Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants RO1DC002756 und der Purdue Research Foundation finanziert. Wir bedanken uns bei Doris Wu und Chang Wiese für Beratung mit Experimenten und Rodney McPhail für die Hilfe bei Zahlen.

Rezepte Küken Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Water (Tissue culture grade) </td></tr></tbody></table> Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4. Bringen Endvolumen von 1000 ml mit Wasser. 10X PBS <table border="1"><tbody><tr><td> 40 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,2 g </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 ml </td><td> DEPC-Wasser </td></tr></tbody></table> Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4. Bringen endgültigenVolumen auf 500 ml mit Wasser. Arbeitskonzentration (1X) wird durch Verdünnen von 1 Teil 10X Lager mit 9 Teilen von Gewebe-Kultur-Wasser, wie es mit einem Millipore UV-Bestrahlung, um Wasser mit 18 MOhm-cm Leitfähigkeit erzeugen gewonnen wird. SAG Explantation halten Medium <ul><li> DMEM/F12 mit L-Glutamin, 10 mM Hepes </li><li> 10% Insulin, Übertragen, Selenium (ITS +1) </li><li> 1% Pen-Strep </li></ul> Explantation Kulturmedium <ul><li> SAG Explantation halten Medium </li><li> 10 ng / ml Neurotrophin-3 (NT-3) </li><li> 10 ng / ml ciliary neurotrophen Faktors (CNTF) </li></ul> Rückenmark Dissektion und Halten Medium <ul><li> L-15 </li><li> 10% fötalem Kälberserum </li><li> 1% Pen-Strep </li></ul> Inkubieren Eier bei 37-38 ° C. Sterilisieren Sezieren Werkzeuge und Sylgard Sezieren Gericht in 70% Ethanol. Dissecting Geschirr und Werkzeuge können auch UV sterilisiert Nacht. <ol><li> Legen Sie Perlen in einem Mikroröhrchen mit 1 ml steriler PBS, mischen, und warten Sie die Perlen auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. </li><li> Waschen Sie die Kugeln mehrmals durch das Entfernen der Überstand nach den Perlen niedergelassen haben und resuspendieren in PBS. </li><li> Inkubieren Sie die Perlen in gereinigtes Protein (verdünnt in PBS) oder PBS allein (Control) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die Perlen in PBS und an einem 24-Well-Platte mit 1 ml PBS, bis in Kollagen platziert. </li></ol> 2. Statoacoustic Ganglion Dissektion <ol><li> Auf E4 entfernen der Embryo aus dem Ei und legen Sie sie in einer Schale mit Küken Ringer-Lösung zu embryonalen Membranen zu entfernen. </li><li> Setzen Sie den Embryo in einem Sylgard © gesäumt Petrischale mit kaltem HBSS und die Position des Embryos auf die Seite mit dem otic Vesikel nach oben gefüllt. Pin des Embryos in die Schale mit Sezieren Pins. </li><li> Mit zwei Sezieren Stifte, einen horizontalen Schnitt durch die Haut sofort ventral derKanal Beutel, ungefähr dort, wo es erfüllt die Ductus cochlearis. Machen Sie einen vertikalen Schnitt vorderen und hinteren der SAG. Verwenden einer Pinzette oder einem Seziertisch pin zu heben und entfernen Sie die Klappe der Haut durch die drei Schnitte begrenzt. Hinweis: Die SAG ist in der anteroventral Rand des otocyst, etwa auf halbem Weg zwischen der dorsalen Tasche, die gut sichtbar mit Hellfeld Basis Beleuchtung und dem ventralen Ductus cochlearis, die ventromedial Projekte und wird von der Schlundbögen verdeckt. Der Ductus cochlearis verlängert so seine dorsoventrale Dimension wird schrittweise auf E4 Anstieg zwischen Hamburger-Hamilton Stufen 23-25 ​​September. </li><li> Ziehen Sie die otocyst nach dorsal um es aus der SAG zu trennen. Displace umgebende Gewebe der SAG mit Dissektion Pins und entfernen Sie vorsichtig die SAG aus dem Embryo mit Nr. 55 Pinzetten. Entfernen Sie große Stücke mesenchymale Gewebe und hervorstehende Nervenbündel aus der SAG. </li><li> Mit einem breit-Mund-Pipettenspitze, übertragen Sie die Explantation einer24-Well-Platte mit 0,5 ml SAG Explantation halten Medium. Keep Explantate auf Eis oder bei Raumtemperatur für bis zu 4 Stunden. </li></ol> 3. Rückenmark Dissektion <ol><li> Entfernen Sie die E6 Embryo aus dem Ei und legen Sie sie in eine Schale mit Küken Ringerlösung. Entfernen Sie den Kopf und embryonalen Membranen. </li><li> Setzen Sie den Körper in einer Sylgard © Sezieren Schüssel mit kaltem Rückenmark Dissektion Medium. Position und Pin des Embryos &quot;ventral down&quot; und caudal mit Blick auf den Experimentator. Legen Sie sezieren Stifte durch die einzelnen Gliedmaßen und durch das vordere Ende. </li><li> Mit einer Pinzette und / oder sezieren Stifte, entfernen Sie vorsichtig Haut und Gewebe, bewegt sich in eine ventrale Richtung, bis der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks zu sehen ist. </li><li> Cut der dorsalen Mittellinie des Rückenmarks mit einer Zerlegung pin, in einer posterior nach anterior Richtung, entlang der gesamten Länge des Rückenmarks. Dadurch entsteht ein &quot;offenes Buch&quot;, wie die linke und rechte Seite des Rückenmarks zu trennen. </li><li&gt; Entfernen umliegenden Gewebes, seitlich, um das Rückenmark zu isolieren und setzen die Spinalganglien (DRG). Entfernen Sie die DRG und der Hirnhäute durch Reiben mit einem Sezieren Pin oder einer Pinzette zwischen dem Rückenmark und DRG. </li><li> Entfernen Sie das Rückenmark aus dem Körper, indem Sie die Schwanzflosse am weitesten Ende des Rückenmarks mit einer Pinzette und anheben und vom Experimentator. Beseitigung der verbleibenden DRG und der Hirnhäute. </li><li> Halten Sie das eine Ende des Rückenmark mit einer Pinzette (oder stecken Sie es in die Schale) und die Nutzung Vannas Schere entlang der ventralen Mittellinie geschnitten, um das Rückenmark zu halbieren. </li><li> Halten Sie das eine Ende des Explantat mit einer Pinzette, um das Gewebe zu immobilisieren und benutzen Vannas Schere, kleine Explantate (100-500 um in der Länge) entlang der Länge des Gewebes geschnitten. Die Bodenplatte kann als ein klares Verdickung des Gewebes an einer Explantation Kante erkannt werden. </li><li> Verwenden Sie einen Weithals-Pipettenspitze zu Explantate auf eine 24-Well-Platte übertragen mit 0,5 ml kalte Dissektion Medium. Keep Explantate auf Eis zu Gewebeviabilität, f zu erhaltenoder bis zu 4 Stunden. </li></ol> 4. Explantation Kultur mit gereinigten Proteinen zu Neuriten Reaktionstest <ol><li> Bereiten Sie eine 1,5 mg / ml Kollagen-Lösung in einem 15 ml konischen Rohr, auf Eis, nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Überprüfen Sie die Kollagen-Lösung hat einen pH-Wert von 7-7,4 mit pH-Indikatorpapier. Den pH-Wert durch Zugabe von NaOH in 1 ul. </li><li> Transfer-Explantate auf eine 24-Well-Platte mit einem breiten Mund Pipettenspitze und saugen überschüssige Flüssigkeit. Mehrere Explantate können in einem gut kultiviert werden, sollte aber gelegt mindestens 500 pm voneinander entfernt sein von einander. </li><li> 0,5 ml Kollagen, die gut mit dem Explantat. Position der Explantation an der unteren Oberfläche des Brunnens. Achten Sie darauf, jede Kultur völlig einstellen, bevor Sie mit dem nächsten gut, weil das Kollagen beginnt bei Raumtemperatur polymerisieren. </li><li> Legen Sie die Kultur Platte auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 30-45 min, um das Kollagen zu polymerisieren. Wenn die Kollagen hat polymerisiertemrized es wird ein Gel ähnelt. </li><li> 0,5 ml warmen Explantation Kulturmedium entweder mit gereinigten Proteinen (verdünnt in PBS) oder PBS (Control) ergänzt und bei 37 ° C, 5% CO 2. Auswirkungen auf Neuritenwachstum sichtbar sein soll von 24 Stunden. HINWEIS: Wir haben das gleiche Protokoll zur Kultur SAG Explantate verwendet bis zu 42 Stunden. </li></ol> 5. Explantation Co-Kultur mit Protein-beschichteten Beads zu direktionale Neuritenwachstum Test <ol><li> Beginnen Sie mit Explantation Kultur Schritte 4,1-4,4. </li><li> Mit einer Pipette, Transfer 1-5 Kügelchen aus PBS, die gut mit den Kollagen-Lösung und Explantation. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um Perlen 50-500 um vom Rand der Explantation Position. </li><li> Legen Sie die Platte auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 30-45 min, um das Kollagen zu polymerisieren. Die Gewebe-oder Wulst kann sich verschoben, wie das Kollagen polymerisiert. Überprüfen Sie die Kulturen und neu positionieren das Gewebe und Perlen in den ersten 5 min. </li><li> Add 0,5 ml SAG Medien in jede Vertiefung und inkubieren für 24 Stunden. </li></ol> 6. Visualisierung von Neuriten durch Immunhistochemie <ol><li> Spülen Kulturen in PBS und fixieren Sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 4% Paraformaldehyd in PBS. </li><li> Lassen Sie die Gele aus den Wänden der Vertiefungen durch Tracing um den Rand der Gele mit den abgerundeten Ende einer Teflon-micro Spachtel. Führen Sie die immunostain mit den Gelen in die Vertiefungen geben. Spülen Sie mehrmals in PBS. </li><li> Inkubieren in 0,5 ml Blocking-Lösung (10% Kälberserum, 0,1% Triton X-100, 0,1% Natriumazid in PBS) über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Inkubieren in 0,5 ml primären Antikörper (Anti-β-Tubulin-Antikörper 1:500 verdünnt in Blockierungslösung) über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Spülen Sie mehrmals in PBS. Inkubieren in 0,5 ml sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG 2b Antikörper verdünnt 1:500) über Nacht bei 4 ° C. Von diesem Schritt nach vorn, halten Platten in dunklen oder wickeln Sie sie in Folie, durch die Empfindlichkeit des LichtsSekundärantikörper. </li><li> Spülen Sie mehrmals in PBS und lagern bei 4 ° C in PBS bis zu einer Woche. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse des Neuriten-fördernde Wirkung von gereinigtem NT-3 und NT-3-beschichteten Kügelchen auf E4 chick SAG Explantate. SAG Neuron Zellkörper und Neuriten wurden mit β-Tubulin immungefärbt und bebildert mit einem 10-fach Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop. Nach 24 Stunden in vitro, angezeigt SAG Explantate größere Neuritenwachstum in Gegenwart von 100 ng / ml gereinigtes humanes NT-3 auf dem Zellkulturmedium (1B) aufgenommen, im Vergleich zur Kontrollgruppe (1A). SAG Neuronen wurden mit Perlen eingeweicht in 100 ng / ml NT-3 zu zeigen, dass eine Punktquelle von NT-3 kann vor Ort zu fördern Neuritenwachstum co-kultiviert. Explantate angezeigt länger und dichter Neuritenwachstum auf der Seite desExplantation mit Blick auf den Wulst auf der gegenüberliegenden Seite (1D) im Vergleich und im Vergleich zu Kulturen mit Perlen in PBS (1C) getränkt Kontrolle. Maßstab = 200 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse des Neuriten-fördernde Wirkung von gereinigtem Wnt5a und Wnt5a-beschichteten Kügelchen auf E6 chick Rückenmark. Rückenmark Explantate wurden mit β-Tubulin immungefärbt und bebildert mit einem konfokalen Mikroskop. Nach 24 Stunden Wachstum in Gegenwart von gereinigtem Maus Wnt5a (400ng/ml), Neuritenwachstum von chick Rückenmark Explantate wurde erhöht (2B), die Kontrollen ohne Wnt5a (2A) kultiviert verglichen. Beads in 500 ng / ml Wnt5a eingeweicht, platziert 300-500 um von der Kante des Rückenmarks Explantate, ebenfalls gefördert Neuritenwachstum (2D) im Vergleich zu Kulturen (2C) zu steuern. Ähnliche Co-Kultur-Ergebnisse waren zuvor mit Wnt5a-exprimierenden Zellen 8 veröffentlicht. Maßstabsbalken = 200um.

<ol>
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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir stellen eine Methode zu sezieren und Kultur E4 und E6 SAG Rückenmark Explantate von chick, unter serumfreien Bedingungen. Dieses Verfahren wird derzeit in unserem Labor verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen sezernierten Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum zu studieren. Neue Aspekte dieses Protokolls sind die Verwendung eines serumfreien System zur Kultivierung von Explantaten und die Verwendung von Perlen in Wachstumsfaktoren getränkt, um Auswirkungen auf die SAG Neuritenwachs...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Ausrüstung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td></td><td></td><td> Wir verwenden ein Stereomikroskop Leica M80 mit Hellfeld Basis Beleuchtung </td></tr><tr><td> Slide wärmer </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Collagen Polymerisation </td></tr><tr><td> Hühnerei-Inkubator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 befeuchtet Zellkulturbrutschrank </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection Materials </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;copy; beschichtete Petrischale </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24-Well-Zellkulturplatte </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont Pinzetten </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont Pinzetten </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Edelstahl Sezieren Pins </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Embryo Pinning, feinen Sezierung </td></tr><tr><td> Moria Schaumlöffel </td><td> Feine Science Tools </td><td> 10370-17 </td><td> Embryo Ernte / Transfer </td></tr><tr><td> 200 ul breiten Mund Pipettenspitzen </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Explantation Transfer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 und E6 Hühnereiern </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Küken Ringer-Lösung </td><td></td><td></td><td> Embryo Ernte </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG Dissektion </td></tr><tr><td> L15 Medium </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Rückenmark Dissektion Medium </td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Rückenmark Dissektion Medium </td></tr><tr><td> Vannas Scissors </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501778 </td><td> Rückenmark Dissektion </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagen Vorbereitung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail Kollagen Typ I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Explantation Kultur </td></tr><tr><td> 10X PBS (steril) </td><td></td><td></td><td> Um neutralize Kollagen </td></tr><tr><td> 1N NaOH (steril) </td><td></td><td></td><td> Zur Neutralisierung Kollagen </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser (steril) </td><td></td><td></td><td> Zur Neutralisierung Kollagen </td></tr><tr><td> pH-Indikator Papiere (6,0-8,1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Um zu überprüfen, Kollagen pH </td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 ul breiten Mund Pipettenspitzen </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Um pipet Kollagen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explantation Kultur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12-Medium </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explantation Kulturmedium </td></tr><tr><td> Ihre +1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Medium ergänzen </td&gt; </tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Medium ergänzen </td></tr><tr><td> CNTF (Ratte) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Medium ergänzen </td></tr><tr><td> NT-3 (human) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Medium ergänzen </td></tr><tr><td> Gereinigtes Maus Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel Blue Gelperlen </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immunhistochemie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fixierung </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Spülungen </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Blocking-Lösung </td></tr><tr><td> NatriumAzid </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Blocking-Lösung </td></tr><tr><td> Kälberserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Blocking-Lösung </td></tr><tr><td> Monoklonalen Maus-IgG2b anti-β Tubulin 1 + II Antikörper </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Labels Zellkörper und Neuriten </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG2 b-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Erkennt β Tubulin Antikörper </td></tr><tr><td> Teflon Mikrospatel </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Veröffentlichung Kollagengelen von gut </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

Die Sinnesorgane des Huhns Innenohr werden durch die peripheren Prozesse statoacoustic Ganglion (SAG) Neuronen innerviert. Sinnesorgan Innervation beruht auf einer Kombination von Axon Führung Signale 1 und Überlebensfaktoren 2 entlang der Flugbahn der wachsenden Axone und / oder in ihren Sinnesorgan Ziele entfernt. Zum Beispiel erzeugt funktionelle Störungen mit einem klassischen Axon Führung Signalweg, Semaphorin-Neuropilin, Fehlleitung von otic Axone 3. Auch mehrere Wachstumsfaktoren in den sensorischen Ziele des Innenohrs, darunter Neurotrophin-3 (NT-3) und Brain Derived neurotrophen Faktor (BDNF), ausgedrückt in transgene Tiere manipuliert worden, was wiederum zu der SAG Axone 4 Fehlleitung. Dieselben Moleküle fördern sowohl das Überleben und die Neuritenwachstum chick SAG Neuronen in vitro 5,6. Hier beschreiben wir und zeigen die In-vitro-Methode, die wir derzeit usingen, um die Reaktionsfähigkeit von chick SAG Neuriten, lösliche Proteine, einschließlich bekannter Morphogene wie die Wnts, sowie Wachstumsfaktoren, die wichtig für die Förderung der SAG Neuritenwachstum und Neuron Überleben zu testen. Mit diesem Modellsystem, hoffen wir Rückschlüsse auf die Effekte, die sezernierte Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum ausüben kann zeichnen. SAG Explantate an embryonalen Tag 4 (E4) präpariert und kultiviert im dreidimensionalen Kollagen-Gelen unter serumfreien Bedingungen für 24 Stunden. Erstens ist Neuriten Reaktionsfähigkeit durch Kultivierung Explantate mit Protein-ergänzt Medium getestet. Dann, um zu fragen, ob Punktquellen von sekretierten Liganden können direktionale Effekte auf Neuritenwachstum haben, sind Explantate mit Protein-beschichteten Beads co-kultiviert und untersucht für die Fähigkeit der Raupe vor Ort zu fördern oder hemmen Auswuchs. Wir berücksichtigen auch eine Demonstration der Dissektion (modifizierten Protokoll 7) und die Kultur der E6 Rückenmark Explantate. Wirroutinemäßig Rückenmark Explantate auf Bioaktivität der Proteine ​​und Protein-getränkte Perlen zu bestätigen, und um zu überprüfen Spezies Kreuzreaktivität mit chick Gewebe, unter den gleichen Kulturbedingungen wie SAG Explantate. Diese in-vitro-Assays sind für das schnelle Screening nach Molekülen, die trophische (Überlebensrate) oder tropic (Richt-) Wirkungen auf SAG Neuronen ausüben, insbesondere vor der Durchführung von Studien in vivo bequem. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Prüfung von einzelnen Molekülen unter serumfreien Bedingungen mit hoher Neuron Überleben 8.

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

dissection-culture-chick-statoacoustic-ganglion-spinal-cord-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Aufrufe.  Purdue University. Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.

Serie: Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...