Wir möchten David R. Rodriguez, MA für die Grafik-Design und Fotografie in diesem Manuskript danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem GCCRI, dem NIH / NIA (5R21AG033339) und dem Cancer Center Support Grant (P30CA054174) an die UTHSCSA Durchflusszytometrie Core-Anlage und der UTHSCSA Erweiterte Nucleic Acids Core Facility unterstützt.

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hierin beschriebenen in-vivo-Mutagenese-Assay basiert auf der ursprünglich von 18 Dieses Modell verwendet einen λ-Phagenvektor, der eine lac-Reportergens Kohler et al. Erzeugt LacI transgenen Mausmodell. Die beiden cos-Stellen flankieren die Vektor ermöglichen eine relativ einfache Rückgewinnung und anschließende Verpackung in infektiöse Phagenpartikel, verwendet, um E. infizieren coli. Eine blaue Plakette wird durch Phagen-infizierten <...

In den meisten Geweben, differenzierte Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer. Um funktionale Integrität zu erhalten, langlebig, gewebespezifische Stammzellen kontinuierlich Vorläuferzellen, die wiederum führen zu den ausdifferenzierten Zellen, die für die Funktion des jeweiligen Gewebes erforderlich. Stammzellen ihre eigene Fach durch einen Prozess namens Selbsterneuerung auch wieder aufzufüllen. So, für die Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit des Gewebes, sie wohnen in. Deshalb verantwortlich sind Stammzellen, ist es unerlässlich, dass sie mit robusten Mechanismen ausgestattet, um zu erfassen und möglicherweise reparieren beschädigte DNA. Wenn nicht, können sie mehrere genomische (potentiell schädlichen) Störungen, die durch ihre Nachkommen vererbt werden können, zu erwerben. Zu verstehen, wie Stammzellen si-chern ihr Genom während der Lebensdauer eines Organismus ist eine wichtige Frage und kann uns helfen zu verstehen, warum genomische Instabilität wird mit Krebs und einigen anderen altersbedingten Krankheiten (in 1,2 bewertet) verbunden ist. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Controlling genomischen Integrität eines Gewebes auf der Ebene von Stammzellen und frühen Vorläuferzellpopulationen entweder durch Eliminierung defekter Stamm (oder Vorläufer-) Zellen durch Zelltod, Seneszenz oder Differenzierung und / oder Reparatur effizienter erreicht werden geschädigter DNA. Jüngste Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, bestimmte Arten von DNA-Reparatur direkt in diesen seltenen Populationen 3-6 messen. Es wurde gefunden, daß beispielsweise in den blutbildenden Systems, Doppelstrang-DNA-Brüche können durch homologe Rekombination (HR) oder nicht-homologen Ende repariert werden (NHEJ), wobei letztere eine Reparatur des unteren Treue und damit eine erhöhte Gefahr, dass Fehler. Beide werden in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) 4,5 verwendet, jedoch bei Mäusen scheint es überwiegend NHEJ in der Erwägung, dass HSCs frühen Vorläuferzellen nutzen HR 4. Eine ähnliche Beobachtung wurde für die Stammzellen in der Haut 6 hergestellt. Interessant ist, dass in der menschlichen Blutstammzellen HR, NHEJ nicht,scheint der Reparaturmechanismus der Wahl für die Doppelstrangbrüche 3 sein. Ob diese funktionelle Unterschied zwischen den zwei Arten ist real oder nur eine technische oder experimentellen Unterschied, bleibt abzuwarten. Repertoire eine Stammzelle zur Reparatur beschädigter DNA ist wahrscheinlich andere DNA-Reparaturmechanismen, wie Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und Mismatch-Reparatur (MMR) enthalten. BER und NER sind für die Reparatur von einem oder mehreren Basenpaar Läsionen in Einzelstrang-DNA verantwortlich, während MMR-Fixes Basen-Basen-Fehlpaarungen und Einfügen / Löschen Schleifen, diese Arten von DNA-Schäden kann nicht durch NHEJ oder HR repariert werden. Unterstützt wird dieser Begriff gibt mehrere Studien aus dem blutbildenden Systems, die einen Zusammenhang zwischen Veränderungen in einem dieser Wege und Anomalien in der HSC Fach 7-9, sowie einem erhöhten Risiko der Entwicklung von myelodysplastischen Syndroms 10-16, eine Krankheit, die im UrsprungHSC und dass mit zunehmender genomische Instabilität wie die Krankheit fort 17 zugeordnet. Bis jetzt wurden Messungen der BER, NER und MMR direkt in HSCs nicht berichtet. Zusätzlich zur Verdeutlichung der verschiedenen Prozesse, die Gewebeintegrität in einem mechanistischen Pegel zu steuern, ist es unerlässlich, um das Ausmaß der mutierten DNA zu messen, so dass die Folgen von Aberrationen in einem dieser Verfahren kann getestet werden, z. B. in normalen gegenüber genetisch entwickelt, Stammzellen oder in alt gegen jung. Allerdings ist die Entwicklung einer entsprechenden Assay wegen des Mangels an gewebespezifische Stammzellen und das Fehlen von Kulturbedingungen, die &quot;stemness&quot; bewahrt schwierig. Darüber hinaus sollte ein solches Assay abänderbar, um umweltbedingte und genetische Manipulationen. Eine mögliche Lösung für diese Einschränkungen und Anforderungen ist die Verwendung von Maus-Modellen, die spezifisch entworfen sind, um DNA-Mutationen zu detektieren. MulFach-transgene Mausmodelle für den Mutationsnachweis wurden entwickelt. Zum Beispiel LacI transgenen Mäusen 18 führen einen erzielbaren λ-Phagen-Vektor, der das LacI Reportersystem, in dem die LacI Gen kodiert für ein Suppressor der Lac-Operator und dient als Reporter Mutation kodiert. Nach Mutation des lacI-Gens, wird der lac-Operator aktiviert und β-Galaktosidase hergestellt wird. β-Galactosidase spaltet das chromogene Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-e-indolyl-β-D-galactopyranosid), der es blau wird. Die cos-Stellen flankieren den LacI Vektor erlaubt die einfache Wiederherstellung von Lambda-Phagen-Proteine ​​und anschließende Infektion von E. coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die die X-gal-Substrat enthält, kann Plaques erzielt werden. Blaue Plaketten enthalten eine mutmaßliche Mutanten-Lac-I Durchführung Phagen, während klare Plaques Hafen nicht-Mutanten. Die Häufigkeit der blaue Plaques (unter the klar sind) gibt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Darüber hinaus kann die λ-Phagen-Hosting lacI Ziel leicht sequenziert werden unter Verwendung von PCR-Techniken für relativ hohe Durchsatzanalyse. Die Sequenzierung mehrere mutierte Gene LacI wichtige Informationen über das Mutationsspektrum, die wiederum auf mögliche Mängel in bestimmten DNA-Reparaturwegen oder auf bestimmte gentoxische Ereignisse zeigen offenbaren. LacI transgenen System über mehrere Laboratorien 19 standardisiert und die Reagenzien sind im Handel erhältlich. Ein Hauptnachteil des lacI-System ist die begrenzte Möglichkeit, große Deletionen oder Umordnungen nachzuweisen, weshalb andere Verfahren, z. B. Mehrfarben-FISH an Metaphasespreitungen müssen verwendet werden, um diesen Mangel zu ergänzen sein. Innerhalb des λ-Phagenvektor des lacI-Mausmodell, gibt es eine viel kleinere Gen CII, Für die Mutationsanalyse zur Verfügung. Die Größe und die Tatsache, daß Mutanten können ausgewählt werden, macht dies zu einer weniger arbeitsintensiven und kostengünstiger als der Assay 20 lacI-Gen-Analyse. Jedoch wird das lacI-Gen umfassender zur Mutagenese 21 und der Empfindlichkeit des Gen-Mutationen untersucht worden ist und dadurch, dass es eine klare Verständnis der Aminosäurereste, die eine phänotypische Reaktion auf ein chromogenes Substrat 22-25 zu erzeugen. Andere Maus-Modelle für den Mutationsnachweis umfassen die Verwendung der &amp;PHgr; X174 oder das lacZ-Transgen. Die &amp;PHgr; X174 transgenen Mausmodell, mit dem Original-A: T → G: C-Reversion-Mutationstest 26 oder die Vorwärtsmutationstest 27 die Erkennung von einem Spektrum von Basenpaar-Substitutionen, stellt eine weniger kostspielige System als die LacI Modells ermöglicht. Allerdings ist die Mutations Bildschirm in der Vorwärts Assay nicht trivial und die Mutation spectrum des &amp;PHgr; X174 Transgen nicht wie die des LacI gut charakterisiert. In Maus-Modellen trägt LacZ Transgene wird die Mutations LacZ Reporter erholt Verwendung E. coli-Wirtszellen, die empfindlich auf Galaktose und Galaktose-Medium 28 enthalten sind. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass die Wiederherstellung des LacZ Ziel beinhaltet auch Restriktionsendonuklease-Verdau, gefolgt von Ligation und Elektroporation von E. coli-Wirte, wodurch es schwierig wird, das System für eine kleine Anzahl von Zellen anzupassen. Obwohl es nicht eine absolute Voraussetzung für die Arbeit mit Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen (kann man immer mit mehr Mäuse beginnen), wenn eine große Zahl von Zellen erforderlich sind (zB Millionen oder mehr) es wird schnell unpraktisch und kostspielig geworden. Auch die relativ großen Abmessungen von LacZ, während ein empfindlicher Mutations Reporter, ist umständlich und kostspielig für die DNA-Sequenzanalyse und determfung der Mutation Spektren. Ein Hauptvorteil dieses Modells ist jedoch seine Fähigkeit, große Deletionen und Insertionen zu detektieren, sowie chromosomale Rearrangements. Da alle Zellen in lacI, &amp;PHgr; X174 und LacZ transgenen Mausmodellen führen das Reportersystem kann jeder dieser Mausmodelle verwendet werden, um die Mutagenese in jedem Zelltyp von Interesse zu messen, einschließlich der Stamm-und Vorläuferzellen, solange sie zuverlässig entnommen werden können und in ausreichender Zahl. Weil wir umfangreiche Erfahrung mit der LacI Mausmodell und dem LacI Mutationstest, haben wir beschlossen, dieses System weiter für die Mutagenese-Analyse in hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferpopulationen zu verfolgen. Die blutbildenden Gewebe ist gut charakterisiert hinsichtlich der Zelloberfläche Phänotyp der einzelnen Komponenten, einschließlich der langfristigen Bestandsauffüllung Stammzellen, die erkennbar der extrem seltenen Bevölkerung von Lin sind - IL7R <sup&gt; - Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - Zellen 29. . Mohrin et al 4 gezeigt, dass die Bevölkerung von etwas größer LSK/Flk2 - Zellen sind immer noch gute Vertreter für HSK und die erheblich von den primitivsten engagierte myeloischen Vorläufer (CMP) Bevölkerung, wenn es um das Studium der DNA-Reparatur kommt. Wenn darüber hinaus die HSC-angereicherten LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -) - IL7R - Zellen wurden zum Vergleich Lin Sca-1-cKit + + (K LS-Vorläuferzellen), gab es immer noch einen signifikanten Unterschied in NHEJ Fähigkeit 5 zwischen der weniger rein, Stammzell-angereichertem LSK Bevölkerung und die Vorläuferzellen. In unserer Studie verwenden wir HSC angereicherte LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -)-Zellen, weil wir festgestellt, dass mindestens 2 x 10 5 Zellen für konsistente, zuverlässige Ergebnisse in dieser Mutagenese-Assay erforderlich, das die Zellzahl ist äußerst schwierig,zu erhalten, wenn man die LSK/Flk2 sortiert - CD150 + CD48 Bevölkerung oder auch die LSK/Flk2 - Bevölkerung (in Form von Mäusen, Kosten und Praktikabilität). Dieses Protokoll basiert auf der ursprünglich von Kohler et 18 al. Entwickelt beschreibt im Detail, wie die spontane DNA-Mutantenfrequenz in LSK Zellen differenzierten Populationen von myeloischen Zellen sowie nicht getrennten Knochenmark und Milz-Zellen bestimmt und definiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

In den letzten Jahren hat es sich gezeigt, dass genomische Instabilität fest mit vielen Entwicklungsstörungen, Krebs und Alterung. Da die Stammzellen für die Gewährleistung Gewebshomöostase und Reparatur des gesamten Lebens verantwortlich sind, ist es vernünftig zu vermuten, dass die Stammzellpopulation ist für die Erhaltung der genomischen Integrität der Gewebe. Deshalb hat großes Interesse an der Beurteilung der Auswirkungen von endogenen und Umweltfaktoren auf die genomischen Integrität in Stammzellen und deren Nachkommen, mit dem Ziel, die Ätiologie der Stammzellen basierte Krankheiten zu verstehen entstanden. LacI transgenen Mäuse tragen eine erzielbare λ-Phagenvektor lacI-Reportersystems, wobei das lacI-Gen dient als Reporter-Mutation kodiert. Das Ergebnis einer mutierten lacI-Gen ist die Herstellung von β-Galactosidase spaltet ein chromogenes Substrat, Drehen blau. Die LacI Reportersystem ist durch in alle Zellen, einschließlich Stammzellen / Vorläuferzellen und können problemlos wiederhergestellt und verwendet werden, um anschließend zu infizieren E. werden coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die das richtige Substrat enthält, können Plaques erzielt werden; blaue Plaques zeigen eine Mutante LacI Gen, während klare Plaques Hafen-Wildtyp. Die Häufigkeit von blau (unter klar) Plaques zeigt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Sequenzierung der mutierten lacI-Gen wird die Position der Mutationen in dem Gen, und die Art der Mutation anzuzeigen. LacI transgenen Mausmodell wird als ein in vivo-Mutagenese-Assay etabliert. Außerdem werden die Mäuse und die Reagenzien für den Assay sind im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir detailliert, wie dieses Modell geeignet ist, die Frequenz von spontan auftretenden DNA-Mutanten in Stammzell-angereichertem Lin messen - IL7R - Sca-1 + + + cKit (LSK) Zellen und anderen Subpopulationen des hämatopoetischen Systems.

<html> Die in vivo-Mutagenese-Assay misst eine seltene Ereignis (Mutante PFUs) unter vielen Ereignissen (alle PFUs). Durch Durchführen des Assays mit einer kleinen Anzahl von Zellen ist es möglich, dass das Ergebnis erheblich falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse beeinflusst. Um dieses Problem zu adressieren wir führten eine serielle Verdünnungsexperiment mit unfraktioniertem Knochenmarkzellen, aus drei verschiedenen Tieren geerntet. Wir maßen die Mutationsrate in dem Knochenmark der Tiere mit 1,4 ...

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Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells | Immunology and Infection | Video

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

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12.9K Aufrufe.  UT Health Science Center at San Antonio.  Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen. 

Serie: Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...