Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant RO1DC002756 y la Fundación de Investigación de Purdue. Damos las gracias a Doris Wu y Chang Wiese para el consejo con los experimentos y McPhail Rodney para ayudar con las cifras.

Recetas Timbres de pollo <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Agua (grado de cultivo de tejidos) </td></tr></tbody></table> Nota: Ajustar el pH a 7.4. Alcanzar un volumen final de 1000 ml con agua. PBS 10 veces <table border="1"><tbody><tr><td> 40 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,2 g </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 ml </td><td> DEPC agua </td></tr></tbody></table> Nota: Ajustar el pH a 7.4. Traiga finalesvolumen a 500 ml con agua. Concentración de trabajo (1X) se hace mediante la dilución de un stock de piezas 10 veces en 9 partes de agua de grado de cultivo de tejidos, como la obtenida con un sistema de irradiación UV Millipore para generar agua con 18 mW cm de conductividad. SAG medio de la celebración de explante <ul><li> DMEM/F12 con L-glutamina, Hepes 10 mM </li><li> 10% de la insulina, la transferencia, el selenio (ITS 1) </li><li> 1% de la pluma de estreptococos </li></ul> Explante medio de cultivo <ul><li> SAG medio de la celebración de explante </li><li> 10 ng / ml neurotrofina 3 (NT-3) </li><li> 10 ng / ml de factor neurotrófico ciliar (CNTF) </li></ul> Disección de la médula espinal y el medio de mantenimiento <ul><li> L-15 </li><li> 10% de suero fetal bovino </li><li> 1% de la pluma de estreptococos </li></ul> Huevos se incuban a 37-38 ° C. Esterilizar las herramientas de disección y un plato Sylgard disección en el 70% de etanol. La disección de los platos y las herramientas también pueden ser esterilizados UV durante la noche. <ol><li> Cuentas a cabo en un microtubo con 1 ml de PBS estéril, mezclar y esperar a que las cuentas se deposite en el fondo del tubo. </li><li> Lave las cuentas varias veces, eliminando el sobrenadante después de las cuentas se han establecido y se resuspenden en PBS. </li><li> Incubar las cuentas de la proteína purificada (diluida en PBS) o PBS solo (control) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Aclarar las cuentas en PBS y guardar en una placa de 24 pocillos con 1 ml de PBS hasta que se coloque en el colágeno. </li></ol> 2. La disección ganglionar Statoacoustic <ol><li> En E4 extraer el embrión del huevo y colocarlo en un plato de pollo con una solución de Ringer para eliminar las membranas embrionarias. </li><li> Lugar al embrión en un plato de petri Sylgard © alineados llenos de HBSS frío y la posición del embrión en su lado de la vesícula ótica hacia arriba. Pin del embrión al plato con alfileres de disección. </li><li> El uso de dos pines de disección, hacer un corte horizontal a través de la piel inmediatamente ventral a labolsas de canal, aproximadamente donde se encuentra el conducto coclear. Haga un corte vertical anterior y posterior a la SAG. El uso de fórceps o un alfiler de disección para levantar y remover la capa de piel bordeado por los tres cortes. Nota: El SAG se localiza en el borde anteroventral del otocyst, a medio camino entre la bolsa dorsal que es fácilmente visible con iluminación de campo claro de base, y el conducto coclear ventral que se proyecta ventromedially y es oscurecida por los arcos faríngeos. El conducto coclear se alarga por lo que su dimensión dorsoventral irá aumentando progresivamente en la E4 entre Hamilton Hamburguesa etapas de 23 hasta 25 sept. </li><li> Tire de la otocyst en dirección posterior para separarla de la SAG. Desplazar el tejido que rodea el SAG con alfileres de disección y retire con cuidado la SAG desde el embrión utilizando # 55 pinzas. Eliminar grandes porciones de tejido mesenquimal y manojos de nervios que sobresalen de la SAG. </li><li> Con una punta de pipeta de boca ancha, la transferencia de los explantes a un24 pocillos con 0,5 ml de la celebración de explante SAG medio. Mantener los explantes en hielo oa temperatura ambiente por hasta 4 horas. </li></ol> 3. Disección de la médula espinal <ol><li> Extraer el embrión E6 del huevo y colocarlo en un plato de pollo que contiene la solución de Ringer. Quitar la cabeza y las membranas embrionarias. </li><li> Colocar el cuerpo en un Sylgard © plato que contiene la disección fría disección de la médula espinal medio. Posición y el pin del embrión &quot;abajo ventral&quot; y caudal hacia el experimentador. Coloque pasadores de disección a través de cada miembro y por el extremo anterior. </li><li> El uso de pinzas y / o la disección de los pernos, retire con cuidado la piel y el tejido, se mueve en dirección ventral, hasta que la superficie dorsal de la médula espinal es visible. </li><li> Cortar la línea media dorsal de la médula espinal con una aguja de disección, en una posterior a la dirección anterior, a lo largo de toda la longitud de la médula espinal. Esto crea un &quot;libro abierto&quot;, como los lados izquierdo y derecho de la médula espinal por separado. </li><li&gt; Eliminar los tejidos circundantes, lateralmente, para aislar a la médula espinal y exponer los ganglios de la raíz dorsal (GRD). Retire el DRG y las meninges frotando un pin o una pinza de disección entre la médula espinal y DRG. </li><li> Eliminar la médula espinal del cuerpo por la celebración de la final-la mayoría de caudal de la médula espinal con unas pinzas y el levantamiento de arriba y lejos del experimentador. Quitar DRG restantes y las meninges. </li><li> Sostenga un extremo de la médula espinal con unas pinzas el (o pin a la placa) y el uso de tijeras para cortar a lo largo de Vannas la línea media ventral, a dividir en dos la columna vertebral. </li><li> Sostenga un extremo del explante con una pinza para inmovilizar el tejido y el uso de tijeras para cortar Vannas explantes pequeños (100-500 um de longitud) a lo largo de la longitud del tejido. La placa de piso puede ser reconocido como un engrosamiento del tejido claro lo largo del borde explante uno. </li><li> Utilice una punta de pipeta de boca ancha para la transferencia de los explantes a un plato y 24 con 0,5 ml de medio de la disección en frío. Mantener los explantes en el hielo para mantener la viabilidad del tejido, fo hasta 4 horas. </li></ol> 4. Explante cultura con proteínas purificadas para poner a prueba la capacidad de respuesta de neuritas <ol><li> Prepare un 1,5 mg / ml solución de colágeno en un tubo cónico de 15 ml, en el hielo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Verificar la solución de colágeno tiene un pH de 7-7,4 papel con indicador de pH. Ajustar el pH mediante la adición de NaOH en volúmenes de 1 l. </li><li> La transferencia de los explantes a una placa de 24 pocillos con una pipeta de punta de la boca ancha y el exceso de líquido aspirado. Explantes múltiples pueden ser cultivadas en un pozo, pero se debe colocar por lo menos 500 m uno del otro. </li><li> Añadir 0,5 ml de colágeno en el pozo que contiene el explante. La posición del explante en la superficie del fondo del pozo. Asegúrese de ajustar cada cultura antes de proceder con la siguiente y debido a que el colágeno se empiezan a polimerizar a temperatura ambiente. </li><li> Colocar la placa de cultivo de A ° C más caliente de diapositivas durante 30-45 min para polimerizar el colágeno 37. Cuando el colágeno se ha polymerized que se asemejan a un gel. </li><li> Añadir 0,5 ml de medio de cultivo de explantes cálida complementada con proteínas purificadas (diluido en PBS) o PBS (control) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Efectos sobre el crecimiento de las neuritas debe ser visible a las 24 horas. NOTA: Hemos utilizado el mismo protocolo de explantes SAG cultura hasta 42 horas. </li></ol> 5. Explante co-cultivo con cubierta de proteínas cuentas para poner a prueba neurite direccional <ol><li> Comience con pasos explante cultura 4.1-4.4. </li><li> Con una pipeta, transferir 5.1 cuentas de PBS a la fuente que contiene la solución de colágeno y explante. </li><li> Use unas pinzas para colocar cuentas de 50 a 500 micras desde el borde del explante. </li><li> Coloque la placa en A ° C más caliente de diapositivas por 30-45 min para polimerizar el colágeno 37. El tejido o cordón puede llegar a ser desplazados como el colágeno se polimeriza. Compruebe las culturas y volver a colocar el tejido y los granos durante los primeros 5 min. </li><li> Añadir 0,5 ml SAG medios de comunicación a cada pocillo e incubar durante 24 horas. </li></ol> 6. Visualización de crecimiento de las neuritas mediante técnicas de inmunohistoquímica <ol><li> Enjuague las culturas en PBS y fijar, por 1 hora a temperatura ambiente en el 4% de paraformaldehído en PBS. </li><li> Liberación de los geles de las paredes de los pozos mediante el trazado de los bordes de los geles con el extremo redondeado de una espátula de teflón micro. Realizar la inmunotinción con los geles en los pozos. Enjuagar varias veces con PBS. </li><li> Incubar en 0,5 ml de solución de bloqueo (10% de suero de ternera, 0,1% Triton X-100, azida de sodio al 0,1% en PBS) durante la noche a 4 ° C. </li><li> Incubar en 0,5 ml de anticuerpo primario (anti-β-tubulina anticuerpo diluido 1:500 en solución de bloqueo) la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuagar varias veces con PBS. Incubar en el anticuerpo secundario de 0,5 ml (Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón de anticuerpos IgG 2b diluido 1:500) durante la noche a 4 ° C. A partir de este paso adelante, mantener las placas en la oscuridad o envolver en papel de aluminio, debido a la sensibilidad a la luz desecundaria de anticuerpos. </li><li> Enjuagar varias veces con PBS y se almacena a 4 º C en PBS durante hasta una semana. </li></ol> 7. Resultados representante <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> Figura 1. Los resultados representativos de los efectos de promoción de neuritas purificada NT-3 y NT-3-revestida de piedras en los explantes E4 SAG pollo. SAG cuerpos neuronales de células y axones se immunostained con β-tubulina y la imagen con un objetivo de 10x en un microscopio confocal. Después de 24 horas in vitro, los explantes SAG mostrado un mayor crecimiento de las neuritas en la presencia de 100 ng / ml humana purificada NT-3 añade al medio de cultivo celular (1B), en comparación con los controles (1A). Neuronas SAG fueron co-cultivadas con granos empapados IN100 ng / ml de NT-3 para demostrar que una fuente puntual de NT-3 a nivel local puede promover crecimiento de las neuritas. Los explantes se muestra más y más densa extensión de neuritas en el lado de laexplante frente al cordón en comparación con el lado opuesto (1D) y en comparación con el control de las culturas con los granos remojados en PBS (1C). Barra de escala = 200 micras. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos de los efectos de promoción de neuritas purificada Wnt5a y cuentas Wnt5a recubierto en la médula espinal de pollo E6. Explantes de la médula espinal se immunostained con β-tubulina y la imagen con un microscopio confocal. Después de 24 horas de crecimiento en presencia de agua purificada ratón Wnt5a (400ng/ml), crecimiento de las neuritas a partir de explantes de pollo de la médula espinal se incrementó (2B), en comparación con los controles cultivados sin Wnt5a (2A). Bolas empapadas en 500 ng / ml Wnt5a, puesto 300-500 m desde el borde de los explantes de la médula espinal, también se promueve crecimiento de las neuritas (2D) en comparación con el control de las culturas (2C). Similares de co-cultivo resultados fueron publicados previamente con Wnt5a células que expresan 8. Barra de escala = 200micras.

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	<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inner+ear+afferent+connections:+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia.">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. 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No hay conflictos de interés declarado.

Se presenta un método para analizar la cultura y la SAG E4 y E6 explantes de la médula espinal, de pollo, bajo condiciones libres de suero. Este procedimiento se utiliza actualmente en nuestro laboratorio para estudiar los efectos de diferentes ligandos secretados en la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas. Aspectos novedosos de este protocolo incluye el uso de un sistema libre de suero para los explantes de cultivo y el uso de los granos remojados en factores de crecimiento para estudiar lo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Equipo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td></td><td></td><td> Nosotros usamos un microscopio estereoscópico Leica M80 con campo claro base de la iluminación </td></tr><tr><td> Deslice más cálido </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Polimerización del colágeno </td></tr><tr><td> Incubadora de huevo de gallina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 humidificado incubadora de cultivo celular </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Materiales disección </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard ycopia, revestido placa de Petri </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> De 24 y placa de cultivo celular </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Pasadores de acero inoxidable de disección </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26002-10 </td><td> Embrión de la fijación, la disección fina </td></tr><tr><td> Moria cuchara perforada </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10370-17 </td><td> Embrión de la cosecha / transferencia </td></tr><tr><td> 200 l de ancho consejos boca pipeta </td><td> Punto Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Explante de transferencia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 y E6 huevos de pollo </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Solución de Ringer de pollo </td><td></td><td></td><td> Embrión de la cosecha </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG disección </td></tr><tr><td> L15 </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Disección de la médula espinal medio </td></tr><tr><td> Suero fetal bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11150 </td><td> Disección de la médula espinal medio </td></tr><tr><td> Vannas Tijeras </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 501778 </td><td> Disección de la médula espinal </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colágeno preparación </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> De cola de rata colágeno de tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Explante cultura </td></tr><tr><td> 10X PBS (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralize colágeno </td></tr><tr><td> NaOH 1N (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralizar el colágeno </td></tr><tr><td> Agua destilada (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralizar el colágeno </td></tr><tr><td> papeles indicadores de pH (6.0-8.1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Para comprobar el pH de colágeno </td></tr><tr><td> 15 ml tubos cónicos </td><td> Punto Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 l de ancho consejos boca pipeta </td><td> Punto Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Al colágeno pipeta </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explante cultura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Medio DMEM/F12 </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explante medio de cultivo </td></tr><tr><td> SU 1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Suplemento de medio </td&gt; </tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Suplemento de medio </td></tr><tr><td> CNTF (rata) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Suplemento de medio </td></tr><tr><td> NT-3 (humanos) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Suplemento de medio </td></tr><tr><td> Purificada ratón Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel azul perlas de gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inmunohistoquímica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fijación </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Enjuagues </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> Sodioazida </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> De suero de ternera </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> Monoclonal de ratón anti-β IgG2b tubulina 1 + II de anticuerpos </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Etiquetas de los cuerpos celulares y axones </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón de anticuerpos IgG2 b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Detecta anticuerpos β tubulina </td></tr><tr><td> Espátula de teflón micro </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Liberación de geles de colágeno, así </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

Los órganos sensoriales del oído interno de pollo son inervados por los procesos periféricos del ganglio statoacoustic (SAG), las neuronas. Inervación sensorial del órgano depende de una combinación de señales de orientación axón 1 y 2 factores de supervivencia situadas a lo largo de la trayectoria de los axones en crecimiento y / o dentro de sus objetivos órgano sensorial. Por ejemplo, la interferencia funcional con una vía axón orientación clásica de señalización, semaforina-neuropilina, genera misrouting de los axones ótica 3. Además, varios factores de crecimiento expresados ​​en los objetivos sensoriales del oído interno, incluyendo la neurotrofina-3 (NT-3) y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), han sido manipulados en animales transgénicos, lo cual también misrouting de 4 axones SAG. Estas mismas moléculas promueven la supervivencia y crecimiento de las neuritas de neuronas SAG pollo in vitro 5,6. En este sentido, describir y demostrar el método in vitro que actualmente ucantar para poner a prueba la capacidad de respuesta de neuritas SAG de pollo a las proteínas solubles, como morfógenos conocido como el Wnts, así como los factores de crecimiento que son importantes para promover la extensión de neuritas SAG y la supervivencia de las neuronas. El uso de este sistema de modelo, que esperamos para sacar conclusiones sobre los efectos que los ligandos secretados pueden ejercer sobre la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas. Explantes SAG se diseccionan en el día embrionario 4 (E4) y cultivadas en geles de colágeno tridimensional bajo condiciones libres de suero durante 24 horas. En primer lugar, la capacidad de respuesta de neuritas es probado por el cultivo de explantes con la proteína-medio suplementado. Luego, para preguntar si las fuentes puntuales de ligandos secretados pueden tener efectos direccionales en neurite, los explantes son co-cultivadas con granos recubiertos de proteínas y ensayados para la capacidad de la cuenta para promover a nivel local o inhibir la extensión. También se incluye una demostración de la disección (protocolo modificado 7) y la cultura de E6 explantes de la médula espinal. Nosotrosutilizan de forma habitual explantes la médula espinal para confirmar la bioactividad de las proteínas y los granos remojados en proteínas, y para verificar las especies de reactividad cruzada con los tejidos de pollo, bajo la mismas condiciones de cultivo como explantes SAG. Estos ensayos in vitro son convenientes para la rápida detección de las moléculas que ejercen trófica (supervivencia) o el trópico (direccional) efectos sobre las neuronas de la SAG, especialmente antes de la realización de estudios in vivo. Además, este método permite el ensayo de las moléculas individuales en condiciones libres de suero, con una alta supervivencia de las neuronas 8.

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Demostramos cómo diseccionar y la cultura de pollo ganglio statoacoustic E4 y E6 explantes de la médula espinal. Los explantes se cultivaron en condiciones libres de suero en geles de colágeno en 3D durante 24 horas. La capacidad de respuesta neuritas se prueba con el factor de crecimiento medio suplementado y con recubrimiento de proteínas cuentas.

La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

dissection-culture-chick-statoacoustic-ganglion-spinal-cord-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K vistas.  Purdue University. Demostramos cómo diseccionar y la cultura de pollo ganglio statoacoustic E4 y E6 explantes de la médula espinal. Los explantes se cultivaron en condiciones libres de suero en geles de colágeno en 3D durante 24 horas. La capacidad de respuesta neuritas se prueba con el factor de crecimiento medio suplementado y con recubrimiento de proteínas cuentas.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Una unidad motora funcional en la placa de cultivo: Co-cultivo de explantes de la médula espinal y las células musculares

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embriones de pollo de la Médula Espinal Slice Cultura Protocolo

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...