mehreren Doppelstrangbruch Reparatur-Proteine ​​embryonal letalen oder beeinträchtigen B-Zell-Entwicklung 11-14. Darüber hinaus manchmal die spezifische Funktion eines Proteins in SHM-oder CSR kann durch weitere globale Defekte, die durch die Ko verursacht maskiert werden. Darüber hinaus können seit Experimente in Mäusen als langwierig, zu verändern Expression einzelner Gene in Zelllinien ist ein zunehmend beliebtes erste Schritt zur Identifizierung und Charakterisierung Kandidatengene 15-18. Ramos - ein Burkitt-Lymphom-Zelllinie, die konstitutiv erfährt SHM - ein beliebtes Zell-Linie Modell SHM 18-24 Studie. Ein Vorteil der Ramos-Zellen ist, dass sie einen eingebauten günstigen, halb haben-Quantitatives Maß für SHM. Wildtyp-Zellen exprimieren IgM und, wie sie abholen Mutationen, einige der Mutationen knock out IgM Ausdruck. Deshalb Testen IgM Verlust durch Fluoreszenz-activated cell Scanning (FACS) bietet einen schnellen Auslesen für die Höhe der SHM. Eine quantitative Messung der SHM kann durch direkte Sequenzierung der Antikörper-Gene erreicht werden. Seit Ramos-Zellen schwer zu transfizieren sind, produzieren wir stabile Derivate, die erhöht oder gesenkt haben Ausdruck eines einzelnen Gens durch Infektion der Zellen mit retroviralen oder lentiviralen Konstrukte, die entweder eine Überexpression Kassette oder eine kurze Haarnadel-RNA (shRNA), jeweils enthalten. Hier beschreiben wir, wie wir Ramos Zellen zu infizieren und dann diese Zellen die Rolle bestimmter Gene auf SHM (Abbildung 1) zu untersuchen.

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Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Wir beschreiben, wie retroviralen oder lentiviralen Infektionen der Überexpression oder shRNA-Konstrukte, die in das menschliche Ramos B-Zell-Linie und wie somatische Hypermutation in diesen Zellen zu messen. Durchführen

Die Beurteilung Somatische Hypermutation in Ramos B-Zellen nach Überexpression oder Knockdown von spezifischen Genen

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.1K Aufrufe.  Duke University. Wir beschreiben, wie retroviralen oder lentiviralen Infektionen der Überexpression oder shRNA-Konstrukte, die in das menschliche Ramos B-Zell-Linie und wie somatische Hypermutation in diesen Zellen zu messen. Durchführen

Serie: Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression of proteins known to respond to metabolic stress was measured in brain-nuclei isolates using Western blotting. This was done to assess whether metabolic stress-induced nutrient insufficiency in the body triggered neuronal stress. We have previously demonstrated that nutrient insufficiency in neonates elicits metabolic stress in the gut. Furthermore, colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi prior to and after first feed. Signaling protein markers associated with the endoplasmic reticulum stress [ER chaperone binding immunoglobulin protein (BiP), eukaryotic translation initiation factor 2A (eIF2a), and eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], as well as two inflammation-signaling proteins [nuclear factor-&#954;B (NF-kB) and inhibitor &#954;B (IkB)], were measured in newborn brain nuclei [nucleus of the solitary tract (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum nuclei (STR), and medial preoptic nucleus (MPO)] before the first feed (unprimed by colostrum) and after the start of nursing (primed by colostrum). Expression of BiP/GRP78 and p-eIF2a were upregulated in unprimed and downregulated in primed NTS tissue. NF-kB was retained (high) in the CX, STR, and MPO cytoplasm, whereas NF-kB was lower and unchanged in NTS, PVN, and SON in both conditions. The collective BiP and p-eIF2 findings are consistent with a stress response. eIf2a was phosphorylated by dsRNA dependent kinase (p-PKR) in the SON, CX, STR, and MPO. However, in the NTS (and to a lesser extent in PVN), eIf2a was phosphorylated by another kinase, general control nonderepressible-2 kinase (GCN2). The stress-modulating mechanisms previously observed in newborn gut enterocytes appear to be mirrored in some OTR-rich brain regions. The NTS and PVN may utilize a different phosphorylation mechanism (under nutrient deficiency) from other regions and be refractory to the impact of nutrient insufficiency. Collectively, this data suggests that brain responses to nutrient insufficiency stress are offset by signaling from colostrum-primed enterocytes.

Here, we present a protocol to isolate brain nuclei in the neonatal rat brain in conjunction with first colostrum feeding. This technique allows the study of nutrient insufficiency stress in the brain as modulated by enterocyte signaling.

Bewertung von zellulären Stresses und Entzündung im diskreten Oxytocin-sezernierenden Gehirn Kerne bei Neugeborenen Ratten vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...