Dieses Protokoll ermöglicht es Benutzern zu untersuchen, wie das Immunsystem Antikörper gegen Krankheitserreger oder commensale Mikroben produziert. Darüber hinaus können molekulare Wege, die die Immunglobulin-Gendiversifizierung regulieren, mit gentechnisch veränderten Mäusen untersucht werden. Das Protokoll verwendet eine Kombination von gängigen molekularbiologischen Techniken, einschließlich PCR- und Sanger-Sequenzierung, und erfordert keine Einzelzellsortierung oder tiefe Sequenzierung.
Die Peyer-Patches können leicht mit dem umgebenden Fettgewebe verwechselt werden. Daher kann die visuelle Demonstration dieser Methode für diejenigen hilfreich sein, die mit diesem Organ nicht vertraut sind, um seinen Standort zu identifizieren und seine Zerlegung zu beobachten. Beginnen Sie, indem Sie die Maus auf dem Sezierpad mit dem Abdomen ausgesetzt.
Sprühen Sie den Körper der Maus großzügig mit 70% Ethanol, bevor Sie IrgendwelcheSchnitte machen, um den Sezierenbereich zu sterilisieren. Machen Sie einen Schnitt in die Haut über den Bauch und ziehen Sie gleichzeitig auf beiden Seiten des Schnittes mit Fingern oder Zangen. Schneiden Sie dann die Peritonealhöhle mit einer Schere, um die inneren Organe freizulegen.
Suchen Sie den Dünndarm und entfernen Sie ihn, indem Sie unter dem Magen und über dem Cecum schneiden. Entfernen Sie alle Bindegewebe und Fett verbinden die Falten des Dünndarms zusammen. Untersuchen Sie die äußere Oberfläche des Dünndarms auf die Peyer-Patches, bei denen es sich um kleine ovale Strukturen handelt, die unter einer dünnen Schicht von transluzenten Epithelzellen weiß erscheinen.
Alle sichtbaren Peyer-Patches vorsichtig mit einer Schere ablöschen und in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit einem Milliliter FACS-Puffer auf Eis einsammeln. Wenn das gesammelte Gewebe auf den Boden der Röhre sinkt, ist es in der Tat ein Peyer-Patch und kein Fettgewebe. Legen Sie einen 40-Mikrometer-Filter in eine sechs Brunnenschale mit einem Milliliter kalten FACS-Puffer, und gießen Sie dann die Peyer es Patches aus dem 1,5-Milliliter-Rohr auf den Filter.
Verwenden Sie das flache Ende des Kolbens aus einer Ein-Milliliter-Spritze als Stößel, um die Peyer-Patches auf dem Filter zu zerquetschen, bis nur noch das Bindegewebe übrig bleibt. Waschen Sie den Filter und Kolben mit einem Milliliter kalten FACS Puffer, um die Zellen in die sechs Brunnenschale freizugeben. Sammeln Sie die Zellen und filtern Sie sie durch eine 40 Mikrometer Siebkappe FACS Rohr.
Dann waschen Sie die Siebkappe mit einem Milliliter kalten FACS-Puffer. Pellet die Zellen durch Zentrifugieren sie bei 600G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dann dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 0,4 Milliliter kalten FACS Puffer mit FC-Block.
15 Minuten lang Proben auf Eis inkubieren, dann waschen und pellet die Zellen. Um die Keimmittel-B-Zellen oder GCBCs zu färben, setzen Sie die Wildtypzellen in 80 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Entfernen Sie 10 Mikroliter Zellen aus dem wilden Typ Peyer Patches für jede Färbung Kontrolle.
Verlassen von 40 Mikrolitern der Zellsuspension für die Versuchsproben. Alternativ können Sie Kompensationsperlen für die Färbekontrollen verwenden. Färben Sie jede der experimentellen Proben in 500 Mikroliter kalten FACS Puffer mit 2,5 Mikroliter PNA Biotin für 15 Minuten auf Eis.
Dann waschen Sie die PNA-Fleckenzellen. Färben Sie jede Probe mit 500 Mikroliter GCBC-Cocktail im Dunkeln und auf Eis für 15 Minuten, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig im Cocktail resuspendiert werden. Um die einzelnen Fleckenkontrollen für die Kompensationsmatrix vorzubereiten, färben Sie die Zellen in 500 Mikroliter kalten FACS-Puffer mit der im Text angegebenen Verdünnung.
Inkubieren Sie die Färbung Kontrollen in der Dunkelheit auf Eis für 15 Minuten. Fügen Sie zwei Milliliter kalten FACS-Puffer hinzu, um alle Fleckenproben und -kontrollen zu waschen. Pellet die Zellen und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in einem endletzten Volumen von 500 Mikroliter kalten FACS Puffer auf dem Zytometer laufen.
Verwenden Sie dann einen Zellsortierer, um die B220-positiven PNA-Hochzellen aus jeder gebeizten Versuchsprobe zu sammeln. Um die DNA aus den Keimzentrum B-Zellen oder GCBCs zu extrahieren, suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter DNA-Extraktionspuffer und fünf Mikroliter Proteinase K.Dann fallen die DNA mit 500 Mikroliter Isopropanol und einem Mikroliter Glykogen. Und mischen Sie das Rohr gründlich, indem Sie es fünf oder sechs Mal invertieren.
Nach der Inkubation der Probe für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrieren Sie sie für 15 Minuten bei 21, 000G und 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie DNA-Pellets mit einem Milliliter 70%Ethanol. Zentrifugieren Sie die DNA bei 21 000G für 10 Minuten, entfernen Sie dann das Ethanol und trocknen Sie das Pellet für fünf bis zehn Minuten.
Setzen Sie die DNA in 30 MikroliterTE-Puffer aus und inkubieren Sie sie über Nacht bei 56 Grad Celsius. Führen Sie verschachtelte PCR für den JH4 Intron durch. Normalisierung der Gesamtmenge der genomischen DNA, die in der ersten PCR verwendet wird, auf die am wenigsten konzentrierte Probe.
Nachdem Sie die PCR-Produkte auf einem Gel ausgeführt haben, verbrauchen Sie das Amplicon und reinigen Sie es mit einem Gel-Extraktionskit. Dann das Amplikon in ein Plasmid verwandeln und elektrokompetente Bakterienzellen mit zwei Mikrolitern der Ligationsreaktion transformieren. Elektroporate die Zellen bei 1,65 Kilovolt und retten sie in 600 Mikroliter SOC-Medien für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einem Schüttel-Inkubator bei 225 U/min.
Platte 100 Mikroliter der transformierten Bakterien auf LB Agarplatten mit Ampicillin ergänzt und bebrütet die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Sequenzieren Sie die Plasma-DNA aus den Bakterienkolonien und richten Sie die für jede PCR erhaltenen Sequenzen mit einer Clustal Omega-Software an der JH4 Intron-Referenzsequenz aus. Identifizieren Sie Unterschiede von der Referenzsequenz als Mutationen.
Die Keimmittel-B-Zellen wurden durch Messung der Expression des B220-Rezeptors und der Bindung von Erdnussagglutinin identifiziert. Wildtyp Peyers Patches enthielten durchschnittlich 4 Millionen Zellen pro Maus. Und etwa 8% der Zellen waren B220-positiv PNA hoch, was die Hälfte der bei AID-Knockout-Mäusen beobachteten ist.
Von den 105 einzigartigen Sequenzen, die aus wildlebenden Keimmittel-B-Zellen gewonnen wurden, wurden insgesamt 226 Mutationen gefunden. Die Analyse des Mutationsspektrums zeigte eine Reihe von Übergängen und Transversionen mit einer Rate von viermal 10 bis zu den negativen dritten Mutationen pro Basenpaar. Nur zwei Mutationen wurden in 113 AID-Knockout-Sequenzen identifiziert.
Darüber hinaus enthielt jedes JH4 PCR-Produkt aus wildlebenden Keimzentrum B-Zellen eine bis 25 Mutationen mit mehreren Mutationen, die häufig in einer Sequenz gefunden wurden. Denken Sie beim Versuch dieses Protokolls daran, die Zellen auf Eis zu halten, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten. Nach der Färbung der Zellen, halten Sie die Zellen im Dunkeln, um Photobleichung der Fluorophore zu verhindern.
Um die somatische Hypermutation mit der Reifung der Antikörperaffinität zu korrelieren, empfehlen wir die Verwendung eines Impfprotokolls und die Verwendung von Antigen-spezifischen Antikörpertitern und V-Regionsmutationen.
